不同激素水平及小鼠周龄和品系对超排效果的影响
超数排卵是获取胚胎工程研究中所必需的大量卵母细胞或早期胚胎的有效途径之一。为了探究不同激素水平、不同周龄和品系对小鼠超数排卵的影响，并获得最优的超排方案，本文通过给不同周龄和不同品系的小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）对其超排效果进行了研究。结果表明（1）10 IU的（PMSG+hCG）激素剂量组合超排效果优于5 IU的（PMSG+hCG）的，差异显著（P＜0.05）；（2）4周龄小鼠超排效果最好，且较6周龄与8周龄小鼠的超排差异均显著（P＜0.05），而6周龄与8周龄小鼠的超排差异不显著（P＞0.05）；（3）相同激素剂量时，C57BL/6J品系和B6N品系的超排效果优于ICR品系、FVB 品系和NOD/LTJ品系（P＜0.05）。综合地考虑激素水平、周龄和品系对小鼠超数排卵的影响，得出结论采用5 IU的（PMSG+hCG）激素剂量组合对4周龄的C57BL/6J、B6N品系进行处理的超排效果相对较好。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1 实验动物 2
1.2 试验试剂 2
1.3 试验仪器和用品 2
1.4 方法2
1.4.1 小鼠分组 2
1.4.2 试验方案3
1.4.3 试验方法3
1.4.4数据统计4
2 结果与分析4
2.1 130组获得的胚胎数4
2.2 不同激素水平对小鼠超排效果的影响4
2.3 不同周龄对小鼠超排效果的影响4
2.4 不同品系对小鼠超排效果的影响5
3 讨论 5
3.1不同激素水平对小鼠超排效果的影响 5
3.2 不同周龄对小鼠超排效果的影响6
3.3 不同品系对小鼠超排效果的影响6
致谢6
参考文献7
不同激素水平及小鼠周龄和品系对超排效果的影响
引言
小鼠是现代生物医学中应用最为广泛的实验动物, 尤其是基因工程动物的大量开发和一些 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
特殊疾病动物模型的资源保存，使得小鼠卵母细胞和小鼠胚胎的需求量日趋增多。如果单纯依靠小鼠自然排卵来获取卵细胞或者小鼠胚胎,将会浪费人力、物力和时间，且最后效果不尽人意。而现在获取大量卵母细胞或早期胚胎最有效简单的途径就是使用超数排卵技术，也就是在雌性动物发情周期的一定时期，注入外源性激素，从而提高血液中促性腺激素浓度，降低发育卵泡的闭锁，增加早期卵泡发育到成熟卵泡的数量，使得雌性动物每次排卵数目增加［1］，简称 “超排 ”。有研究发现促性腺继续有刺激大、小鼠排卵的作用［2］，后又发现了孕马血清也可使未成熟大鼠超数排卵，这为超排技术奠定了基础。
目前国内外均有报道有关小鼠超数排卵的研究，比如Kanter等［3］通过使用 GnRH激动剂来增加小鼠的排卵数量，取得很好的效果；戴丽军等［4］对各品系小鼠超排的激素剂量和注射间隔时间进行比较，发现最佳激素剂量为5 IU（ PMSG + hCG），最适合的注射间隔 46~48 h为宜；高善颂等［5］将小鼠分为2.5 IU（ PMSG + hCG）、5 IU（ PMSG + hCG）、7.5 IU（ PMSG + hCG）、10 IU（ PMSG + hCG）4个剂量组进行超排效果比较，得出小鼠的最佳超排剂量；Onadera M 等[6]的研究表明, 小鼠卵母细胞的发育与年龄有关, 自然排卵时，同一品系小鼠不同日龄间的差异不显著。纵观这些研究均获得了比较明确的结果，可是关于不同激素水平对不同日龄和品系小鼠的超排效果是否有影响，尚不清楚。所以本实验力求保持其他可能影响因素一致的情况下，就激素剂量、小鼠品系和周龄三个因素对其超排效果的影响进行比较，望能进一步完善超排方案，旨在为医药生物和胚胎技术等科学研究提供有价值的数据参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物
小鼠均由南京大学—南京生物医药研究院提供，清洁级饲养，日光照12 h，噪音≤60 dB，相对湿度40％~70%，换气量10~20次/h,室温26 ℃。
选用4周龄C57BL/6J、B6N、ICR、FVB、NOD/LTJ雌性小鼠（平均体重在1316g），6周龄C57BL/6J、B6N、ICR、FVB、NOD/LTJ雌性小鼠（平均体重在2325g）和8周龄C57BL/6J、B6N、ICR、FVB、NOD/LTJ雌性小鼠（平均体重在2832g）；10周龄~12周龄之间的各品系雄鼠经成功配繁一周，检验后用于试验。
1.2 试验试剂
人绒毛膜促性腺激素（hCG）(宁波三生药业有限公司)；孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波三生药业有限公司）；LGlutathione reduced（Sigma G4251）；矿物油（Sigma M5310）； HTF (使用Sigma试剂自配)；cTYH (使用Sigma试剂自配)
1.3 试验仪器和用品
35 mm培养皿（精子皿Nunclon Surface 153066；授精皿Corning Incorporated 430165)；37 ℃、5% CO2培养箱（上海力创科学仪器有限公司）；手术器械(手术剪，解剖剪,眼科镊,显微镊,)；1 mL注射器（上海康德莱企业发展集团有限公司）；滤纸；体视显微镜（麦克奥迪）；超净工作台（苏净安泰，SWCJIBU）；移液器，枪头（Axygen，1 mL、200 uL和10 uL）；恒温电热板（定制）；移卵针（BJ40细玻管外直径4×100 mm，定制）。
1.4 方法
1.4.1小鼠分组 将雄鼠分笼单放饲养，防止雄鼠打架撕咬，影响精子质量。所有雌鼠按品系周龄差异分为30组：
第1组:4周龄C57BL/6J小鼠5只; 第2组：6周龄C57BL/6J小鼠5只; 第3组：8周龄C57BL/6J小鼠5只; 第4组：4 周龄B6N小鼠5只; 第5组：6周龄B6N小鼠5只; 第6组：8周龄B6N小鼠5只; 第7组：4周龄ICR小鼠5只; 第8组：6周龄ICR小鼠5只;第9组：8周龄ICR小鼠5只; 第10组：4周龄FVB小鼠5只; 第11组：6周龄FVB小鼠5只; 第12组：8周龄FVB小鼠5只; 第13组：4周龄NOD/LTJ小鼠5只; 第14组：6周龄NOD/LTJ小鼠5只; 第15组：8周龄NOD/LTJ小鼠5只;第16~30组分组方法及数量与前15组相同。
1.4.2试验方案 以上每个试验组分别进行腹腔注射PMSG，46~48 h后每组分别注射hCG，采集卵盘，并加入相应品系雄鼠的精子，24 h后回收胚胎并计数，因不考虑受精率问题，只计算所有胚胎总数（包括1cell、2cell和异形胚胎，其中1cell包含了受精卵和未受精的卵子）。
1.4.3试验方法 1）激素的配制：PMSG,取1瓶PMSG（1000IU）冻干粉溶于5 mL 0.9%NaCl无菌生理盐水中，将其以275 uL/管分装于1.5 mL EP管中，再将每管中加入825 uL 0.9%NaCl无菌生理盐水稀释，稀释成浓度为50 IU/mL; Hcg,取1瓶hCG（1000 IU）冻干粉溶于1 mL 0.9%NaCl无菌生理盐水中，将其以55 uL/管分装于1.5 mL EP管中，再将每管中加入1045 uL 0.9%NaCl无菌生理盐水稀释，稀释成浓度为50IU/ml。将配制好的激素溶液分装EP管并做相应的标记（操作时注意避光）于－20℃保存，一个月内使用。
2）小鼠超排：第一天下午17：00~17：30供体鼠第1~15组腹腔注射PMSG（5 IU/只），第三天下午17：30再腹腔注射hCG（5 IU/只）。同时，第一天下午17：00~17：30供体鼠第16~30组腹腔注射PMSG（10 IU/只），第三天下午17：30腹腔注射HCG（10 IU/只）。具体操作：将小鼠放在小鼠笼网格栏上，先用左手手背压住小鼠背部，小指无名指夹住尾部，再以拇指及食指抓住两耳和头颈部的皮肤，固定小鼠，头位向下，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部。腹部用酒精棉球擦拭消毒，右手持一次性注射器 ，进针点在小鼠右后肢到腹中线区域。针头与腹部呈30°夹角进针刺破皮肤，沿皮下向前推进约 0.5 厘米，再使针头穿过腹肌刺入腹腔，针头进入1/2即可。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入PMSG（或hCG）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1 实验动物 2
1.2 试验试剂 2
1.3 试验仪器和用品 2
1.4 方法2
1.4.1 小鼠分组 2
1.4.2 试验方案3
1.4.3 试验方法3
1.4.4数据统计4
2 结果与分析4
2.1 130组获得的胚胎数4
2.2 不同激素水平对小鼠超排效果的影响4
2.3 不同周龄对小鼠超排效果的影响4
2.4 不同品系对小鼠超排效果的影响5
3 讨论 5
3.1不同激素水平对小鼠超排效果的影响 5
3.2 不同周龄对小鼠超排效果的影响6
3.3 不同品系对小鼠超排效果的影响6
致谢6
参考文献7
不同激素水平及小鼠周龄和品系对超排效果的影响
引言
小鼠是现代生物医学中应用最为广泛的实验动物, 尤其是基因工程动物的大量开发和一些 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
特殊疾病动物模型的资源保存，使得小鼠卵母细胞和小鼠胚胎的需求量日趋增多。如果单纯依靠小鼠自然排卵来获取卵细胞或者小鼠胚胎,将会浪费人力、物力和时间，且最后效果不尽人意。而现在获取大量卵母细胞或早期胚胎最有效简单的途径就是使用超数排卵技术，也就是在雌性动物发情周期的一定时期，注入外源性激素，从而提高血液中促性腺激素浓度，降低发育卵泡的闭锁，增加早期卵泡发育到成熟卵泡的数量，使得雌性动物每次排卵数目增加［1］，简称 “超排 ”。有研究发现促性腺继续有刺激大、小鼠排卵的作用［2］，后又发现了孕马血清也可使未成熟大鼠超数排卵，这为超排技术奠定了基础。
目前国内外均有报道有关小鼠超数排卵的研究，比如Kanter等［3］通过使用 GnRH激动剂来增加小鼠的排卵数量，取得很好的效果；戴丽军等［4］对各品系小鼠超排的激素剂量和注射间隔时间进行比较，发现最佳激素剂量为5 IU（ PMSG + hCG），最适合的注射间隔 46~48 h为宜；高善颂等［5］将小鼠分为2.5 IU（ PMSG + hCG）、5 IU（ PMSG + hCG）、7.5 IU（ PMSG + hCG）、10 IU（ PMSG + hCG）4个剂量组进行超排效果比较，得出小鼠的最佳超排剂量；Onadera M 等[6]的研究表明, 小鼠卵母细胞的发育与年龄有关, 自然排卵时，同一品系小鼠不同日龄间的差异不显著。纵观这些研究均获得了比较明确的结果，可是关于不同激素水平对不同日龄和品系小鼠的超排效果是否有影响，尚不清楚。所以本实验力求保持其他可能影响因素一致的情况下，就激素剂量、小鼠品系和周龄三个因素对其超排效果的影响进行比较，望能进一步完善超排方案，旨在为医药生物和胚胎技术等科学研究提供有价值的数据参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物
小鼠均由南京大学—南京生物医药研究院提供，清洁级饲养，日光照12 h，噪音≤60 dB，相对湿度40％~70%，换气量10~20次/h,室温26 ℃。
选用4周龄C57BL/6J、B6N、ICR、FVB、NOD/LTJ雌性小鼠（平均体重在1316g），6周龄C57BL/6J、B6N、ICR、FVB、NOD/LTJ雌性小鼠（平均体重在2325g）和8周龄C57BL/6J、B6N、ICR、FVB、NOD/LTJ雌性小鼠（平均体重在2832g）；10周龄~12周龄之间的各品系雄鼠经成功配繁一周，检验后用于试验。
1.2 试验试剂
人绒毛膜促性腺激素（hCG）(宁波三生药业有限公司)；孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波三生药业有限公司）；LGlutathione reduced（Sigma G4251）；矿物油（Sigma M5310）； HTF (使用Sigma试剂自配)；cTYH (使用Sigma试剂自配)
1.3 试验仪器和用品
35 mm培养皿（精子皿Nunclon Surface 153066；授精皿Corning Incorporated 430165)；37 ℃、5% CO2培养箱（上海力创科学仪器有限公司）；手术器械(手术剪，解剖剪,眼科镊,显微镊,)；1 mL注射器（上海康德莱企业发展集团有限公司）；滤纸；体视显微镜（麦克奥迪）；超净工作台（苏净安泰，SWCJIBU）；移液器，枪头（Axygen，1 mL、200 uL和10 uL）；恒温电热板（定制）；移卵针（BJ40细玻管外直径4×100 mm，定制）。
1.4 方法
1.4.1小鼠分组 将雄鼠分笼单放饲养，防止雄鼠打架撕咬，影响精子质量。所有雌鼠按品系周龄差异分为30组：
第1组:4周龄C57BL/6J小鼠5只; 第2组：6周龄C57BL/6J小鼠5只; 第3组：8周龄C57BL/6J小鼠5只; 第4组：4 周龄B6N小鼠5只; 第5组：6周龄B6N小鼠5只; 第6组：8周龄B6N小鼠5只; 第7组：4周龄ICR小鼠5只; 第8组：6周龄ICR小鼠5只;第9组：8周龄ICR小鼠5只; 第10组：4周龄FVB小鼠5只; 第11组：6周龄FVB小鼠5只; 第12组：8周龄FVB小鼠5只; 第13组：4周龄NOD/LTJ小鼠5只; 第14组：6周龄NOD/LTJ小鼠5只; 第15组：8周龄NOD/LTJ小鼠5只;第16~30组分组方法及数量与前15组相同。
1.4.2试验方案 以上每个试验组分别进行腹腔注射PMSG，46~48 h后每组分别注射hCG，采集卵盘，并加入相应品系雄鼠的精子，24 h后回收胚胎并计数，因不考虑受精率问题，只计算所有胚胎总数（包括1cell、2cell和异形胚胎，其中1cell包含了受精卵和未受精的卵子）。
1.4.3试验方法 1）激素的配制：PMSG,取1瓶PMSG（1000IU）冻干粉溶于5 mL 0.9%NaCl无菌生理盐水中，将其以275 uL/管分装于1.5 mL EP管中，再将每管中加入825 uL 0.9%NaCl无菌生理盐水稀释，稀释成浓度为50 IU/mL; Hcg,取1瓶hCG（1000 IU）冻干粉溶于1 mL 0.9%NaCl无菌生理盐水中，将其以55 uL/管分装于1.5 mL EP管中，再将每管中加入1045 uL 0.9%NaCl无菌生理盐水稀释，稀释成浓度为50IU/ml。将配制好的激素溶液分装EP管并做相应的标记（操作时注意避光）于－20℃保存，一个月内使用。
2）小鼠超排：第一天下午17：00~17：30供体鼠第1~15组腹腔注射PMSG（5 IU/只），第三天下午17：30再腹腔注射hCG（5 IU/只）。同时，第一天下午17：00~17：30供体鼠第16~30组腹腔注射PMSG（10 IU/只），第三天下午17：30腹腔注射HCG（10 IU/只）。具体操作：将小鼠放在小鼠笼网格栏上，先用左手手背压住小鼠背部，小指无名指夹住尾部，再以拇指及食指抓住两耳和头颈部的皮肤，固定小鼠，头位向下，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部。腹部用酒精棉球擦拭消毒，右手持一次性注射器 ，进针点在小鼠右后肢到腹中线区域。针头与腹部呈30°夹角进针刺破皮肤，沿皮下向前推进约 0.5 厘米，再使针头穿过腹肌刺入腹腔，针头进入1/2即可。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入PMSG（或hCG）。
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