猪流行性腹泻病毒分离及细胞盲传
猪流行性腹泻病毒分离及细胞盲传[20200507185743]
摘要：因目前PEDV病毒的变异较大，为了获得新的可适应细胞培养的PEDV病毒，从爆发腹泻的猪场采集疑似PEDV病例的小肠内容物30余份，对其进行RT-PCR检测，将检测结果为阳性的样品条带进行克隆、鉴定并送测序；从阳性样品中挑取3份在Vero细胞上进行了6代盲传，并进行PCR鉴定。检测结果在盲传的细胞中有PEDV病毒的增殖，盲传的病毒在F6出现了疑似的细胞病变，对照细胞正常，结果证明初步获得了可适应细胞的流行毒株，为疫苗的研究提供基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:PEDV；RT-PCR；盲传
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1细胞及菌种1
1.2主要仪器和试剂2
1.3病料处理2
1.4病毒核酸提取2
1.5核酸电泳 2
1.5.1核酸胶制备2
1.5.2加样及电泳仪使用2
1.6切胶回收连接2
1.7转化 3
1.8提取质粒酶切3
1.9PCR鉴定3
1.10 病毒的Vero细胞盲传及鉴定 3
2结果与分析3
2.1病毒的RT-PCR检测 3
2.2阳性克隆样品测序结果4
2.3酶切鉴定结果5
2.4病毒的分离培养5
3讨论6
致谢6
参考文献7
猪流行性腹泻病毒分离及细胞盲传
引言
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病 [1] 。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科（coronavirrdae）冠状病毒属（coronavirus）的成员。主要引起祝流行性腹泻。各种年龄、各个品种猪均可感染发病，哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发病率可达100%，成年母猪发病率为15%~90%。当前PED发生率居高不下，发病情况也越来越复杂，出现混合感染的现象时有发生，目前备受广大研 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
究者的重视 [2]。PEDV人工细胞培养困难，这一直是制约PEDV研究进展的一个重要因素。直到1988年，Hofmann等首次在培养液含胰酶的Vero细胞上成功繁殖出PEDV,并认为胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用增强了该病毒对Vero细胞的感染力 [3]。此后PEDV的分子生物学研究才得到了较快的发展。本实验根据PEDV的流行病学和分子生物学特征，对将30份疑似PEDV病例的小肠内容物进行RT-PCR检测，将阳性的样品进行病毒分离，接种在Vero细胞上盲传，然后通过普通RT-PCR检测进行鉴定，是否有病毒在Vero细胞上增殖以获得可以适应细胞的PEDV流行毒株。
1 材料与方法
1.1实验用细胞及菌种
Vero细胞、DH5α大肠杆菌由江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术中心保存。pMD18-T载体(购自大连宝生物)
1.2主要仪器和试剂
SW-CJ-2F超净工作台，苏州空气技术有限公司。恒温培养箱，德国binder公司。离心机，日本HITACHI公司。梯度PCR仪，德国耶拿分析仪器股份公司。恒温金属浴，卡尤迪生物科技有限公司。固体培养基原料由国药集团化学试剂有限公司生产。
1.3病料处理
向病料中分别加入1.5ml PBS并吹打混匀，分别分装到2.0ml EP管中，滴加PBS定容至2ml然后4200转离心30分钟，将得到的上清液用直径为0.22μm的注射式微孔滤膜正压滤过除菌，无菌滤液-20度冷冻保存。
1.4病毒核酸提取
先取制备好的小肠内容物稀释样品400ul,再取1.ml Buffer RL 向其中加入20ul 50×DDT；每200ul样品中加入350ul Buffer RL震匀，12000rpm,5min,4度离心；取400ul上清至gDNA Column12000rpm,1min,4度离心,弃gDNA Column；向滤液中加入等体积的70%乙醇，吹打混匀；转移至RNA Spin Column，12000rpm,5min,4度离心后弃去下层液；分别加500ul Buffer RNA，12000rpm,30s,4度离心；再分别加600ul Buffer RWB，12000rpm,30s,4度离心并重复该步骤一次；将试管空离2min,再将RNA Spin Column置于1.5mlEP管上，剪去EP管上的盖子，以便于离心；向管中加入20ul Rnase H2O,静置5min，12000rpm,2min,4度离心，以洗脱RNA。EP管底部收集得RNA提取物20ul。
RT-PCR采用TaKaRa公司一步RT-PCR试剂盒提取法，体系为20ul，其中RNA5ul，Forward GSP0.4ul，Reverse GSP0.4ul，2×one-step Mix 10ul,EasyScript One Mix0.4ul，R-free water3.8ul。并做阴性水对照。反应条件：循环参数分别为：94℃，预变性4min；再以94℃，变性30s、50℃，退火30s、72℃，延伸1min30s 30 次循环；最后72℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收。
PEDV检测用引物序列如下：
表1 中文标题，英文标题
TATGTCT *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
AACGGTTCTATTCCC PEDV-H1
CCTTATAGCCCTCTACAAGCA PEDV-H2
1.5核酸电泳
1.5.1核酸胶制备
称取0.5g琼脂糖粉末，倒入200ml锥形瓶中，向其中加入50mlTAE电泳缓冲液后微波炉加热40s冷却至55度后加入微量EB摇匀，再倒入放置好胶模和胶梳的制胶盒中，待其冷却凝固以备使用。
1.5.2加样及电泳仪使用
向胶上每孔加入10ul样品并向另外一孔加入5ul2000分子量的Marker。盖上电泳仪盖打开电源调时30min。用凝胶成像仪观察并保存结果。
1.6切胶回收连接
将胶放在切胶板上，用手术刀将紫外灯下发光的目的条带切下，回收到1.5mlEP管中，目标片段回收后立即与pMD18载体做连接反应。反应体系：Solution I5μl，回收产物 4.75μl，T载体 0.25μl，共10μl；混匀，16℃连接12小时。
1.7转化
从-70℃冰箱中取50μl感受态细胞悬液，冰上解冻。加入连接产物5μl轻轻弹匀,冰上放置30分钟后42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。向管中加入0.8ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。离心8000rpm，3min。弃上清并吹打重悬。将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12小时。培养12小时后，挑选单菌落转入液体培养基37℃培养10~12小时。
1.8提取质粒酶切
提取质粒步骤（试剂盒提取）：（1）向吸附柱中加入200μl Buffer CBS，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中备用；（2）取培养好的菌液4-6ml，8000rpm离心1min，弃尽上清，加入250μl Solution?I，用枪头充分悬浮细菌；3.加入250μl Solution?II，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次（不宜超过5min），是菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液（如果未能变得清亮，可能是菌体过多，裂解不彻底，应减少菌液量），澄清后加入350μl Solution?III，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5min，12000rpm离心10min；4将上一个步骤获得的上清转移到套放于2ml收集管内的DNA吸附柱中，室温6000rpm离心1min，取出DNA吸附柱，倒掉收集管中的废液；5.将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl W1 Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液后，重复用Wash Solution洗一次；6.倒掉收集管中的废液，12000rpm室温离心1min，彻底去除Wash Solution，打开盖室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；7.将DNA吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在DNA吸附柱膜中央加入50-100μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12000rpm室温离心1min，EP管中的液体即为含目的质粒的溶液。
摘要：因目前PEDV病毒的变异较大，为了获得新的可适应细胞培养的PEDV病毒，从爆发腹泻的猪场采集疑似PEDV病例的小肠内容物30余份，对其进行RT-PCR检测，将检测结果为阳性的样品条带进行克隆、鉴定并送测序；从阳性样品中挑取3份在Vero细胞上进行了6代盲传，并进行PCR鉴定。检测结果在盲传的细胞中有PEDV病毒的增殖，盲传的病毒在F6出现了疑似的细胞病变，对照细胞正常，结果证明初步获得了可适应细胞的流行毒株，为疫苗的研究提供基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:PEDV；RT-PCR；盲传
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1细胞及菌种1
1.2主要仪器和试剂2
1.3病料处理2
1.4病毒核酸提取2
1.5核酸电泳 2
1.5.1核酸胶制备2
1.5.2加样及电泳仪使用2
1.6切胶回收连接2
1.7转化 3
1.8提取质粒酶切3
1.9PCR鉴定3
1.10 病毒的Vero细胞盲传及鉴定 3
2结果与分析3
2.1病毒的RT-PCR检测 3
2.2阳性克隆样品测序结果4
2.3酶切鉴定结果5
2.4病毒的分离培养5
3讨论6
致谢6
参考文献7
猪流行性腹泻病毒分离及细胞盲传
引言
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病 [1] 。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科（coronavirrdae）冠状病毒属（coronavirus）的成员。主要引起祝流行性腹泻。各种年龄、各个品种猪均可感染发病，哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发病率可达100%，成年母猪发病率为15%~90%。当前PED发生率居高不下，发病情况也越来越复杂，出现混合感染的现象时有发生，目前备受广大研 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
究者的重视 [2]。PEDV人工细胞培养困难，这一直是制约PEDV研究进展的一个重要因素。直到1988年，Hofmann等首次在培养液含胰酶的Vero细胞上成功繁殖出PEDV,并认为胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用增强了该病毒对Vero细胞的感染力 [3]。此后PEDV的分子生物学研究才得到了较快的发展。本实验根据PEDV的流行病学和分子生物学特征，对将30份疑似PEDV病例的小肠内容物进行RT-PCR检测，将阳性的样品进行病毒分离，接种在Vero细胞上盲传，然后通过普通RT-PCR检测进行鉴定，是否有病毒在Vero细胞上增殖以获得可以适应细胞的PEDV流行毒株。
1 材料与方法
1.1实验用细胞及菌种
Vero细胞、DH5α大肠杆菌由江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术中心保存。pMD18-T载体(购自大连宝生物)
1.2主要仪器和试剂
SW-CJ-2F超净工作台，苏州空气技术有限公司。恒温培养箱，德国binder公司。离心机，日本HITACHI公司。梯度PCR仪，德国耶拿分析仪器股份公司。恒温金属浴，卡尤迪生物科技有限公司。固体培养基原料由国药集团化学试剂有限公司生产。
1.3病料处理
向病料中分别加入1.5ml PBS并吹打混匀，分别分装到2.0ml EP管中，滴加PBS定容至2ml然后4200转离心30分钟，将得到的上清液用直径为0.22μm的注射式微孔滤膜正压滤过除菌，无菌滤液-20度冷冻保存。
1.4病毒核酸提取
先取制备好的小肠内容物稀释样品400ul,再取1.ml Buffer RL 向其中加入20ul 50×DDT；每200ul样品中加入350ul Buffer RL震匀，12000rpm,5min,4度离心；取400ul上清至gDNA Column12000rpm,1min,4度离心,弃gDNA Column；向滤液中加入等体积的70%乙醇，吹打混匀；转移至RNA Spin Column，12000rpm,5min,4度离心后弃去下层液；分别加500ul Buffer RNA，12000rpm,30s,4度离心；再分别加600ul Buffer RWB，12000rpm,30s,4度离心并重复该步骤一次；将试管空离2min,再将RNA Spin Column置于1.5mlEP管上，剪去EP管上的盖子，以便于离心；向管中加入20ul Rnase H2O,静置5min，12000rpm,2min,4度离心，以洗脱RNA。EP管底部收集得RNA提取物20ul。
RT-PCR采用TaKaRa公司一步RT-PCR试剂盒提取法，体系为20ul，其中RNA5ul，Forward GSP0.4ul，Reverse GSP0.4ul，2×one-step Mix 10ul,EasyScript One Mix0.4ul，R-free water3.8ul。并做阴性水对照。反应条件：循环参数分别为：94℃，预变性4min；再以94℃，变性30s、50℃，退火30s、72℃，延伸1min30s 30 次循环；最后72℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收。
PEDV检测用引物序列如下：
表1 中文标题，英文标题
TATGTCT *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
AACGGTTCTATTCCC PEDV-H1
CCTTATAGCCCTCTACAAGCA PEDV-H2
1.5核酸电泳
1.5.1核酸胶制备
称取0.5g琼脂糖粉末，倒入200ml锥形瓶中，向其中加入50mlTAE电泳缓冲液后微波炉加热40s冷却至55度后加入微量EB摇匀，再倒入放置好胶模和胶梳的制胶盒中，待其冷却凝固以备使用。
1.5.2加样及电泳仪使用
向胶上每孔加入10ul样品并向另外一孔加入5ul2000分子量的Marker。盖上电泳仪盖打开电源调时30min。用凝胶成像仪观察并保存结果。
1.6切胶回收连接
将胶放在切胶板上，用手术刀将紫外灯下发光的目的条带切下，回收到1.5mlEP管中，目标片段回收后立即与pMD18载体做连接反应。反应体系：Solution I5μl，回收产物 4.75μl，T载体 0.25μl，共10μl；混匀，16℃连接12小时。
1.7转化
从-70℃冰箱中取50μl感受态细胞悬液，冰上解冻。加入连接产物5μl轻轻弹匀,冰上放置30分钟后42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。向管中加入0.8ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。离心8000rpm，3min。弃上清并吹打重悬。将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12小时。培养12小时后，挑选单菌落转入液体培养基37℃培养10~12小时。
1.8提取质粒酶切
提取质粒步骤（试剂盒提取）：（1）向吸附柱中加入200μl Buffer CBS，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中备用；（2）取培养好的菌液4-6ml，8000rpm离心1min，弃尽上清，加入250μl Solution?I，用枪头充分悬浮细菌；3.加入250μl Solution?II，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次（不宜超过5min），是菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液（如果未能变得清亮，可能是菌体过多，裂解不彻底，应减少菌液量），澄清后加入350μl Solution?III，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5min，12000rpm离心10min；4将上一个步骤获得的上清转移到套放于2ml收集管内的DNA吸附柱中，室温6000rpm离心1min，取出DNA吸附柱，倒掉收集管中的废液；5.将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl W1 Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液后，重复用Wash Solution洗一次；6.倒掉收集管中的废液，12000rpm室温离心1min，彻底去除Wash Solution，打开盖室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；7.将DNA吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在DNA吸附柱膜中央加入50-100μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12000rpm室温离心1min，EP管中的液体即为含目的质粒的溶液。
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