新鲜冻精精液对猪体外多精受精及早期发育的影响
为探讨精液冷冻和精液浓度是否会对猪的卵母细胞体外受精造成影响，本实验用5×105、1×106、5×106这三个浓度梯度的新鲜精液与冷冻精液分别对猪的卵母细胞进行体外受精，并测定了多精受精率、胚胎发育率。结果显示，不同精液（鲜精与冻精）体外受精时的多精受精率差异显著（P＜0.05），但冻精组随后的胚胎发育率无显著影响（P＞0.05）；冻精组的多精受精率随浓度升高而升高，受精浓度为1×106与5×106时的多精受精率都显著高于5×105浓度时的多精受精率（P＜0.05），但受精浓度为5×106时的多精受精与1×106浓度相比无显著变化（P＞0.05）；鲜精组的多精受精率反而随浓度升高而降低，5×105浓度梯度时的多精受精率显著高于5×106浓度梯度时的多精受精率（P＜0.05），但1×106浓度梯度时多精受精率与其它两组相比无显著变化（P＞0.05）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1仪器设备2
1.1.2卵母细胞、精液及相关试剂2
1.2溶液的配制2
1.2.1稀释液A2
1.2.2冷冻保存液2
1.2.3受精获能液3
1.3方法3
1.3.1 卵母细胞的采集和体外成熟3
1.3.2成熟卵母细胞的处理3
1.3.3鲜精的处理3
1.3.4冻精的处理3
1.3.5体外受精方法和精液密度检测3
1.3.6观察多精入卵3
1.3.7胚胎培养方法3
1.4 统计与分析3
2结果与分析3
2.1精液浓度梯度对多精受精率的影响3
2.2冻精和鲜精对多精受精率的影响4
2.3多精受精率对胚胎发育率的影响5
3讨论 5
3.1精液浓度梯度对多精受精率的影响5
3.2冻 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
精和鲜精对多精受精率的影响6
3.3多精受精率对胚胎发育率的影响6
致谢6
参考文献8
新鲜、冻精精液对猪体外多精受精及早期发育的影响
引言
引言猪体外受精技术对基础研究、生产应用和促进有关技术的研究和发展均具重要意义，还可促进基因导入、核移植、细胞融合等技术的研究和发展。长久以来，猪卵母细胞体外受精一直存在囊胚发育力较低、多精子入卵概率显著高于体内成熟卵母细胞[1]等问题，多精受精可导致受精卵发育停止或形成非整倍体，进而造成早期胚胎死亡、流产、胎儿遗传性疾病等，这使得如何改善多精受精成为研究热点。
猪卵母细胞体外受精中多精受精的主要原因可能是延迟的透明带反应或自发的精子穿透[2]。但猪的品种特性、卵母细胞成熟的程度、透明带的异常、输卵管分泌物或者受精时获能精子的浓度、受精液蛋白添加成分、NaHC03浓度、咖啡因、pH值以及温度等均与猪卵的多精受精率密切相关[3]。在进行IVF时，未成熟的卵和老化的成熟卵都会影响多精入卵率，并且体外成熟的卵比体内成熟的卵更容易发生多精受精[4]。同时，输卵管会分泌一些酶类或蛋白加强卵子的透明带反应，Kim[5]等研究发现将体外成熟的卵母细胞与输卵管液或输卵管上皮细胞共培养一段时间后可降低其多精受精现象。此外，将卵丘细胞和颗粒细胞在体外培养36或48 h，再将其冻融后加到IVF液中，也可显著地提高精子入卵率，而降低多精受精率[6]。
尤其是精子质量、浓度及获能方式、受精时间和受精环境也会影响IVF成功率和多精入卵率。精液质量会影响体外受精胚胎的后续发育能力[7]。Rath and Niemann[8]对比了从相同公猪获得的新鲜精液和冷冻精液的猪精子活率，发现冷冻解冻的精液精子的活率（40.2±9.4%）与最后稀释的新鲜精液精子活率（72.2±5.6%）相比会明显下降。此外，体外的研究证明，无论是体内成熟还是体外成熟的精子，多精受精率随着精子浓度的升高而提高[9]。目前国际常用的精子浓度为1×105～1×106 /mL数量级，常用的猪体外受精的获能物质是咖啡因，但咖啡因为磷酸化酶抑制物，会引发精子自发顶体反应导致多精入卵率增加。Funahashi等人[10]发现，受精液中咖啡因的存在会引起数量相当多的精子处于自发顶体反应的早期。针对这两个问题，曹筠青等[11]发现使用2.5 mmol/L二茶碱作为获能物质的受精液能够显著提高体外受精胚胎的卵裂及囊胚率（P＜0.05）。相比正常浓度标准，将精子浓度提高到5×106 /mL能进一步提高体外受精效率。此外，Alminana等[12]研究发现，在mTBM受精液中添加透明质酸和腺苷可以增加猪体外受精单精受精率。另外张立苹[9]的研究表明，过长的受精时间会增加多精受精率并降低受精胚胎的囊胚率，Li[13]等报道在精液冷冻细管中进行猪体外受精，能显著提高精子穿透率，降低多精受精率。
综上，所以虽然已有大量国内外学者已相继对其影响因素加以探究，但对于冻精对体外受精时多精入卵率的影响仍未见报道。综上，本课题在基于大量前人的研究基础上尝试新鲜精液与冻精对猪体外受精的影响，并讨论可能的影响其胚胎发育的因素。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器设备 电子天平（Sartorius，德国）；恒温水浴锅（HH4，国华电器有限公司）；可调式移液枪（Thermo，美国）；超净工作台（6FA63666型，上海智诚分析仪器制造有限公司）；体式显微镜（Nikon，日本）；荧光显微镜（Olympus，日本）；高速离心机（DDL5，韩国）；恒温热台（国产定制，北京）；二氧化碳培养箱（Thermo，美国）。
1．1．2 卵母细胞、精液及相关试剂
表一 卵母细胞、精液及相关试剂来源
材料
来源
卵巢、精液
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1仪器设备2
1.1.2卵母细胞、精液及相关试剂2
1.2溶液的配制2
1.2.1稀释液A2
1.2.2冷冻保存液2
1.2.3受精获能液3
1.3方法3
1.3.1 卵母细胞的采集和体外成熟3
1.3.2成熟卵母细胞的处理3
1.3.3鲜精的处理3
1.3.4冻精的处理3
1.3.5体外受精方法和精液密度检测3
1.3.6观察多精入卵3
1.3.7胚胎培养方法3
1.4 统计与分析3
2结果与分析3
2.1精液浓度梯度对多精受精率的影响3
2.2冻精和鲜精对多精受精率的影响4
2.3多精受精率对胚胎发育率的影响5
3讨论 5
3.1精液浓度梯度对多精受精率的影响5
3.2冻 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
精和鲜精对多精受精率的影响6
3.3多精受精率对胚胎发育率的影响6
致谢6
参考文献8
新鲜、冻精精液对猪体外多精受精及早期发育的影响
引言
引言猪体外受精技术对基础研究、生产应用和促进有关技术的研究和发展均具重要意义，还可促进基因导入、核移植、细胞融合等技术的研究和发展。长久以来，猪卵母细胞体外受精一直存在囊胚发育力较低、多精子入卵概率显著高于体内成熟卵母细胞[1]等问题，多精受精可导致受精卵发育停止或形成非整倍体，进而造成早期胚胎死亡、流产、胎儿遗传性疾病等，这使得如何改善多精受精成为研究热点。
猪卵母细胞体外受精中多精受精的主要原因可能是延迟的透明带反应或自发的精子穿透[2]。但猪的品种特性、卵母细胞成熟的程度、透明带的异常、输卵管分泌物或者受精时获能精子的浓度、受精液蛋白添加成分、NaHC03浓度、咖啡因、pH值以及温度等均与猪卵的多精受精率密切相关[3]。在进行IVF时，未成熟的卵和老化的成熟卵都会影响多精入卵率，并且体外成熟的卵比体内成熟的卵更容易发生多精受精[4]。同时，输卵管会分泌一些酶类或蛋白加强卵子的透明带反应，Kim[5]等研究发现将体外成熟的卵母细胞与输卵管液或输卵管上皮细胞共培养一段时间后可降低其多精受精现象。此外，将卵丘细胞和颗粒细胞在体外培养36或48 h，再将其冻融后加到IVF液中，也可显著地提高精子入卵率，而降低多精受精率[6]。
尤其是精子质量、浓度及获能方式、受精时间和受精环境也会影响IVF成功率和多精入卵率。精液质量会影响体外受精胚胎的后续发育能力[7]。Rath and Niemann[8]对比了从相同公猪获得的新鲜精液和冷冻精液的猪精子活率，发现冷冻解冻的精液精子的活率（40.2±9.4%）与最后稀释的新鲜精液精子活率（72.2±5.6%）相比会明显下降。此外，体外的研究证明，无论是体内成熟还是体外成熟的精子，多精受精率随着精子浓度的升高而提高[9]。目前国际常用的精子浓度为1×105～1×106 /mL数量级，常用的猪体外受精的获能物质是咖啡因，但咖啡因为磷酸化酶抑制物，会引发精子自发顶体反应导致多精入卵率增加。Funahashi等人[10]发现，受精液中咖啡因的存在会引起数量相当多的精子处于自发顶体反应的早期。针对这两个问题，曹筠青等[11]发现使用2.5 mmol/L二茶碱作为获能物质的受精液能够显著提高体外受精胚胎的卵裂及囊胚率（P＜0.05）。相比正常浓度标准，将精子浓度提高到5×106 /mL能进一步提高体外受精效率。此外，Alminana等[12]研究发现，在mTBM受精液中添加透明质酸和腺苷可以增加猪体外受精单精受精率。另外张立苹[9]的研究表明，过长的受精时间会增加多精受精率并降低受精胚胎的囊胚率，Li[13]等报道在精液冷冻细管中进行猪体外受精，能显著提高精子穿透率，降低多精受精率。
综上，所以虽然已有大量国内外学者已相继对其影响因素加以探究，但对于冻精对体外受精时多精入卵率的影响仍未见报道。综上，本课题在基于大量前人的研究基础上尝试新鲜精液与冻精对猪体外受精的影响，并讨论可能的影响其胚胎发育的因素。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器设备 电子天平（Sartorius，德国）；恒温水浴锅（HH4，国华电器有限公司）；可调式移液枪（Thermo，美国）；超净工作台（6FA63666型，上海智诚分析仪器制造有限公司）；体式显微镜（Nikon，日本）；荧光显微镜（Olympus，日本）；高速离心机（DDL5，韩国）；恒温热台（国产定制，北京）；二氧化碳培养箱（Thermo，美国）。
1．1．2 卵母细胞、精液及相关试剂
表一 卵母细胞、精液及相关试剂来源
材料
来源
卵巢、精液
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