猪圆环病毒2型双夹心elisa抗原检测方法的建立
摘要：我国养猪生产中猪圆环病毒2型的病例越来越多，严重影响我国养猪业的发展。因此，科学有效的预防诊断方法可以很好地防治猪圆环病毒2型临床感染，降低生产损失。目前猪圆环病毒2型实验室诊断方法如分离病毒、免疫荧光、免疫过氧化物酶单层试验、酶联免疫吸附测定和PCR等。具有较高的特异性和敏感性的的有免疫荧光和免疫过氧化物酶单层试验，然而由于其他因素限制，目前这两种方法尚未大范围应用。酶联免疫吸附实验由于简单、高效而被大量使用。当前，猪圆环病毒2型抗体检测酶联免疫吸附试剂盒已经在我国被广泛应用，而关于猪圆环病毒2型抗原诊断的酶联免疫吸附试剂盒则未见有上市，且相关研究较少。本课题通过制造猪圆环病毒2型单抗和兔抗血清，较好的创造了一种猪圆环病毒2型抗原检测双夹心酶联免疫吸附法，为临床上猪圆环病毒2型抗原检测提供了参考。
关键词：猪圆环病毒2型；抗原检测；双夹心ELISA
摘要： 1
关键词： 1
Abstract： 1
Keywords： 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1动物、毒株及试剂 2
1.2双夹心ELISA检测抗原方法的建立及优化 2
2 结果与分析 4
2.1最合适单克隆抗体、多克隆抗体的确定 4
2.2最合适单克隆抗体包被浓度、最合适多克隆抗体稀释度的确定 4
2.3 抗原稀释度、酶标抗体最合适浓度与显色时间的确定 5
2.4 最合适酶标抗体的确定 5
2.5 双夹心酶联免疫吸附测定临界值的确定 6
2.6重复性试验 6
2.7 临床样品的检测 7
3讨论 7
致谢 8
参考文献： 8
引言 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)起初是Tischer等研究猪肾细胞PK-15时偶然发现的[1]。之后通过实验检测到大部分猪群中都有这种病毒，但不致病。后来有研究者检测到猪圆环病毒能对猪的胚胎造成损害[2]，会引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)[3]。研究者从患断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪身体中分离出另一种变异的猪圆环病毒，由于它的各项体征和先前PK-15细胞中猪圆环病毒不一样，所以把而后检测到的命名为PCV2，以前检测到的猪圆环病毒命名为PCV1。
猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)自发生和流行以来已经严重影响了全世界养猪业的发展，获得该病科学有效的预防诊断方法显得特别重要。双夹心ELISA方法可以用于定性检测抗原和定量分析抗原感染量，具有很好的应用前景[4]。
本课题通过用腹水纯化法制作单克隆抗体、多克隆抗体，还采用方阵滴定法测出最合适单克隆抗体、单克隆抗体最合适包被浓度、多克隆抗体最合适稀释度、最合适抗原稀释度、最合适酶标抗体、最合适酶标抗体浓度、最合适显色时间，通过临床试验较好的创造了一种猪圆环病毒2型抗原检测双夹心酶联免疫吸附法，为临床上猪圆环病毒2型抗原检测提供了参考 [4,5]。
1 材料与方法
1．1 动物、毒株及试剂
6-8周龄雌性Balb/c小鼠、猪抗猪圆环病毒2型、兔抗猪圆环病毒2型、阳性检测样本和阴性检测样本均由江苏农科院兽医研究所保存。
ELISA所需主要溶液配制
(1)抗原包被缓冲液
磷酸盐缓冲液
(2)洗涤缓冲液（pbs）
来自上海彤云贸易商行
(3)Tween 20
来自南京鼎思生物技术有限公司
(4)脱脂奶粉
来自伊利集团
(5)单组分TMB显色液
来自湖州英创生物科技有限公司
(6)终止液(2M H2S04)
H2SO4（96%） 22.2ml
蒸馏水 177.8ml
1. 2双夹心ELISA检测抗原方法的建立及优化
1.2.1双夹心ELISA检测方法的程序
（1）包被单抗：用稀释的mAb100微升每孔包被酶标板，置37度温箱作用过夜;甩去板中的液体，用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（2）封闭：每个酶标板孔分别注入200微升2.5%脱脂奶粉，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（3）加待检抗原样品：每个酶标板孔分别注入1:10稀释的待检抗原样品，100微升/孔，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（4）加多克隆抗体：加入稀释的多克隆抗体，100微升/孔，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（5）加酶标抗体：每个酶标板孔分别注入100微升，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（6）加入底物显色液：每个酶标板孔分别注入1OO微升，放入37℃温箱里等显色10min；
（7）加终止液：每个酶标板孔分别2M H2S04 50微升，然后拿到连有用酶标仪的电脑上测定OD450值，观察实验结果。
按照上面步骤用方阵滴定法测出最合适反应条件。
1.2.2 最合适单克隆抗体、多克隆抗体的确定
用-70度保存的626、-20度保存的626、-20度保存的670以1比4000稀释分别包被2列酶标板，每种单克隆抗体包被的2列中1列加1比8000的旧多克隆抗体、1列加1比8000的新多克隆抗体，阳性和阴性用1比5稀释、酶标抗体用1比10000稀释，显色时间8分钟，其他条件同1.3.1。
关键词：猪圆环病毒2型；抗原检测；双夹心ELISA
摘要： 1
关键词： 1
Abstract： 1
Keywords： 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1动物、毒株及试剂 2
1.2双夹心ELISA检测抗原方法的建立及优化 2
2 结果与分析 4
2.1最合适单克隆抗体、多克隆抗体的确定 4
2.2最合适单克隆抗体包被浓度、最合适多克隆抗体稀释度的确定 4
2.3 抗原稀释度、酶标抗体最合适浓度与显色时间的确定 5
2.4 最合适酶标抗体的确定 5
2.5 双夹心酶联免疫吸附测定临界值的确定 6
2.6重复性试验 6
2.7 临床样品的检测 7
3讨论 7
致谢 8
参考文献： 8
引言 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)起初是Tischer等研究猪肾细胞PK-15时偶然发现的[1]。之后通过实验检测到大部分猪群中都有这种病毒，但不致病。后来有研究者检测到猪圆环病毒能对猪的胚胎造成损害[2]，会引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)[3]。研究者从患断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪身体中分离出另一种变异的猪圆环病毒，由于它的各项体征和先前PK-15细胞中猪圆环病毒不一样，所以把而后检测到的命名为PCV2，以前检测到的猪圆环病毒命名为PCV1。
猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)自发生和流行以来已经严重影响了全世界养猪业的发展，获得该病科学有效的预防诊断方法显得特别重要。双夹心ELISA方法可以用于定性检测抗原和定量分析抗原感染量，具有很好的应用前景[4]。
本课题通过用腹水纯化法制作单克隆抗体、多克隆抗体，还采用方阵滴定法测出最合适单克隆抗体、单克隆抗体最合适包被浓度、多克隆抗体最合适稀释度、最合适抗原稀释度、最合适酶标抗体、最合适酶标抗体浓度、最合适显色时间，通过临床试验较好的创造了一种猪圆环病毒2型抗原检测双夹心酶联免疫吸附法，为临床上猪圆环病毒2型抗原检测提供了参考 [4,5]。
1 材料与方法
1．1 动物、毒株及试剂
6-8周龄雌性Balb/c小鼠、猪抗猪圆环病毒2型、兔抗猪圆环病毒2型、阳性检测样本和阴性检测样本均由江苏农科院兽医研究所保存。
ELISA所需主要溶液配制
(1)抗原包被缓冲液
磷酸盐缓冲液
(2)洗涤缓冲液（pbs）
来自上海彤云贸易商行
(3)Tween 20
来自南京鼎思生物技术有限公司
(4)脱脂奶粉
来自伊利集团
(5)单组分TMB显色液
来自湖州英创生物科技有限公司
(6)终止液(2M H2S04)
H2SO4（96%） 22.2ml
蒸馏水 177.8ml
1. 2双夹心ELISA检测抗原方法的建立及优化
1.2.1双夹心ELISA检测方法的程序
（1）包被单抗：用稀释的mAb100微升每孔包被酶标板，置37度温箱作用过夜;甩去板中的液体，用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（2）封闭：每个酶标板孔分别注入200微升2.5%脱脂奶粉，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（3）加待检抗原样品：每个酶标板孔分别注入1:10稀释的待检抗原样品，100微升/孔，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（4）加多克隆抗体：加入稀释的多克隆抗体，100微升/孔，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（5）加酶标抗体：每个酶标板孔分别注入100微升，置37度孵育1h; 用磷酸盐吐温缓冲液洗板5min/次，洗4次，每次都拍干；
（6）加入底物显色液：每个酶标板孔分别注入1OO微升，放入37℃温箱里等显色10min；
（7）加终止液：每个酶标板孔分别2M H2S04 50微升，然后拿到连有用酶标仪的电脑上测定OD450值，观察实验结果。
按照上面步骤用方阵滴定法测出最合适反应条件。
1.2.2 最合适单克隆抗体、多克隆抗体的确定
用-70度保存的626、-20度保存的626、-20度保存的670以1比4000稀释分别包被2列酶标板，每种单克隆抗体包被的2列中1列加1比8000的旧多克隆抗体、1列加1比8000的新多克隆抗体，阳性和阴性用1比5稀释、酶标抗体用1比10000稀释，显色时间8分钟，其他条件同1.3.1。
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