猪丹毒杆菌抗体间接elisa检测方法的建立
本文研究以纯化的猪丹毒杆菌表面保护性抗原A（surface protein A, SpaA）融合蛋白建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。克隆猪丹毒杆菌SpaA基因，并将SpaA基因与pMD-19T质粒连接，对pET-28a和pMD-19T-SpaA质粒进行双酶切，将SpaA基因与原核表达载体pET-28a（+）连接，通过 PCR、双酶切鉴定后，将阳性重组质粒转化入受体菌BL21，经 IPTG 诱导表达。用镍柱亲和层析纯化蛋白，Western blot 鉴定表达产物。通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度，并对其它条件进行优化，最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接 ELISA 方法。结果表明最佳的抗原包被浓度为0.5 μg/mL；最佳的血清稀释度浓度为1﹕160；抗原最佳包被时间是37oC 1h＋4oC过夜；最佳重组蛋白封闭液是10%脱脂乳；最佳重组蛋白封闭时间是37oC 2h；最佳一抗作用时间是37oC 1h；最佳二抗作用浓度是120000，作用时间是37oC 1h。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 抗原蛋白的制备 2
1.2.1 SpaA基因PCR引物的设计与合成2
1.2.2 SpaA基因扩增2
1.2.3 SpaA基因连接2
1.2.4 重组pET28aSpaA融合蛋白的诱导表达及蛋白的纯化检测3
1.2.5 重组pET28aSpaA融合蛋白浓度的测定、稀释、封闭及保存3
1.3 猪丹毒阴阳性血清的筛选及鉴定3
1.3.1 猪丹毒阴阳性血清的筛选3
1.3.2 猪丹毒阳性血清的鉴定3
1.4 间接ELISA最佳反应条件的选择3
2 结果与分析 3
2.1 抗原蛋白的制备3
2.1.1 PCR扩增SpaA基因片段 4
2.1.2 pMD19TSpaA和pET28a质粒进行双酶切鉴定 4
2.1.3 菌液PCR 4
2.1.4 疑似阳转质粒双 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
酶切鉴定 5
2.1.5 重组pET28aSpaA融合蛋白的诱导表达 5
2.1.6 重组pET28aSpaA融合蛋白的大量诱导表达蛋白并纯化 6
2.2 猪丹毒阴阳性血清的筛选及鉴定 6
2.3 间接ELISA最佳反应条件的选择 7
2.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择 7
2.3.2 重组蛋白包被时间筛选 7
2.3.3 重组蛋白封闭液筛选 7
2.3.4 重组蛋白封闭时间筛选 7
2.3.5 重组蛋白SpaA一抗作用时间筛选 7
2.3.6 重组蛋白SpaA二抗作用浓度筛选 8
2.3.7 重组蛋白SpaA二抗作用时间筛选 8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
猪丹毒杆菌间接ELISA检测方法的建立
引言
猪丹毒又叫“钻石皮肤病”或“红热病”，是由红斑丹毒丝菌引起的一种急性、热性传染病。临诊症状表现为急性败血症型、亚急性疹块型、慢性心内膜炎型[1]。该病呈世界性广泛分布，呈散发或流行性发生，给养猪业造成了巨大的经济损失，是影响欧洲、亚洲、澳洲和美洲大陆经济的一种重要疾病[2]。
本病一年四季均可发生，炎热多雨季节多发，雨水冲刷土壤使土壤中的猪丹毒杆菌有机会扩大传染。吸血昆虫作为传播媒介，助长猪丹毒杆菌的传播，当猪体抵抗力减弱、细菌毒力增强也常引起内源性感染发病[3]。近年来，随着 “高热病”和 “腹泻病”的肆虐，猪场防控的重点偏向了病毒病，忽略了猪丹毒的防疫[4]。然而，该病仍有“死灰复燃”的趋势，该病在不同规模的猪场时有发生，给猪场造成了较大的经济损失[5]。
猪丹毒杆菌的抗原构造至今尚不十分清楚，己知在细胞璧上有耐热的粘肽和糖肽等类物质，它们具有型特异性，是血清型分类的基础[6]。猪丹毒杆菌生产各种酶，如：神经氨酸酶和透明质酸酶，已被认为参与细菌的致病性[7]。至今已有许多研究认为表面保护性抗原A（surface protein A SpaA）蛋白对多种血清型的猪丹毒杆菌具有良好的免疫保护效果[8]。目前，国内外研究结果表明，SpaA 是红斑丹毒丝菌的主要交叉保护性抗原[9]。Western印迹和ELISA检测结果表明，纯化后的天然SpaA具有良好的免疫原性和抗原性，是具有保护功能的完全抗原[10]。同时，SpaA蛋白N端免疫保护区(Nterminal protective domain ofSpaA,SpaAN)可以作为预防猪丹毒的亚单位疫苗，但SpaA蛋白C端重复区域(Cterminal repeat region ofspaA,spaAC)致病作用及其致病机理尚未清楚。而SpaA通过其C端重复序列能够与枯草芽胞杆菌和肺炎链球菌等革兰阳性菌细胞壁的脂磷壁酸(LTA)结合，这暗示了LTASpaA复合物可能在红斑丹毒丝菌致病过程中发挥重要的作用[9]。Imada等用五个具有特异性和敏感性的重组SpaA蛋白建立ELISA从而开发一种可靠的血清学测试方法，达到对猪丹毒杆菌抗体的检测目的[11]。
至今已发现la、lb、2、324和N型共26个血清型，大约80%以上的猪源性分离株属1型(la和lb)和2型，20%左右的分离株构成一群非共同的血清型[6]。Dr.Wood等人已实验证明猪丹毒杆菌的免疫原性与血清型有关。White曾报道用1型或2型菌株制备的菌苗接种猪后，再用几种不同血清型的猪丹毒杆菌攻击，结果表明在免疫力上，对同型菌比异型菌坚强[12]。
目前用于猪群猪丹毒杆菌检测的方法有很多，已有凝集试验、补体结合试验、沉淀试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验以及PCR等多种方法用于猪丹毒的诊断，但目前还缺乏一种快速、简便的检测方法用于猪群免疫监测和猪丹毒流行病学调查[13]。由于SpaA良好的抗原性，本文研究以纯化的猪丹毒杆菌SpaA融合蛋白建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法以解决这一问题。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株、细胞及载体
猪丹毒杆菌1a型菌株、DH5α感受态细胞、BL21感受态细胞、pET28a质粒均由本实验室保存，pMD19T质粒购自宝生物工程 ( 大连) 有限公司。
1．1．2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶 BamH I和Xho I购自宝生物工程（大连）有限公司、DNA marker ( DS 2000、DS 5000) 购自宝生物工程 ( 大连) 有限公司、DNA 回收试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、PCR反应所用 2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒提取试剂盒购自Biomiga公司、Westernblot显色液购自Biouniquer公司、葡萄球菌蛋白HPRSPA购自武汉博士德生物工程有限公司、ECL发光试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 抗原蛋白的制备
1．2．1 SpaA基因?PCR引物的设计与合成
根据GenBank中收录的猪丹毒SpaA完整的基因序列，用生物软件Premier Primer5.0设计1对特异性引物，上游引物中引入的酶切位点为BamH I，下游引物中引入的酶切位点为Xho I。经计算机处理及筛选，确定引物为：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 抗原蛋白的制备 2
1.2.1 SpaA基因PCR引物的设计与合成2
1.2.2 SpaA基因扩增2
1.2.3 SpaA基因连接2
1.2.4 重组pET28aSpaA融合蛋白的诱导表达及蛋白的纯化检测3
1.2.5 重组pET28aSpaA融合蛋白浓度的测定、稀释、封闭及保存3
1.3 猪丹毒阴阳性血清的筛选及鉴定3
1.3.1 猪丹毒阴阳性血清的筛选3
1.3.2 猪丹毒阳性血清的鉴定3
1.4 间接ELISA最佳反应条件的选择3
2 结果与分析 3
2.1 抗原蛋白的制备3
2.1.1 PCR扩增SpaA基因片段 4
2.1.2 pMD19TSpaA和pET28a质粒进行双酶切鉴定 4
2.1.3 菌液PCR 4
2.1.4 疑似阳转质粒双 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
酶切鉴定 5
2.1.5 重组pET28aSpaA融合蛋白的诱导表达 5
2.1.6 重组pET28aSpaA融合蛋白的大量诱导表达蛋白并纯化 6
2.2 猪丹毒阴阳性血清的筛选及鉴定 6
2.3 间接ELISA最佳反应条件的选择 7
2.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择 7
2.3.2 重组蛋白包被时间筛选 7
2.3.3 重组蛋白封闭液筛选 7
2.3.4 重组蛋白封闭时间筛选 7
2.3.5 重组蛋白SpaA一抗作用时间筛选 7
2.3.6 重组蛋白SpaA二抗作用浓度筛选 8
2.3.7 重组蛋白SpaA二抗作用时间筛选 8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
猪丹毒杆菌间接ELISA检测方法的建立
引言
猪丹毒又叫“钻石皮肤病”或“红热病”，是由红斑丹毒丝菌引起的一种急性、热性传染病。临诊症状表现为急性败血症型、亚急性疹块型、慢性心内膜炎型[1]。该病呈世界性广泛分布，呈散发或流行性发生，给养猪业造成了巨大的经济损失，是影响欧洲、亚洲、澳洲和美洲大陆经济的一种重要疾病[2]。
本病一年四季均可发生，炎热多雨季节多发，雨水冲刷土壤使土壤中的猪丹毒杆菌有机会扩大传染。吸血昆虫作为传播媒介，助长猪丹毒杆菌的传播，当猪体抵抗力减弱、细菌毒力增强也常引起内源性感染发病[3]。近年来，随着 “高热病”和 “腹泻病”的肆虐，猪场防控的重点偏向了病毒病，忽略了猪丹毒的防疫[4]。然而，该病仍有“死灰复燃”的趋势，该病在不同规模的猪场时有发生，给猪场造成了较大的经济损失[5]。
猪丹毒杆菌的抗原构造至今尚不十分清楚，己知在细胞璧上有耐热的粘肽和糖肽等类物质，它们具有型特异性，是血清型分类的基础[6]。猪丹毒杆菌生产各种酶，如：神经氨酸酶和透明质酸酶，已被认为参与细菌的致病性[7]。至今已有许多研究认为表面保护性抗原A（surface protein A SpaA）蛋白对多种血清型的猪丹毒杆菌具有良好的免疫保护效果[8]。目前，国内外研究结果表明，SpaA 是红斑丹毒丝菌的主要交叉保护性抗原[9]。Western印迹和ELISA检测结果表明，纯化后的天然SpaA具有良好的免疫原性和抗原性，是具有保护功能的完全抗原[10]。同时，SpaA蛋白N端免疫保护区(Nterminal protective domain ofSpaA,SpaAN)可以作为预防猪丹毒的亚单位疫苗，但SpaA蛋白C端重复区域(Cterminal repeat region ofspaA,spaAC)致病作用及其致病机理尚未清楚。而SpaA通过其C端重复序列能够与枯草芽胞杆菌和肺炎链球菌等革兰阳性菌细胞壁的脂磷壁酸(LTA)结合，这暗示了LTASpaA复合物可能在红斑丹毒丝菌致病过程中发挥重要的作用[9]。Imada等用五个具有特异性和敏感性的重组SpaA蛋白建立ELISA从而开发一种可靠的血清学测试方法，达到对猪丹毒杆菌抗体的检测目的[11]。
至今已发现la、lb、2、324和N型共26个血清型，大约80%以上的猪源性分离株属1型(la和lb)和2型，20%左右的分离株构成一群非共同的血清型[6]。Dr.Wood等人已实验证明猪丹毒杆菌的免疫原性与血清型有关。White曾报道用1型或2型菌株制备的菌苗接种猪后，再用几种不同血清型的猪丹毒杆菌攻击，结果表明在免疫力上，对同型菌比异型菌坚强[12]。
目前用于猪群猪丹毒杆菌检测的方法有很多，已有凝集试验、补体结合试验、沉淀试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验以及PCR等多种方法用于猪丹毒的诊断，但目前还缺乏一种快速、简便的检测方法用于猪群免疫监测和猪丹毒流行病学调查[13]。由于SpaA良好的抗原性，本文研究以纯化的猪丹毒杆菌SpaA融合蛋白建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法以解决这一问题。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株、细胞及载体
猪丹毒杆菌1a型菌株、DH5α感受态细胞、BL21感受态细胞、pET28a质粒均由本实验室保存，pMD19T质粒购自宝生物工程 ( 大连) 有限公司。
1．1．2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶 BamH I和Xho I购自宝生物工程（大连）有限公司、DNA marker ( DS 2000、DS 5000) 购自宝生物工程 ( 大连) 有限公司、DNA 回收试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、PCR反应所用 2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒提取试剂盒购自Biomiga公司、Westernblot显色液购自Biouniquer公司、葡萄球菌蛋白HPRSPA购自武汉博士德生物工程有限公司、ECL发光试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 抗原蛋白的制备
1．2．1 SpaA基因?PCR引物的设计与合成
根据GenBank中收录的猪丹毒SpaA完整的基因序列，用生物软件Premier Primer5.0设计1对特异性引物，上游引物中引入的酶切位点为BamH I，下游引物中引入的酶切位点为Xho I。经计算机处理及筛选，确定引物为：
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