真菌毒素对小鼠卵子的毒性作用
真菌毒素对小鼠卵子的毒性作用[20200510204317]
摘要：霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素（AF），广泛存在于多种食品中，并且可能影响动物和人类的生长和繁殖效率。我们研究了受霉菌毒素污染的饲粮对小鼠卵子质量的影响。将受DON(3.875 mg/kg), ZEN (1,897 lg/kg), and AF (806 lg/kg) 污染的玉米饲粮，按三个不同水平(0, 15, and 30%w/w)加入实验鼠的饮食中。4周后，饲喂受霉菌毒素污染饲粮实验鼠的卵巢细胞和生发泡卵母细胞的细胞指数降低 。这些小鼠的卵母细胞表现为发育能力下降，生发泡破裂率和极体排出率降低。胚胎的发育也出现类似现象，大多数胚胎不能发育至桑椹胚阶段。此外，饲喂受霉菌毒素污染饲粮的小鼠的大部分卵母细胞出现纺锤体形态异常，这进一步反映霉菌毒素降低了卵母细胞质量。因此，我们的结果表明，霉菌毒素通过影响卵母细胞质量对小鼠生殖系统产生毒性作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:霉菌毒素;卵母细胞质量；胚胎
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 动物和饲粮4
1.2 GV期卵母细胞和胚胎的获得和培养4
1.3 激光共聚焦显微镜 4
2 结果分析5
2.1 统计分析 5
2.2 结果5
2.2.1 霉菌毒素对卵巢和卵母细胞质量的作用5
2.2.2 霉菌毒素的卵母细胞和胚胎发育能力的损害7
2.2.3 霉菌毒素减少肌动蛋白的表达和破坏减数分裂期纺锤体形态9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 10
真菌毒素对小鼠卵子的毒性作用
引言
引言:霉菌毒素是真菌的自然代谢过程产生的次级代谢产物。四种主要生产霉菌毒素的真菌是曲霉菌，镰刀菌，青霉菌，和麦角菌（Kanora and Maes,2009）[1]。主要霉菌毒素包括黄曲霉毒素（AF），玉米赤霉烯酮（ZEN)，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），赭曲霉毒素，伏马菌素，和单端孢。在一般情况下，玉米，小麦，大麦，小米，花生，豆类，和许多油类作物会在实际应用中被霉菌毒素污染。因此，霉菌毒素可被人类和牲畜是无意地摄入（Edwards 等1987）[2]。霉菌毒素可影响人类和动物的生长速度和繁殖质量。例如，处于繁殖活跃期的小鼠经霉菌毒素处理后其繁殖效率有明显的降低（Danicke 等 2002[3]; Hou 等, 2013）[4]。此外，ZEN及其衍生物具有类雌激素的性质，因为他们可以模拟不同的动物物种的内源性雌激素的作用（Peraica 等 1999）[5]。实验显示饲喂受ZEN污染 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的饲粮的青年母猪初情期晚于对照组母猪，而且这些母猪的颗粒细胞已经表现出细胞凋亡现象（Green等 1990[6]; Zwierzchowski 等2005）[7]。有实验表明在人类和猪食用受DON污染的食物后出现生殖的变化（Hussein and Brasel, 2001[8]; Alm等2006）[9]。然而， 有矛盾的实验报告表明饲喂受ZEN 和DON污染饲粮的青年母猪的排卵期，孕期，胚胎存活率，或不同时期卵泡的分布没有出现明显变化（Rainey 等 1990[10]; Alm 等2006）。受霉菌毒素污染的饮食可影响女性激素水平及其他生化指标，导致生殖系统功能障碍。卵母细胞质量是衡量女性生殖健康的重要指标，是受精和胚胎发育的关键。卵母细胞质量通常是通过形态学标准和成熟率进行评估的，另外细胞器的分布，细胞骨架的完整性，和第一极体排出率也是衡量卵母细胞质量的可靠指标（Balaban等 2012）[11]。众所周知的是，检测到超过80%的异常胚胎来源于卵母细胞的减数分裂过程(Hassold and Hunt, 2001) [12]。纺锤体主要成分是包括alpha-tubulin和beta-tubulin亚基的微管，微管的组织中心包含gamma-tubulin，gamma-tubulin是一种重要的核蛋白（Gueth-Hallonet 等 1993[13];Palacios 等 1993）[14]。因为食物通常是受多种霉菌毒素污染，所以确定这些毒素对女性生殖健康影响是十分重要的。之前体外研究表明，ZEN和DON导致异倍体和母猪胚胎发育异常（Malekinejad等 2007[15]; Tiemann and Danicke, 2007）[16]。然而，现在还没有关于霉菌毒素影响体内的卵母细胞质量的报告。因此，目前研究中，我们给（ICR）母鼠饲喂霉菌毒素污染的饲粮，并随后检测卵巢形态，卵母细胞成熟与胚胎发育情况。我们的研究结果表明，霉菌毒素可影响小鼠卵母细胞质量。
1 材料与方法
1．1 动物和饲粮
动物护理和使用是参照大学的指导，中国。4周龄ICR母鼠经恒温条件下（24±2℃）和光照：黑暗（12:12小时）处理。他们可以不受限制地获取食物和水。实验鼠由大学动物实验室负责。饲料原料来自制定控制从温氏养殖集团中获得的饮食（苏州，中国）并且没有检测出毒素。霉菌毒素污染的玉米是由黄曲霉和A.镰刀菌和玉米粉结合制备然后加入奶粉受污染的玉米。玉米在适当的温度和湿度培养4周。在分析玉米霉菌毒素的成分后，我们用它来准备霉菌毒素污染的饲料。将实验鼠随机分成三组（n=30 /组）。用霉菌毒素污染的饲料喂养4周的小鼠，经颈椎脱位方法进行安乐死处理，然后确定卵巢的重量和生发泡（GV）、受精卵的数量。所有饲料均在江苏省农业科学院分析，南京，用如前所述的气相色谱-质谱联用和光谱描述法来确定DON，ZEN，AF，单端孢霉素，赭曲霉毒素和伏马菌素的浓度（Raymonde等2003）[17]。霉菌毒素污染的玉米中含有3.875lg/kg的DON，1897lg／kg的ZEN和806lg／kg的AF。 赭曲霉毒素、伏马菌素和单端孢的浓度均低于检测极限。饲粮中未受霉菌毒素玉米的15和30%分别用受霉菌毒素污染的玉米替代。
1．2 GV期卵母细胞和胚胎的获得和培养
GV期卵母细胞由未经处理（对照）和用霉菌毒素 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
饲喂ICR小鼠的卵巢中获得，在受精13214小时后从输卵管获得受精卵。GV期卵母细胞和受精卵在M16培养液中培养(Sigma, St. Louis, MO)样品在37℃的石蜡油和5%的CO2条件下进行免疫组化染色。为获得受精卵，给小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG），其次是48小时后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）。经处理后的实验鼠立即与雄性小鼠交配。37℃石蜡油和5%的CO2条件下经M16培养18小时后取受精卵。在培养24，48，和72小时后，我们分别获得了2-细胞期，4-细胞期，和桑椹期的胚胎。
1．3激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜操作按先前描述的（Sun等2010）[18]。简言之，卵母细胞被固定在4%多聚甲醛（w／v）经磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温（RT）下处理30分钟，然后置于一种膜渗透液中(0.5% albumin(w/v)-supplemented PBS) 在室温下处理20分钟。卵母细胞在洗涤液洗涤三次(0.1% Tween 20(v/v) 和 0.01% Triton X-100 (v/v) in PBS)。然后用一种Alexa Fluor二型抗体（1:100）标记在室温下培养1小时。用1毫克/毫升的鬼笔环肽TRITC在室温下染色30分钟后，用缓冲液洗三遍，样品用Hoechst 33342染色（10mg／ml PBS）固定10分钟。一些卵母细胞用5毫克/毫升染色凝集素-FITC或anti-alpha-tubulin-FITC（1:200）在室温2小时，用Hoechst 33342（10 mg/mL PBS）染色10分钟。然后将卵母细胞置于载玻片上，用Zeiss LSM 700 META 扫描共聚焦显微镜检查（Carl Zeiss; Jena, Germany）。
2 结果与分析
2．1 统计分析
每个实验至少重复三次，结果表示用means6SEMs表达。统计比较分析通过方差分析（ANOVA）进行，其次是Duncan的多重比较试验。P值小于0.05，为差异显着。荧光强度由Image J软件量化(NIH, Bethesda,MD），每个实验分析30个卵母细胞。每个指标至少重复三次。
摘要：霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素（AF），广泛存在于多种食品中，并且可能影响动物和人类的生长和繁殖效率。我们研究了受霉菌毒素污染的饲粮对小鼠卵子质量的影响。将受DON(3.875 mg/kg), ZEN (1,897 lg/kg), and AF (806 lg/kg) 污染的玉米饲粮，按三个不同水平(0, 15, and 30%w/w)加入实验鼠的饮食中。4周后，饲喂受霉菌毒素污染饲粮实验鼠的卵巢细胞和生发泡卵母细胞的细胞指数降低 。这些小鼠的卵母细胞表现为发育能力下降，生发泡破裂率和极体排出率降低。胚胎的发育也出现类似现象，大多数胚胎不能发育至桑椹胚阶段。此外，饲喂受霉菌毒素污染饲粮的小鼠的大部分卵母细胞出现纺锤体形态异常，这进一步反映霉菌毒素降低了卵母细胞质量。因此，我们的结果表明，霉菌毒素通过影响卵母细胞质量对小鼠生殖系统产生毒性作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:霉菌毒素;卵母细胞质量；胚胎
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 动物和饲粮4
1.2 GV期卵母细胞和胚胎的获得和培养4
1.3 激光共聚焦显微镜 4
2 结果分析5
2.1 统计分析 5
2.2 结果5
2.2.1 霉菌毒素对卵巢和卵母细胞质量的作用5
2.2.2 霉菌毒素的卵母细胞和胚胎发育能力的损害7
2.2.3 霉菌毒素减少肌动蛋白的表达和破坏减数分裂期纺锤体形态9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 10
真菌毒素对小鼠卵子的毒性作用
引言
引言:霉菌毒素是真菌的自然代谢过程产生的次级代谢产物。四种主要生产霉菌毒素的真菌是曲霉菌，镰刀菌，青霉菌，和麦角菌（Kanora and Maes,2009）[1]。主要霉菌毒素包括黄曲霉毒素（AF），玉米赤霉烯酮（ZEN)，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），赭曲霉毒素，伏马菌素，和单端孢。在一般情况下，玉米，小麦，大麦，小米，花生，豆类，和许多油类作物会在实际应用中被霉菌毒素污染。因此，霉菌毒素可被人类和牲畜是无意地摄入（Edwards 等1987）[2]。霉菌毒素可影响人类和动物的生长速度和繁殖质量。例如，处于繁殖活跃期的小鼠经霉菌毒素处理后其繁殖效率有明显的降低（Danicke 等 2002[3]; Hou 等, 2013）[4]。此外，ZEN及其衍生物具有类雌激素的性质，因为他们可以模拟不同的动物物种的内源性雌激素的作用（Peraica 等 1999）[5]。实验显示饲喂受ZEN污染 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的饲粮的青年母猪初情期晚于对照组母猪，而且这些母猪的颗粒细胞已经表现出细胞凋亡现象（Green等 1990[6]; Zwierzchowski 等2005）[7]。有实验表明在人类和猪食用受DON污染的食物后出现生殖的变化（Hussein and Brasel, 2001[8]; Alm等2006）[9]。然而， 有矛盾的实验报告表明饲喂受ZEN 和DON污染饲粮的青年母猪的排卵期，孕期，胚胎存活率，或不同时期卵泡的分布没有出现明显变化（Rainey 等 1990[10]; Alm 等2006）。受霉菌毒素污染的饮食可影响女性激素水平及其他生化指标，导致生殖系统功能障碍。卵母细胞质量是衡量女性生殖健康的重要指标，是受精和胚胎发育的关键。卵母细胞质量通常是通过形态学标准和成熟率进行评估的，另外细胞器的分布，细胞骨架的完整性，和第一极体排出率也是衡量卵母细胞质量的可靠指标（Balaban等 2012）[11]。众所周知的是，检测到超过80%的异常胚胎来源于卵母细胞的减数分裂过程(Hassold and Hunt, 2001) [12]。纺锤体主要成分是包括alpha-tubulin和beta-tubulin亚基的微管，微管的组织中心包含gamma-tubulin，gamma-tubulin是一种重要的核蛋白（Gueth-Hallonet 等 1993[13];Palacios 等 1993）[14]。因为食物通常是受多种霉菌毒素污染，所以确定这些毒素对女性生殖健康影响是十分重要的。之前体外研究表明，ZEN和DON导致异倍体和母猪胚胎发育异常（Malekinejad等 2007[15]; Tiemann and Danicke, 2007）[16]。然而，现在还没有关于霉菌毒素影响体内的卵母细胞质量的报告。因此，目前研究中，我们给（ICR）母鼠饲喂霉菌毒素污染的饲粮，并随后检测卵巢形态，卵母细胞成熟与胚胎发育情况。我们的研究结果表明，霉菌毒素可影响小鼠卵母细胞质量。
1 材料与方法
1．1 动物和饲粮
动物护理和使用是参照大学的指导，中国。4周龄ICR母鼠经恒温条件下（24±2℃）和光照：黑暗（12:12小时）处理。他们可以不受限制地获取食物和水。实验鼠由大学动物实验室负责。饲料原料来自制定控制从温氏养殖集团中获得的饮食（苏州，中国）并且没有检测出毒素。霉菌毒素污染的玉米是由黄曲霉和A.镰刀菌和玉米粉结合制备然后加入奶粉受污染的玉米。玉米在适当的温度和湿度培养4周。在分析玉米霉菌毒素的成分后，我们用它来准备霉菌毒素污染的饲料。将实验鼠随机分成三组（n=30 /组）。用霉菌毒素污染的饲料喂养4周的小鼠，经颈椎脱位方法进行安乐死处理，然后确定卵巢的重量和生发泡（GV）、受精卵的数量。所有饲料均在江苏省农业科学院分析，南京，用如前所述的气相色谱-质谱联用和光谱描述法来确定DON，ZEN，AF，单端孢霉素，赭曲霉毒素和伏马菌素的浓度（Raymonde等2003）[17]。霉菌毒素污染的玉米中含有3.875lg/kg的DON，1897lg／kg的ZEN和806lg／kg的AF。 赭曲霉毒素、伏马菌素和单端孢的浓度均低于检测极限。饲粮中未受霉菌毒素玉米的15和30%分别用受霉菌毒素污染的玉米替代。
1．2 GV期卵母细胞和胚胎的获得和培养
GV期卵母细胞由未经处理（对照）和用霉菌毒素 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
饲喂ICR小鼠的卵巢中获得，在受精13214小时后从输卵管获得受精卵。GV期卵母细胞和受精卵在M16培养液中培养(Sigma, St. Louis, MO)样品在37℃的石蜡油和5%的CO2条件下进行免疫组化染色。为获得受精卵，给小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG），其次是48小时后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）。经处理后的实验鼠立即与雄性小鼠交配。37℃石蜡油和5%的CO2条件下经M16培养18小时后取受精卵。在培养24，48，和72小时后，我们分别获得了2-细胞期，4-细胞期，和桑椹期的胚胎。
1．3激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜操作按先前描述的（Sun等2010）[18]。简言之，卵母细胞被固定在4%多聚甲醛（w／v）经磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温（RT）下处理30分钟，然后置于一种膜渗透液中(0.5% albumin(w/v)-supplemented PBS) 在室温下处理20分钟。卵母细胞在洗涤液洗涤三次(0.1% Tween 20(v/v) 和 0.01% Triton X-100 (v/v) in PBS)。然后用一种Alexa Fluor二型抗体（1:100）标记在室温下培养1小时。用1毫克/毫升的鬼笔环肽TRITC在室温下染色30分钟后，用缓冲液洗三遍，样品用Hoechst 33342染色（10mg／ml PBS）固定10分钟。一些卵母细胞用5毫克/毫升染色凝集素-FITC或anti-alpha-tubulin-FITC（1:200）在室温2小时，用Hoechst 33342（10 mg/mL PBS）染色10分钟。然后将卵母细胞置于载玻片上，用Zeiss LSM 700 META 扫描共聚焦显微镜检查（Carl Zeiss; Jena, Germany）。
2 结果与分析
2．1 统计分析
每个实验至少重复三次，结果表示用means6SEMs表达。统计比较分析通过方差分析（ANOVA）进行，其次是Duncan的多重比较试验。P值小于0.05，为差异显着。荧光强度由Image J软件量化(NIH, Bethesda,MD），每个实验分析30个卵母细胞。每个指标至少重复三次。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/1001.html
