猪伪狂犬病毒变异株高免血清的制备
[目的]本实验的目的是制备高免血清以检测猪伪狂犬病毒变异株疫苗注射后产生的特异性抗体。[方法]通过动物细胞培养猪伪狂犬病毒变异株，再制成灭活疫苗，对实验兔每隔一周多次进行灭活疫苗接种，并且对接种兔进行定期的采血，再通过PRV中和试验检测兔血清中和抗体效价。待实验兔体内产生一定水平的抗体时对其接种Bartha株活疫苗，再次抽取兔血样，检测其中和效价。 [结果]实验兔血清抗体水平在注射灭活苗后一直处于较低状态，达不到25的效价；在免疫活疫苗后，个别兔血清抗体水平达到26的效价，其余兔只仍需进一步免疫以获得合格高免血清。 [结论]接种灭活猪伪狂犬病毒基因缺失苗在实验兔体内产生的抗体效价水平不高，可通过注射bartha活疫苗提高抗体效价。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论） 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1实验材料 3
1.1.2主要试剂 3
1.1.3主要仪器 3
1.2方法 3
1.2.1猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LAA株）生产工艺概述 3
1.2.2免疫程序 4
1.2.2.1猪伪狂犬病毒检测 4
1.2.2.2相关溶液的配制 4
1.2.3兔血清抗体效价的检测5
1.2.3.1采血 5
1.2.3.2 血清抗体效价的测定5
1.2.4 猪伪狂犬病病毒基因缺失活疫苗的免疫程序5
1.2.5 兔血清抗体效价的测定（活苗）5
2 结果与分析6
2.1 灭活疫苗产生的中和抗体效价测定6
2.2 活疫苗产生的中和抗体效价测定6
2.3 PRV中和试验(固定血清稀释病毒法)结果分析 7
3讨论 7
3.1实验对象选用新西兰大白兔 7
3.2活疫苗协助灭活苗对血清抗体效价的影响 7
3.3加入免疫增强剂提高兔体内血清抗体效价 8
致谢8
参考文献8 猪伪狂犬病毒变异株高免血清的制备 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
引言
猪伪狂犬病是由疱疹病毒科α亚科中的疱疹病毒Ⅰ型所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒以及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病[1]，以猪感染最为普遍。在猪场，猪伪狂犬病毒能够经过已感染的猪对外排毒以及被猪伪狂犬病毒污染的人员及用具而传染给健康猪，从而对猪场造成严重失。
猪伪狂犬病的临床症状：大多数情况下，有着不同年龄、性别差别的猪发生感染时, 往往会表现出一些不同的症状。①新生仔猪发生感染时，常伴随有4042 ℃高热，口和鼻一般有多量泡沫样黏液流出，甚至部分发生呕吐和腹泻等症状，在腹部和股部会出现红粟粒斑点, 仔猪常出现步态不稳, 关节逐渐僵直, 易跌倒、瘫痪, 也有一些发生间歇性抽搐，失去饲养价值。②母猪发生感染时, 相较而言妊娠母猪发病率较高, 常常表现出母猪流产, 产死、弱胎以及木乃伊胎, 同时伴有全身症状, 病猪多伴有体温升高、食欲下降等症状, 病猪一般来说不发生死亡，但可见产出的仔猪大小不均, 身体虚弱。③大多数育肥猪发病症状伴有高热、食欲下降和呼吸艰难等, 部分会出现神经上的症状, 大多都不发生死亡。④而成年猪的临床症状不明显, 仅仅出现体温稍高, 却并不会死亡, 但耐过康复后将长期带毒、排毒。
猪伪狂犬病的流行特征有：在21世纪初,猪伪狂犬病在我国基本处于未免疫状态,曾一度呈现出猪伪狂犬病的爆发。大约到2005年, 多数猪场已高度重视该病并对该病实施了免疫, 暴发该病的猪场显著减少, 进而转入散发状况。但到2010年后, 该病又重新在全国各地的养猪场开始频繁暴发流行 (也包括已免疫猪群) , 同时在感染猪场出现犬猫的死亡。目前, 疫情已经缓解了许多, 但在规模猪场特别是中小猪场及散养猪群中仍存在散在性发生和流行[2]。 从各地伪狂犬流行猪场分离得到的猪伪狂犬病毒毒株经过PCR测序后发现新分离的伪狂犬毒株与Bartha株相比较出现了基因变异现象[3]。有研究表明, 从河南、山东等地发病猪群中分离得到的强毒猪伪狂犬病毒野毒通过基因全序列测序对比分析, 发现猪伪狂犬病病毒野毒株的gE、gC、gB和TK等多个基因序列均表现出了不同程度上的变异[4]。gB和gC等基因的免疫原性基因等一些重要功能已经发生了变异, 利用现存在的猪伪狂犬病毒疫苗来免疫接种猪群已经不能完完全全地杜绝流行新猪伪狂犬病毒毒株的感染。攻毒保护试验显示传统疫苗毒株对新分离毒株的免疫保护能力相对已有所下降, 但在生产实践中也发现当前使用的猪伪狂犬病疫苗对猪伪狂犬强毒株依然有一定程度上的保护。
目前关于猪伪狂犬病的最有效的防控办法是疫苗免疫，目前临床上应用最多的疫苗是PRV 基因缺失疫苗。PRV基因工程缺失疫苗其本质是运用基因工程这项技术，在基因组中通过缺失或者插进去一段、两段或者几段序列使猪伪狂犬病毒的一些基因不能够正常表达，从而可以致弱猪伪狂犬病毒，又可以保留本身较强的免疫原性而制出的基因缺失疫苗。经过研究目前已经能够构建出不同的单基因、双基因以及多基因（三基因、四基因）PRV缺失疫苗。单基因缺失疫苗包括第一代基因缺失疫苗TK 基因缺失株[5、12]、市面上流通的商品苗gE 基因缺失苗Bartha 株[6]、gD 基因缺失疫苗株[7]、gG 基因缺失苗[8] 。双基因缺失苗包括TK/gC[13]双基因缺失活疫苗、TK/gG 双基因缺失活疫苗、TK/gE 双基因缺失活疫苗等，这类疫苗缺失重要的毒力TK基因，此外还缺失了一个编码非必须糖蛋白的基因，甚至更有一些疫苗在缺失双基因的条件下还插进一个报告基因LacZ+ 或者GFP（报告基因能够编码绿色的荧光蛋白，经过自身的催化作用而形成发光构造并且在蓝光的激发下会显示出绿色的荧光。与此同时，三基因、四基因缺失活疫苗[14]也在不断的改造构建中，其安全性较高，以便更好的刺激机体产生对PRV的保护性免疫作用。
本课题旨在制备高免血清以检测猪伪狂犬病毒变异株疫苗注射后产生的特异性抗体，通过培养病毒，制成猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗（LAA株，效价107.5TCID50/0.1ml）。以该疫苗对实验兔每隔一周进行免疫接种，并按期采血检测血清中抗体效价，并观察效价上升趋势，为制备猪伪狂犬病病毒变异株疫苗的研制做配套研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论） 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1实验材料 3
1.1.2主要试剂 3
1.1.3主要仪器 3
1.2方法 3
1.2.1猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LAA株）生产工艺概述 3
1.2.2免疫程序 4
1.2.2.1猪伪狂犬病毒检测 4
1.2.2.2相关溶液的配制 4
1.2.3兔血清抗体效价的检测5
1.2.3.1采血 5
1.2.3.2 血清抗体效价的测定5
1.2.4 猪伪狂犬病病毒基因缺失活疫苗的免疫程序5
1.2.5 兔血清抗体效价的测定（活苗）5
2 结果与分析6
2.1 灭活疫苗产生的中和抗体效价测定6
2.2 活疫苗产生的中和抗体效价测定6
2.3 PRV中和试验(固定血清稀释病毒法)结果分析 7
3讨论 7
3.1实验对象选用新西兰大白兔 7
3.2活疫苗协助灭活苗对血清抗体效价的影响 7
3.3加入免疫增强剂提高兔体内血清抗体效价 8
致谢8
参考文献8 猪伪狂犬病毒变异株高免血清的制备 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
引言
猪伪狂犬病是由疱疹病毒科α亚科中的疱疹病毒Ⅰ型所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒以及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病[1]，以猪感染最为普遍。在猪场，猪伪狂犬病毒能够经过已感染的猪对外排毒以及被猪伪狂犬病毒污染的人员及用具而传染给健康猪，从而对猪场造成严重失。
猪伪狂犬病的临床症状：大多数情况下，有着不同年龄、性别差别的猪发生感染时, 往往会表现出一些不同的症状。①新生仔猪发生感染时，常伴随有4042 ℃高热，口和鼻一般有多量泡沫样黏液流出，甚至部分发生呕吐和腹泻等症状，在腹部和股部会出现红粟粒斑点, 仔猪常出现步态不稳, 关节逐渐僵直, 易跌倒、瘫痪, 也有一些发生间歇性抽搐，失去饲养价值。②母猪发生感染时, 相较而言妊娠母猪发病率较高, 常常表现出母猪流产, 产死、弱胎以及木乃伊胎, 同时伴有全身症状, 病猪多伴有体温升高、食欲下降等症状, 病猪一般来说不发生死亡，但可见产出的仔猪大小不均, 身体虚弱。③大多数育肥猪发病症状伴有高热、食欲下降和呼吸艰难等, 部分会出现神经上的症状, 大多都不发生死亡。④而成年猪的临床症状不明显, 仅仅出现体温稍高, 却并不会死亡, 但耐过康复后将长期带毒、排毒。
猪伪狂犬病的流行特征有：在21世纪初,猪伪狂犬病在我国基本处于未免疫状态,曾一度呈现出猪伪狂犬病的爆发。大约到2005年, 多数猪场已高度重视该病并对该病实施了免疫, 暴发该病的猪场显著减少, 进而转入散发状况。但到2010年后, 该病又重新在全国各地的养猪场开始频繁暴发流行 (也包括已免疫猪群) , 同时在感染猪场出现犬猫的死亡。目前, 疫情已经缓解了许多, 但在规模猪场特别是中小猪场及散养猪群中仍存在散在性发生和流行[2]。 从各地伪狂犬流行猪场分离得到的猪伪狂犬病毒毒株经过PCR测序后发现新分离的伪狂犬毒株与Bartha株相比较出现了基因变异现象[3]。有研究表明, 从河南、山东等地发病猪群中分离得到的强毒猪伪狂犬病毒野毒通过基因全序列测序对比分析, 发现猪伪狂犬病病毒野毒株的gE、gC、gB和TK等多个基因序列均表现出了不同程度上的变异[4]。gB和gC等基因的免疫原性基因等一些重要功能已经发生了变异, 利用现存在的猪伪狂犬病毒疫苗来免疫接种猪群已经不能完完全全地杜绝流行新猪伪狂犬病毒毒株的感染。攻毒保护试验显示传统疫苗毒株对新分离毒株的免疫保护能力相对已有所下降, 但在生产实践中也发现当前使用的猪伪狂犬病疫苗对猪伪狂犬强毒株依然有一定程度上的保护。
目前关于猪伪狂犬病的最有效的防控办法是疫苗免疫，目前临床上应用最多的疫苗是PRV 基因缺失疫苗。PRV基因工程缺失疫苗其本质是运用基因工程这项技术，在基因组中通过缺失或者插进去一段、两段或者几段序列使猪伪狂犬病毒的一些基因不能够正常表达，从而可以致弱猪伪狂犬病毒，又可以保留本身较强的免疫原性而制出的基因缺失疫苗。经过研究目前已经能够构建出不同的单基因、双基因以及多基因（三基因、四基因）PRV缺失疫苗。单基因缺失疫苗包括第一代基因缺失疫苗TK 基因缺失株[5、12]、市面上流通的商品苗gE 基因缺失苗Bartha 株[6]、gD 基因缺失疫苗株[7]、gG 基因缺失苗[8] 。双基因缺失苗包括TK/gC[13]双基因缺失活疫苗、TK/gG 双基因缺失活疫苗、TK/gE 双基因缺失活疫苗等，这类疫苗缺失重要的毒力TK基因，此外还缺失了一个编码非必须糖蛋白的基因，甚至更有一些疫苗在缺失双基因的条件下还插进一个报告基因LacZ+ 或者GFP（报告基因能够编码绿色的荧光蛋白，经过自身的催化作用而形成发光构造并且在蓝光的激发下会显示出绿色的荧光。与此同时，三基因、四基因缺失活疫苗[14]也在不断的改造构建中，其安全性较高，以便更好的刺激机体产生对PRV的保护性免疫作用。
本课题旨在制备高免血清以检测猪伪狂犬病毒变异株疫苗注射后产生的特异性抗体，通过培养病毒，制成猪伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗（LAA株，效价107.5TCID50/0.1ml）。以该疫苗对实验兔每隔一周进行免疫接种，并按期采血检测血清中抗体效价，并观察效价上升趋势，为制备猪伪狂犬病病毒变异株疫苗的研制做配套研究。
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