猪SIgA分泌片的原核表达与分离纯化
猪SIgA分泌片的原核表达与分离纯化[20200507190131]
摘要：分泌片(secretory component，SC)是粘膜型IgA(sIgA)的组成部分，对于粘膜免疫具有重要作用。本实验应用已构建好的含有目的基因的工程菌(BL21)，在诱导剂(IPTG)作用下，诱到目的蛋白表达，分泌目的蛋白即分泌片。然后使用镍柱亲和层析纯化，对SC进行初步纯化，获得粗提物。粗提物经透析、浓缩处理后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。根据目的蛋白分子量大小，切割含有SC的凝胶，进行胶回收，获得纯净的蛋白提取物。最后，对获得的蛋白进行Western blot检测。结果表明，Western blot检测呈阳性。结合蛋白分子量和Western blot结果，我们判定获得的蛋白即为SC。本实验旨在分离纯化SC，为以后的深入研究奠定基础。
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关键字:SIgA分泌片；分离纯化；聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫印迹法
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1目的蛋白诱导表达3
1.2蛋白粗提取 4
1.3镍柱纯化蛋白4
1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳 4
1.5 透析4
1.6 浓缩4
1.7聚丙烯酰胺凝胶电泳4
1.8 铜染4
1.9 PAGE胶蛋白回收5
1.10 Western Blot6
2 结果与分析6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
猪SIgA分泌片的原核表达与分离纯化
引言
分泌型免疫球蛋白A（SIgA）是20世纪60年代初在外分泌液中发现的一种IgA抗体，存在于呼吸道、消化道、泌尿道等部位的分泌液及初乳中，以初乳含量最高，是黏膜免疫的主要抗体。SIgA分子是由2个IgA单体（每个单体含有2条轻链和2条重链）、1条J链和1条分泌片（secretory component，SC，为多聚免疫球蛋白受体的胞外裂解片段）构成的异源十聚体[1]，为了与血清IgA单体相区别而被命名为SIgA。研究表明，分泌型免疫球蛋白A是抵御病原体及有害物质的第一道免疫防线，是机体黏膜免疫的最重要的抗体[2-4]。
二聚体IgA（dIgA）或多聚体（pIgA）从浆细胞分泌出来后，在上皮细胞的嗜碱性侧与多聚免疫球蛋白受体（pIgR）以共价键形成dIgA-pIgR或pIGA-pIgR复合物，然后通过内吞作用和转运被运输到黏膜外侧，此后完整的SIgA分子通过pIGR分裂释放出来。
SC是上皮细胞上的pIgR的一部分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，pIgR为免疫球蛋白超家族成员。pIgR由上皮细胞产生，与pIgA特别是dIgA相结合，成为IgA聚合体的转运受体，是SIgA的重要组成部分。Fc介导了pIgA和pIgR的相互作用，pIgR细胞外部分包含5个与免疫球蛋白相似的功能域（D1-D5）。其中D1在与dIgA的Ca3功能域非共价结合过程中起了重要作用，D5与IgA的Ca2+共价结合使复合物分子更加稳定。正是SC的存在，使SIgA对蛋白酶的敏感性下降，粘液更加粘稠，增强了粘附作用及防御能力。在SIgA的运输过程中，pIgR的细胞外部分与分泌性抗体结合成为固定SC，即我们经常所指的SC，可抵抗蛋白酶的降解，从而起到稳定SIgA的作用。有些未与SIgA结合的pIgR分子也被转运到粘膜外侧，并通过水解与细胞脱离，形成游离的SC，与固定SC相似。SC是粘膜免疫系统的重要组分，参与SIgA形成和分泌[7]。
1 材料与方法
1.1 目的蛋白的诱导表达
1.1.1取6支高压过的试管，每支试管加5ml的含有重组质粒的大肠杆菌液和5μl 100mg/ml 氨苄青霉素(Amp+) ；
1.1.2将试管置于37℃摇床上，200rpm振荡培养，快速培养至OD630至0.6～0.8；
1.1.3取6个500ml的高压过的500ml生理盐水瓶，每个瓶子加250ml的LB培养基、250μl 100mg/ml Ampr、1mmol异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)；
1.1.4将生理盐水瓶放入37℃摇床，200rpm振荡培养5h。
1.2蛋白粗提取
1.2.1将菌液倒入50ml离心管中，离心（9000rpm 、4℃）10min；
1.2.2弃上清，pH7.4 PBS重悬洗涤，离心（9000 rpm 、4℃）10min，重复两次；
1.2.3向盛有沉淀的离心管中加4.5ml的Lew buffer，重悬沉淀；
1.2.4加入500μl 10 mg/ml溶菌酶(lysozyme)，冰浴振荡30min；
1.2.5超声破碎15min（工作时间3s，工作间隙5s）；
1.2.6离心，10000rpm ，4℃，10min，弃上清；
1.2.7向离心管中加入5ml lew buffer，重悬；
1.2.8同1.2.6；
1.2.9向离心管管中加5ml Denaturing Solubilization Buffer，超声破碎5min。
1.2.10冰浴振荡20min；
1.2.11离心，10000rpm ，20℃，10min，取上清，弃 沉淀。
1.3镍柱纯化蛋白
柱平衡：向柱中加入50床柱体积(50ml)Denaturing Solubilization Buffer，Buffer自然流淌；
结合：将含有包涵体的上清加入柱中，上清自然流淌；
洗涤：用80床柱体积(80ml)的Denaturing Solubilization Buffer洗涤，Buffer自然流淌；
洗脱：用50ml Denaturing Elution Buffer洗脱蛋白，EP管收集洗脱液，1ml/EP，共收集50管，编号（1）~（5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0）；
柱清洗与保存：分别用10床柱体积Lew Buffer，10床柱体积去离子水和2倍柱床体积20%乙醇洗涤镍柱，最后4℃，20%乙醇中保存镍柱。
1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳
取(1)—(13)号和(38)—(50)号收集管进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)。
1.4.1分别取各样品50μl于1.5ml EP管中；
1.4.2向各离心管中加入12.5μl 5×Loading Buffer上样缓冲液，混匀；
1.4.3沸水浴3～5min，冷却至室温，高速离心30 s，每泳道上样15 μL；
1.4.4电泳：浓缩胶电压90 V，当样品进入分离胶后电压提升至120 V，待溴酚兰到达底线时，切断电源，停止电泳；
1.4.5染色：将凝胶从电泳槽上取下后，去掉浓缩胶部分，放入盛有考马斯亮蓝的R250染色液的大平皿中，于脱色摇床上，染色1 h；
1.4.6脱色：将凝胶放入脱色液中，脱色后拍照分析。
1.5 透析
根据SDS-PAGE结果，将(2)~(50)号收集管中的洗脱液加入透析袋，PBS(pH 7.4)透析。每6h换液一次，共三次。
1.6 浓缩
取出透析袋，放入一个大的培养皿中，用聚乙二醇(PEG)6000进行浓缩，至终体积约2ml。
M.Marker；1.纯化后的蛋白样品
图3 印迹结果蛋白
The results of Western blot
3 讨论
在步骤1.4中，由于我们收集Denaturing Elution Buffer洗脱液的时候是（1）~（50）号依次进行收集的，而（1）号没有出现明显的目的蛋白，是因为在洗脱的过程中，上一个步骤的Denaturing Solubilization Buffer洗脱液还没有流淌干净，第二管开始目的蛋白就出现了，说明此时的Denaturing Solubilization Buffer洗脱液基本流淌干净，Denaturing Elution Buffer洗脱液也开始流出来了。（2）~（13）号以及（38）~（50）号出现目的蛋白，说明（2）~（50）号收集管中都存在预期的目的蛋白，从而在步骤1.5透析的过程中，来将(2)~(50)号收集管中的洗脱液加入透析袋，并进行下一步的实验。
摘要：分泌片(secretory component，SC)是粘膜型IgA(sIgA)的组成部分，对于粘膜免疫具有重要作用。本实验应用已构建好的含有目的基因的工程菌(BL21)，在诱导剂(IPTG)作用下，诱到目的蛋白表达，分泌目的蛋白即分泌片。然后使用镍柱亲和层析纯化，对SC进行初步纯化，获得粗提物。粗提物经透析、浓缩处理后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。根据目的蛋白分子量大小，切割含有SC的凝胶，进行胶回收，获得纯净的蛋白提取物。最后，对获得的蛋白进行Western blot检测。结果表明，Western blot检测呈阳性。结合蛋白分子量和Western blot结果，我们判定获得的蛋白即为SC。本实验旨在分离纯化SC，为以后的深入研究奠定基础。
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关键字:SIgA分泌片；分离纯化；聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫印迹法
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1目的蛋白诱导表达3
1.2蛋白粗提取 4
1.3镍柱纯化蛋白4
1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳 4
1.5 透析4
1.6 浓缩4
1.7聚丙烯酰胺凝胶电泳4
1.8 铜染4
1.9 PAGE胶蛋白回收5
1.10 Western Blot6
2 结果与分析6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
猪SIgA分泌片的原核表达与分离纯化
引言
分泌型免疫球蛋白A（SIgA）是20世纪60年代初在外分泌液中发现的一种IgA抗体，存在于呼吸道、消化道、泌尿道等部位的分泌液及初乳中，以初乳含量最高，是黏膜免疫的主要抗体。SIgA分子是由2个IgA单体（每个单体含有2条轻链和2条重链）、1条J链和1条分泌片（secretory component，SC，为多聚免疫球蛋白受体的胞外裂解片段）构成的异源十聚体[1]，为了与血清IgA单体相区别而被命名为SIgA。研究表明，分泌型免疫球蛋白A是抵御病原体及有害物质的第一道免疫防线，是机体黏膜免疫的最重要的抗体[2-4]。
二聚体IgA（dIgA）或多聚体（pIgA）从浆细胞分泌出来后，在上皮细胞的嗜碱性侧与多聚免疫球蛋白受体（pIgR）以共价键形成dIgA-pIgR或pIGA-pIgR复合物，然后通过内吞作用和转运被运输到黏膜外侧，此后完整的SIgA分子通过pIGR分裂释放出来。
SC是上皮细胞上的pIgR的一部分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，pIgR为免疫球蛋白超家族成员。pIgR由上皮细胞产生，与pIgA特别是dIgA相结合，成为IgA聚合体的转运受体，是SIgA的重要组成部分。Fc介导了pIgA和pIgR的相互作用，pIgR细胞外部分包含5个与免疫球蛋白相似的功能域（D1-D5）。其中D1在与dIgA的Ca3功能域非共价结合过程中起了重要作用，D5与IgA的Ca2+共价结合使复合物分子更加稳定。正是SC的存在，使SIgA对蛋白酶的敏感性下降，粘液更加粘稠，增强了粘附作用及防御能力。在SIgA的运输过程中，pIgR的细胞外部分与分泌性抗体结合成为固定SC，即我们经常所指的SC，可抵抗蛋白酶的降解，从而起到稳定SIgA的作用。有些未与SIgA结合的pIgR分子也被转运到粘膜外侧，并通过水解与细胞脱离，形成游离的SC，与固定SC相似。SC是粘膜免疫系统的重要组分，参与SIgA形成和分泌[7]。
1 材料与方法
1.1 目的蛋白的诱导表达
1.1.1取6支高压过的试管，每支试管加5ml的含有重组质粒的大肠杆菌液和5μl 100mg/ml 氨苄青霉素(Amp+) ；
1.1.2将试管置于37℃摇床上，200rpm振荡培养，快速培养至OD630至0.6～0.8；
1.1.3取6个500ml的高压过的500ml生理盐水瓶，每个瓶子加250ml的LB培养基、250μl 100mg/ml Ampr、1mmol异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)；
1.1.4将生理盐水瓶放入37℃摇床，200rpm振荡培养5h。
1.2蛋白粗提取
1.2.1将菌液倒入50ml离心管中，离心（9000rpm 、4℃）10min；
1.2.2弃上清，pH7.4 PBS重悬洗涤，离心（9000 rpm 、4℃）10min，重复两次；
1.2.3向盛有沉淀的离心管中加4.5ml的Lew buffer，重悬沉淀；
1.2.4加入500μl 10 mg/ml溶菌酶(lysozyme)，冰浴振荡30min；
1.2.5超声破碎15min（工作时间3s，工作间隙5s）；
1.2.6离心，10000rpm ，4℃，10min，弃上清；
1.2.7向离心管中加入5ml lew buffer，重悬；
1.2.8同1.2.6；
1.2.9向离心管管中加5ml Denaturing Solubilization Buffer，超声破碎5min。
1.2.10冰浴振荡20min；
1.2.11离心，10000rpm ，20℃，10min，取上清，弃 沉淀。
1.3镍柱纯化蛋白
柱平衡：向柱中加入50床柱体积(50ml)Denaturing Solubilization Buffer，Buffer自然流淌；
结合：将含有包涵体的上清加入柱中，上清自然流淌；
洗涤：用80床柱体积(80ml)的Denaturing Solubilization Buffer洗涤，Buffer自然流淌；
洗脱：用50ml Denaturing Elution Buffer洗脱蛋白，EP管收集洗脱液，1ml/EP，共收集50管，编号（1）~（5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0）；
柱清洗与保存：分别用10床柱体积Lew Buffer，10床柱体积去离子水和2倍柱床体积20%乙醇洗涤镍柱，最后4℃，20%乙醇中保存镍柱。
1.4聚丙烯酰胺凝胶电泳
取(1)—(13)号和(38)—(50)号收集管进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)。
1.4.1分别取各样品50μl于1.5ml EP管中；
1.4.2向各离心管中加入12.5μl 5×Loading Buffer上样缓冲液，混匀；
1.4.3沸水浴3～5min，冷却至室温，高速离心30 s，每泳道上样15 μL；
1.4.4电泳：浓缩胶电压90 V，当样品进入分离胶后电压提升至120 V，待溴酚兰到达底线时，切断电源，停止电泳；
1.4.5染色：将凝胶从电泳槽上取下后，去掉浓缩胶部分，放入盛有考马斯亮蓝的R250染色液的大平皿中，于脱色摇床上，染色1 h；
1.4.6脱色：将凝胶放入脱色液中，脱色后拍照分析。
1.5 透析
根据SDS-PAGE结果，将(2)~(50)号收集管中的洗脱液加入透析袋，PBS(pH 7.4)透析。每6h换液一次，共三次。
1.6 浓缩
取出透析袋，放入一个大的培养皿中，用聚乙二醇(PEG)6000进行浓缩，至终体积约2ml。
M.Marker；1.纯化后的蛋白样品
图3 印迹结果蛋白
The results of Western blot
3 讨论
在步骤1.4中，由于我们收集Denaturing Elution Buffer洗脱液的时候是（1）~（50）号依次进行收集的，而（1）号没有出现明显的目的蛋白，是因为在洗脱的过程中，上一个步骤的Denaturing Solubilization Buffer洗脱液还没有流淌干净，第二管开始目的蛋白就出现了，说明此时的Denaturing Solubilization Buffer洗脱液基本流淌干净，Denaturing Elution Buffer洗脱液也开始流出来了。（2）~（13）号以及（38）~（50）号出现目的蛋白，说明（2）~（50）号收集管中都存在预期的目的蛋白，从而在步骤1.5透析的过程中，来将(2)~(50)号收集管中的洗脱液加入透析袋，并进行下一步的实验。
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