six1基因在不同猪源细胞中的表达谱鉴定
1Six1基因是一个非常重要的转录调控因子，在猪骨骼肌中具有高丰度的表达，表明其在肌肉的生长发生发育中发挥着重要的调控作用。骨骼肌是一个非常重要的组织器官，其生长发育与猪的生长速度及屠宰后肉品的质量有着密切的联系。因此，Six1基因是一个影响猪生长发育及肌肉品质的重要候选基因。尽管如此，但Six1基因在不同猪源细胞中的表达模式仍不清楚，比较分析Six1基因在不同猪源细胞中的表达模式，为进一步阐明Six1基因的生物学功能有着重要的意义。本研究共培养了4种猪源细胞，包括3种猪原细胞（猪肌卫星细胞、猪成纤维细胞与猪脂肪前体细胞），以及1种猪细胞系（猪肾细胞），并进一步利用Real-time PCR 技术对该基因在不同猪源细胞中的表达谱进行鉴定。研究结果显示，Six1在猪肌卫星细胞与脂肪前体细胞中具有相对高丰度的表达，其表达水平显著高于猪肾细胞（P<0.01）与猪成纤维细胞(P<0.01）。而Six1在成纤维细胞中的表达水平最低，其表达量也显著低表猪肾细胞(P<0.01）。本研究的结果可为深入开展猪Six1基因的转录表达调控机制奠定基础，并为其今后作为影响猪生长发育及肌肉品质的候选基因的开发利用提供理论基础。
目录
引言
Six1基因是重要的生长发育调控基因，有研究表明，Six1基因在肌纤维类型的转变中发挥着特别重要的作用[1]。骨骼肌组织是猪机体最主要的组成部分，可占猪胴体重的40%以上。因此，骨骼肌组织的生长发育与猪生长速度有着紧密的联系。肌纤维作为肌肉组织的主要成分，其类型的差异是影响猪肌肉品质的重要因素之一，对于我国养殖数量较多的猪而言，骨骼肌是肉类的主要成分，骨骼肌的主要组成部分是肌纤维，肌纤维类型的差异是影响肌肉品质的重要因素，阐明肌纤维类型形成的机制，将有利于揭示肌肉品质形成的分子机制。因此而言，慢型纤维比例高的猪肉具有相对好的肉质特性。因此，Six1基因是一个影响猪生长与肉质性状的重要候选基因。
Six1基因是Six蛋白家族中的一个，Six蛋白家族是Homeobox超家族的一员。这些蛋白的共同点是都有保守的183个核苷酸序列，并且可以编码61个氨基酸的同源结构域，这些同源结构域可以和特异的DNA序列结合，进一步激活或者抑制某些基因的转录，从而来调控机体的发育生长。Six家族包括Six1/Six2、Six3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
/Six6、Six4/Six5亚族[2]，具有高度保守的同源结构域的N端和Six结构域组成的复合结构是Six1基因调控的蛋白产物。Six1基因通过和特定结构结合来调控基因表达，在肌肉形成和发育过程中起重要作用[3]，是细胞增殖和组织发育所必需的，对中枢神经系统和肾、肌肉等多种组织形成至关重要[4,5,6]。有研究结果证实Six1基因可以通过促进Cyclin蛋白（AL和DL）和Myc蛋白的表达促进细胞增殖[7]。有学者分析认为Six1基因对细胞周期起活化调节作用，在细胞增殖、分化过程中有促进作用[8,9]。Six1蛋白在肌肉形成过程中可以和肌肉细胞生成有关的启动子元件结合，调控活化肌肉决定因子[10]。有研究证实如果敲除Six1基因的小鼠会出现骨骼发育不良，脏器发育不良，身体大部分肌肉发育不良，甚至会因为严重畸形而死亡[11]。Six1基因对于肌纤维形成有重要影响，有研究表明，Six1基因对斑马鱼快肌形成起重要作用，对于活化肌形成因子比较重要[12,13]。
猪肉在我国肉类消费品中占比重较大，而且现在消费者对猪肉品质要求越来越高。许多消费者更青睐低脂肪低纤维的猪肉，许多养殖企业为了迎合消费者对猪肉品质的喜好，采用更多的技术手段改变猪肉品质，满足消费者的同时期望企业能得到更好的发展。Six1基因对肌肉生长发育起重要作用，通过研究采用相关的技术手段改变Six1基因对猪肌肉细胞的调控，得到我们想要的肉质。如何科学有效地保存和利用这一候选基因，并选择和培育出具有较好肉质性状的品种成为大家共同努力的目标。
Six1基因通过组织、血液系统等多种方式调节癌细胞启动、增殖和转移，在肿瘤的发生中起重要作用[14]。Six1基因与癌症的发生也有密切联系。癌症的发生是因为正常组织细胞发生改变，恶化成为癌细胞，进而没有节制的分裂，并且分裂速度比正常细胞分裂速度快好多倍。而Six1基因对细胞增殖和分化起关键作用。现在生活的快节奏，以及大环境的恶化，比如空气质量差（pM2.5、雾霾天气）、水质污染、食品安全问题等，无不影响人们的身体健康。癌症的发生也越来越普遍，对人体威胁越来越严重。如果能掌握Six1基因在细胞增值分化中的调控机制，那么可以通过医学技术对癌细胞的增殖干扰或者杀死癌细胞，防止癌症的发生，从而造福人类。
对于同一个猪只个体，其Six1基因序列是完全一样的，那么Six1基因在不同的组织中为什么存在如此大的表达差异，Six1基因在不同猪源细胞中的表达调控机制还不清楚，其表达机理不明确。所以，本研究采用Realtime PCR 技术首先对Six1基因在猪肾细胞、猪成纤维细胞、脂肪前体细胞、猪肌卫星细胞中的表达水平进行检测，确定其在不同猪源细胞中的表达模式，为深入开展Six1基因在不同细胞中的表达调控机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验样品
实验所保存的猪肾细胞系（PK15）、实验室所分离的猪原代细胞（猪成纤维细胞、脂肪前体细胞、猪肌卫星细胞）。
1．1．2 仪器与设备
超净工作台；PCR仪；恒温水浴箱；电泳凝胶成像系统；琼脂糖凝胶电泳装置；电泳仪；水平电泳槽；烧杯；保鲜膜；封口膜；浮漂；微波炉；小型旋转器；电冰箱（20℃，4℃）；恒温水浴锅；可调式微量移液器；千分之一电子天平；高压消毒锅；摇床；德国eppendorf冷冻离心机；StepOnePlus? 实时荧光定量PCR仪;迷你离心机；微孔板迷你离心机；电热恒温鼓风干燥箱。
1．1．3 试剂与耗材
枪头（20 μl、200 μl）及离心管(1.5 ml、15ml、50ml)；移液管；容器盒； Trizol Reagent；FBS；PBS；DMEM高糖培养基；氯仿；异丙醇；无水乙醇；DEPC水； TE缓冲液；75%乙醇；rTaqDNA聚合酶mix（5 U/μl）；灭菌蒸馏水；琼脂糖；1×TBE硼酸缓冲液；核酸染料Godview。
1．2 实验方法
1. 2. 1 猪肾细胞、猪成纤维细胞、脂肪前体细胞、猪肌卫星细胞的培养
细胞复苏时分别将四种猪源细胞从液氮罐取出立即放入37℃水浴锅中快速解冻，然后转移至离心管中用1000 rpm离心5min收集细胞。
去上清培养液，加入适量10%FBS培养液，并将细胞转入T25培养瓶中培养。
等细胞长满瓶底后，将细胞消化稀释接种至6孔板中，每孔接种2ml，接种密度为12×105个/ml，每种细胞接种3孔。置细胞培养箱37℃，5% CO2饱和湿度条件下培养。
培养48h后收集细胞。
2. 2总RNA的提取
在收集细胞前，用PBS洗两遍，然后按1ml/孔Trizol Reagent进行细胞的裂解，此时裂解的细胞可放80℃冻存或直接进行总RNA的提取。
加入0.2ml氯仿（乳白色），剧烈振荡15s，室温静止23min（分层）。
4℃，14000rpm离心15min，分层，下层红色有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于上层水相。
将上清水相转移至另一1.5ml离心管。
加入等体积预冷异丙醇，混匀，轻轻颠倒几次，室温放置510min。
4℃ 14000rpm离心15min，弃上清，RNA沉淀在管底，呈凝胶状。
加入1ml 75%乙醇轻轻混匀悬浮沉淀并且静置5 min。
4℃，12000rpm离心15min，尽量弃上清。
重复（7）和（8），用移液枪将残余的液体去除，室温干燥数分钟（时间不能太长，太长沉淀会过分干燥，难溶解）。
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引言
Six1基因是重要的生长发育调控基因，有研究表明，Six1基因在肌纤维类型的转变中发挥着特别重要的作用[1]。骨骼肌组织是猪机体最主要的组成部分，可占猪胴体重的40%以上。因此，骨骼肌组织的生长发育与猪生长速度有着紧密的联系。肌纤维作为肌肉组织的主要成分，其类型的差异是影响猪肌肉品质的重要因素之一，对于我国养殖数量较多的猪而言，骨骼肌是肉类的主要成分，骨骼肌的主要组成部分是肌纤维，肌纤维类型的差异是影响肌肉品质的重要因素，阐明肌纤维类型形成的机制，将有利于揭示肌肉品质形成的分子机制。因此而言，慢型纤维比例高的猪肉具有相对好的肉质特性。因此，Six1基因是一个影响猪生长与肉质性状的重要候选基因。
Six1基因是Six蛋白家族中的一个，Six蛋白家族是Homeobox超家族的一员。这些蛋白的共同点是都有保守的183个核苷酸序列，并且可以编码61个氨基酸的同源结构域，这些同源结构域可以和特异的DNA序列结合，进一步激活或者抑制某些基因的转录，从而来调控机体的发育生长。Six家族包括Six1/Six2、Six3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
/Six6、Six4/Six5亚族[2]，具有高度保守的同源结构域的N端和Six结构域组成的复合结构是Six1基因调控的蛋白产物。Six1基因通过和特定结构结合来调控基因表达，在肌肉形成和发育过程中起重要作用[3]，是细胞增殖和组织发育所必需的，对中枢神经系统和肾、肌肉等多种组织形成至关重要[4,5,6]。有研究结果证实Six1基因可以通过促进Cyclin蛋白（AL和DL）和Myc蛋白的表达促进细胞增殖[7]。有学者分析认为Six1基因对细胞周期起活化调节作用，在细胞增殖、分化过程中有促进作用[8,9]。Six1蛋白在肌肉形成过程中可以和肌肉细胞生成有关的启动子元件结合，调控活化肌肉决定因子[10]。有研究证实如果敲除Six1基因的小鼠会出现骨骼发育不良，脏器发育不良，身体大部分肌肉发育不良，甚至会因为严重畸形而死亡[11]。Six1基因对于肌纤维形成有重要影响，有研究表明，Six1基因对斑马鱼快肌形成起重要作用，对于活化肌形成因子比较重要[12,13]。
猪肉在我国肉类消费品中占比重较大，而且现在消费者对猪肉品质要求越来越高。许多消费者更青睐低脂肪低纤维的猪肉，许多养殖企业为了迎合消费者对猪肉品质的喜好，采用更多的技术手段改变猪肉品质，满足消费者的同时期望企业能得到更好的发展。Six1基因对肌肉生长发育起重要作用，通过研究采用相关的技术手段改变Six1基因对猪肌肉细胞的调控，得到我们想要的肉质。如何科学有效地保存和利用这一候选基因，并选择和培育出具有较好肉质性状的品种成为大家共同努力的目标。
Six1基因通过组织、血液系统等多种方式调节癌细胞启动、增殖和转移，在肿瘤的发生中起重要作用[14]。Six1基因与癌症的发生也有密切联系。癌症的发生是因为正常组织细胞发生改变，恶化成为癌细胞，进而没有节制的分裂，并且分裂速度比正常细胞分裂速度快好多倍。而Six1基因对细胞增殖和分化起关键作用。现在生活的快节奏，以及大环境的恶化，比如空气质量差（pM2.5、雾霾天气）、水质污染、食品安全问题等，无不影响人们的身体健康。癌症的发生也越来越普遍，对人体威胁越来越严重。如果能掌握Six1基因在细胞增值分化中的调控机制，那么可以通过医学技术对癌细胞的增殖干扰或者杀死癌细胞，防止癌症的发生，从而造福人类。
对于同一个猪只个体，其Six1基因序列是完全一样的，那么Six1基因在不同的组织中为什么存在如此大的表达差异，Six1基因在不同猪源细胞中的表达调控机制还不清楚，其表达机理不明确。所以，本研究采用Realtime PCR 技术首先对Six1基因在猪肾细胞、猪成纤维细胞、脂肪前体细胞、猪肌卫星细胞中的表达水平进行检测，确定其在不同猪源细胞中的表达模式，为深入开展Six1基因在不同细胞中的表达调控机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验样品
实验所保存的猪肾细胞系（PK15）、实验室所分离的猪原代细胞（猪成纤维细胞、脂肪前体细胞、猪肌卫星细胞）。
1．1．2 仪器与设备
超净工作台；PCR仪；恒温水浴箱；电泳凝胶成像系统；琼脂糖凝胶电泳装置；电泳仪；水平电泳槽；烧杯；保鲜膜；封口膜；浮漂；微波炉；小型旋转器；电冰箱（20℃，4℃）；恒温水浴锅；可调式微量移液器；千分之一电子天平；高压消毒锅；摇床；德国eppendorf冷冻离心机；StepOnePlus? 实时荧光定量PCR仪;迷你离心机；微孔板迷你离心机；电热恒温鼓风干燥箱。
1．1．3 试剂与耗材
枪头（20 μl、200 μl）及离心管(1.5 ml、15ml、50ml)；移液管；容器盒； Trizol Reagent；FBS；PBS；DMEM高糖培养基；氯仿；异丙醇；无水乙醇；DEPC水； TE缓冲液；75%乙醇；rTaqDNA聚合酶mix（5 U/μl）；灭菌蒸馏水；琼脂糖；1×TBE硼酸缓冲液；核酸染料Godview。
1．2 实验方法
1. 2. 1 猪肾细胞、猪成纤维细胞、脂肪前体细胞、猪肌卫星细胞的培养
细胞复苏时分别将四种猪源细胞从液氮罐取出立即放入37℃水浴锅中快速解冻，然后转移至离心管中用1000 rpm离心5min收集细胞。
去上清培养液，加入适量10%FBS培养液，并将细胞转入T25培养瓶中培养。
等细胞长满瓶底后，将细胞消化稀释接种至6孔板中，每孔接种2ml，接种密度为12×105个/ml，每种细胞接种3孔。置细胞培养箱37℃，5% CO2饱和湿度条件下培养。
培养48h后收集细胞。
2. 2总RNA的提取
在收集细胞前，用PBS洗两遍，然后按1ml/孔Trizol Reagent进行细胞的裂解，此时裂解的细胞可放80℃冻存或直接进行总RNA的提取。
加入0.2ml氯仿（乳白色），剧烈振荡15s，室温静止23min（分层）。
4℃，14000rpm离心15min，分层，下层红色有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于上层水相。
将上清水相转移至另一1.5ml离心管。
加入等体积预冷异丙醇，混匀，轻轻颠倒几次，室温放置510min。
4℃ 14000rpm离心15min，弃上清，RNA沉淀在管底，呈凝胶状。
加入1ml 75%乙醇轻轻混匀悬浮沉淀并且静置5 min。
4℃，12000rpm离心15min，尽量弃上清。
重复（7）和（8），用移液枪将残余的液体去除，室温干燥数分钟（时间不能太长，太长沉淀会过分干燥，难溶解）。
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