热应激对猪卵巢颗粒细胞凋亡与gr表达的影响(附件)
热应激是影响动物繁殖性能的重要因素。卵泡颗粒细胞对动物繁殖性能影响重大。热应激对颗粒细胞的作用方式主要为①提高细胞环境温度②升高糖皮质激素浓度。糖皮质激素受体(GR)能够介导糖皮质激素的作用，热应激对其影响尚不明确。本研究体外分离培养猪卵巢颗粒细胞，建立热应激模型，来探究热应激对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，以及GR表达的变化。实验测定了颗粒细胞凋亡水平、GR的mRNA表达水平以及GR蛋白表达水平。实验结果显示，凋亡水平在热应激组和地塞米松处理组上升,共同处理组不变，推测GR被热应激处理无配体激活；GR蛋白表达水平无差异，而mRNA变体差异表达热应激组GRα水平上升，地塞米松组GR-P水平上升，共同处理组GR-β水平下降、GR-P水平上升。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
绪论3
1 材料方法5
1.1 材料 5
1.1.1实验动物及组织样品5
1.1.2主要试剂及药品5
1.1.3实验仪器5
1.2 实验方法 5
1.2.1猪颗粒细胞的原代培养5
1.2.2分组培养实验设计6
1.2.3细胞凋亡检测6
1.2.4 GR mRNA变体表达水平测定6
1.2.5 GR蛋白亚型的检测7
1.3 统计分析 8
2 结果与分析8
2.1 细胞凋亡检测8
2.2 GR mRNA变体表达水平检测9
2.3蛋白表达水平测定10
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
热应激对猪卵巢颗粒细胞凋亡与GR表达的影响
引言
绪论：在实际生产中，高温环境容易导致猪产生热应激反应，致使其生长、繁殖性能降低，肉品质下降，从而给养猪业带来严重的经济损失[1]。对于雌性动物而言，热应激不仅能够影响其生长性能，同时还对卵子发生、卵母细胞成熟、受精、胚胎发育和着床等产生不利影响，从而影响雌性动物的繁殖功能[2]。
卵母细胞是母猪繁殖功能的最终执行者，其质量好坏直接决定了母猪繁 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
殖性能的高低。有关热应激对卵母细胞质量的影响的研究很多，主要机制涉及了激素代谢、氧化应激、细胞凋亡等方面[34]。颗粒细胞作为卵母细胞的“伴侣细胞”，通过缝隙连接的方式与卵母细胞保持联系，向卵母细胞输送离子、氨基酸、激素等小分子营养、信号物质，在滋养和调节卵母细胞的成熟和发育中发挥着非常重要的作用[5,8]。例如，在卵泡发育过程中，颗粒细胞能够合成多种生长因子和性腺激素，调节卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，同时发挥其细胞保护机制[1,67]。
热应激是机体细胞内激发的一系列高度程序化事件。面对热应激，机体可通过对下丘脑垂体肾上腺皮质轴(HPA轴)的调节使血液中的糖皮质激素水平迅速升高，从而增强对不利环境的抵抗[9]。但过高强度或长时间的热应激往往导致HPA轴持续激活，破坏机体稳态，引起内分泌紊乱、体温过高。目前已有的关于热应激的研究大多建立了体内模型，直接探究热应激对动物机体整体或组织细胞的影响；而建立体外模型的研究中，也大多以热应激温度变化为单因素变量，鲜少有研究将热应激导致的温度变化与糖皮质激素水平变化进行共同研究。
糖皮质激素受体(GR)是机体响应外部应激的重要细胞组分，HPA轴分泌产生的糖皮质激素主要由GR介导发挥作用。配体占据后的GR通过直接结合DNA应答元件和/或通过与其他转录因子发生物理性结合，诱导或抑制数以千计的基因的转录[10]。GR几乎在所有类型的体细胞中均有表达，执行复杂多样的生物学功能。卵巢颗粒细胞也表达GR[11]。GR作用方式复杂多样，具有组织（细胞）特异性。以研究较为深入的人GR为例，糖皮质激素诱导淋巴细胞和成骨细胞凋亡，但促进肝细胞和成纤维细胞细胞的存活[1214]。GR由单一基因NR3C1编码，以研究较深的人GR为例，在转录水平应用不同的启动子和mRNA前体的选择性剪接可产生十几种mRNA变体[15]。GR的翻译及翻译后加工（修饰）更为复杂，选择性剪接产生的mRNA可翻译成不同的GR蛋白亚型，而每类选择性剪接GR蛋白亚型又可通过不同的翻译起始位点产生N端长短不一的GR翻译亚型。
在猪的机体中存在GRα，GRβ，GRγ，GRP四种亚型，其编码序列与人的具有极高的保守性[16]。GRα由编码外显子2至9组成。基因在第9个外显子处经不同剪接生成两种高度同源的异构体，分别称为GRα和GRβ，分子量分别为97kDa和94kDa。GRα可以与糖皮质激素结合而发挥生物功能；GRβ缺乏糖皮质激素结合区，并不与糖皮质激素激动剂结合，对GRα的作用起负面效果。GRP缺乏外显子7和8，在不同细胞中表现出对GRα的促进或抑制作用[23]。GRγ是GRP的直系同源变体[16]。
在没有激素的情况下，GR主要存在于细胞质中，和伴侣蛋白(hsp90，hsp70和p23)、FK506家族的免疫亲和素(FKBP51和FKBP52)等组成复合物[28]。在结合糖皮质激素后，GR发生构象变化，导致相关蛋白的解离，GR通过核孔迅速地转移到细胞核中。一旦进入细胞核，GR就直接与糖皮质激素反应元件(GRE)结合并调节靶基因的表达。GR调节基因表达主要通过三种方式：直接与DNA结合、附着于其他与DNA结合的转录因子以及直接与DNA结合并和相邻的与DNA结合的转录因子接触[10]。转录因子种类繁多，对GR功能的表达影响重大[29]。GR也可以以非基因组的方式通过改变各种激酶的活性发出信号[30]。
目前已有的关于热应激的研究大多以热应激温度变化为单因素变量[2122]，鲜少有研究将热应激导致的温度变化与糖皮质激素水平变化进行共同研究。同时，关于热应激对动物卵泡颗粒细胞凋亡的影响的研究多以小鼠为模型[1718]，在猪的模型中，热应激会引起颗粒细胞发生什么样的变化，GR是否在猪的卵泡颗粒细胞中表达，是否参与热应激对颗粒细胞功能的调控，至今仍未见报道。因此，本试验设计控制温度与地塞米松处理变量，通过流式细胞术、qRTPCR和Western blot技术，检测了猪卵巢颗粒细胞的凋亡、GR的 mRNA变体和蛋白亚型的表达，旨在探究热应激对猪卵巢颗粒细胞凋亡与GR表达的影响。
1.材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物及组织样品
选取并采集健康商品母猪卵巢，置于37 °C生理盐水运回实验室。用酒精和生理盐水轮流清洗卵巢。用G18针头注射器抽取卵泡液（避开血管）。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
绪论3
1 材料方法5
1.1 材料 5
1.1.1实验动物及组织样品5
1.1.2主要试剂及药品5
1.1.3实验仪器5
1.2 实验方法 5
1.2.1猪颗粒细胞的原代培养5
1.2.2分组培养实验设计6
1.2.3细胞凋亡检测6
1.2.4 GR mRNA变体表达水平测定6
1.2.5 GR蛋白亚型的检测7
1.3 统计分析 8
2 结果与分析8
2.1 细胞凋亡检测8
2.2 GR mRNA变体表达水平检测9
2.3蛋白表达水平测定10
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
热应激对猪卵巢颗粒细胞凋亡与GR表达的影响
引言
绪论：在实际生产中，高温环境容易导致猪产生热应激反应，致使其生长、繁殖性能降低，肉品质下降，从而给养猪业带来严重的经济损失[1]。对于雌性动物而言，热应激不仅能够影响其生长性能，同时还对卵子发生、卵母细胞成熟、受精、胚胎发育和着床等产生不利影响，从而影响雌性动物的繁殖功能[2]。
卵母细胞是母猪繁殖功能的最终执行者，其质量好坏直接决定了母猪繁 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
殖性能的高低。有关热应激对卵母细胞质量的影响的研究很多，主要机制涉及了激素代谢、氧化应激、细胞凋亡等方面[34]。颗粒细胞作为卵母细胞的“伴侣细胞”，通过缝隙连接的方式与卵母细胞保持联系，向卵母细胞输送离子、氨基酸、激素等小分子营养、信号物质，在滋养和调节卵母细胞的成熟和发育中发挥着非常重要的作用[5,8]。例如，在卵泡发育过程中，颗粒细胞能够合成多种生长因子和性腺激素，调节卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，同时发挥其细胞保护机制[1,67]。
热应激是机体细胞内激发的一系列高度程序化事件。面对热应激，机体可通过对下丘脑垂体肾上腺皮质轴(HPA轴)的调节使血液中的糖皮质激素水平迅速升高，从而增强对不利环境的抵抗[9]。但过高强度或长时间的热应激往往导致HPA轴持续激活，破坏机体稳态，引起内分泌紊乱、体温过高。目前已有的关于热应激的研究大多建立了体内模型，直接探究热应激对动物机体整体或组织细胞的影响；而建立体外模型的研究中，也大多以热应激温度变化为单因素变量，鲜少有研究将热应激导致的温度变化与糖皮质激素水平变化进行共同研究。
糖皮质激素受体(GR)是机体响应外部应激的重要细胞组分，HPA轴分泌产生的糖皮质激素主要由GR介导发挥作用。配体占据后的GR通过直接结合DNA应答元件和/或通过与其他转录因子发生物理性结合，诱导或抑制数以千计的基因的转录[10]。GR几乎在所有类型的体细胞中均有表达，执行复杂多样的生物学功能。卵巢颗粒细胞也表达GR[11]。GR作用方式复杂多样，具有组织（细胞）特异性。以研究较为深入的人GR为例，糖皮质激素诱导淋巴细胞和成骨细胞凋亡，但促进肝细胞和成纤维细胞细胞的存活[1214]。GR由单一基因NR3C1编码，以研究较深的人GR为例，在转录水平应用不同的启动子和mRNA前体的选择性剪接可产生十几种mRNA变体[15]。GR的翻译及翻译后加工（修饰）更为复杂，选择性剪接产生的mRNA可翻译成不同的GR蛋白亚型，而每类选择性剪接GR蛋白亚型又可通过不同的翻译起始位点产生N端长短不一的GR翻译亚型。
在猪的机体中存在GRα，GRβ，GRγ，GRP四种亚型，其编码序列与人的具有极高的保守性[16]。GRα由编码外显子2至9组成。基因在第9个外显子处经不同剪接生成两种高度同源的异构体，分别称为GRα和GRβ，分子量分别为97kDa和94kDa。GRα可以与糖皮质激素结合而发挥生物功能；GRβ缺乏糖皮质激素结合区，并不与糖皮质激素激动剂结合，对GRα的作用起负面效果。GRP缺乏外显子7和8，在不同细胞中表现出对GRα的促进或抑制作用[23]。GRγ是GRP的直系同源变体[16]。
在没有激素的情况下，GR主要存在于细胞质中，和伴侣蛋白(hsp90，hsp70和p23)、FK506家族的免疫亲和素(FKBP51和FKBP52)等组成复合物[28]。在结合糖皮质激素后，GR发生构象变化，导致相关蛋白的解离，GR通过核孔迅速地转移到细胞核中。一旦进入细胞核，GR就直接与糖皮质激素反应元件(GRE)结合并调节靶基因的表达。GR调节基因表达主要通过三种方式：直接与DNA结合、附着于其他与DNA结合的转录因子以及直接与DNA结合并和相邻的与DNA结合的转录因子接触[10]。转录因子种类繁多，对GR功能的表达影响重大[29]。GR也可以以非基因组的方式通过改变各种激酶的活性发出信号[30]。
目前已有的关于热应激的研究大多以热应激温度变化为单因素变量[2122]，鲜少有研究将热应激导致的温度变化与糖皮质激素水平变化进行共同研究。同时，关于热应激对动物卵泡颗粒细胞凋亡的影响的研究多以小鼠为模型[1718]，在猪的模型中，热应激会引起颗粒细胞发生什么样的变化，GR是否在猪的卵泡颗粒细胞中表达，是否参与热应激对颗粒细胞功能的调控，至今仍未见报道。因此，本试验设计控制温度与地塞米松处理变量，通过流式细胞术、qRTPCR和Western blot技术，检测了猪卵巢颗粒细胞的凋亡、GR的 mRNA变体和蛋白亚型的表达，旨在探究热应激对猪卵巢颗粒细胞凋亡与GR表达的影响。
1.材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物及组织样品
选取并采集健康商品母猪卵巢，置于37 °C生理盐水运回实验室。用酒精和生理盐水轮流清洗卵巢。用G18针头注射器抽取卵泡液（避开血管）。
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