猪流行性腹泻病毒（PEDV）TX毒株对不同日龄仔猪攻毒模型的建立
猪流行性腹泻病毒（PEDV）TX毒株对不同日龄仔猪攻毒模型的建立[20200507191647]
摘要：猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起以严重腹泻、呕吐、脱水、酸中毒为主要特征的猪病毒性肠道传染病。该病是目前我国养猪业最严重的病毒性腹泻传染病之一，特别针对10日龄以内的仔猪，发病率高，致死率高。本实验旨在通过从江苏地区某猪场的发病猪中分离并鉴定出一株猪流行性腹泻病毒流行毒株，并测定该毒株对3日龄及10日龄的未吃过初乳的仔猪的半数致死量，为将来流行性腹泻疫苗免疫效果的评价奠定基础。
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关键字:猪流行性腹泻病毒；分离鉴定；进化树分析；半数致死量；攻毒模型
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1实验材料与方法 5
1.1实验材料 5
1.1.1实验动物 5
1.1.2 PEDV TX株小肠毒 5
1.1.3实验器材 5
1.1.4实验试剂 5
1.2实验方法 5
1.2.1猪流行性腹泻病毒TX株的获取与鉴定5
1.2.1.1病料的采集 5
1.2.1.2 样品处理 5
1.2.1.3 RNA病毒的提取与反转录 6
1.2.1.4 病毒的PCR鉴定 6
1.2.1.5 扩增产物的核酸电泳 7
1.2.1.5.1 1%核酸胶的制备 7
1.2.1.5.2 核酸电泳 7
1.2.1.6 目的条带回收7
1.2.1.7 目的条带连接载体7
1.2.1.8 质粒转化及测序7
1.2.1.9 序列分析8
1.2.2 PEDV TX株病毒对3日龄仔猪半数感染量测定试验8
1.2.2.1仔猪的看护与喂养8
1.2.2.2 病毒的稀释8
1.2.2.3 实验猪的分组与攻毒8
1.2.2.4 攻毒后观察9
1.2.2.5 攻毒后病料的检测9
1.2.2.6 PEDV TX株对3日龄仔猪半数感染量的计算 9
1.2.3 PEDV TX株病毒对10日龄仔猪半数感染量测定试验9
1.2.3.1 仔猪的看护与喂养9
1.2.3.2 病毒的稀释 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
10
1.2.3.3 实验猪的分组与攻毒10
1.2.3.4 攻毒后观察10
1.2.3.5 攻毒后病料的检测10
1.2.3.6 PEDV TX株对10日龄仔猪半数感染量的计算10
2.结果与分析 10
2.1猪流行性腹泻病毒TX株的获取与鉴定 10
2.1.1分离病毒的PCR鉴定结果10
2.1.2 进化树分析11
2.2 PEDV TX株病毒对3日龄仔猪半数感染量测定试验12
2.2.1 试验猪攻毒后72h及以后发病情况12
2.2.2 试验猪攻毒后病料检测结果13
2.2.3 试验猪死亡后剖检照片13
2.2.4 PEDV TX株对3日龄仔猪半数感染量的计算 13
2.2.5 结论14
2.3 PEDV TX株病毒对10日龄仔猪半数感染量测定试验14
2.3.1试验猪攻毒后72h及以后发病情况14
2.3.2试验猪攻毒后病料检测结果15
2.3.3 试验猪死亡后剖检照片15
2.3.4 PEDV TX株对10日龄仔猪半数感染量的计算15
2.3.5 结论16
3.讨论 16
3.1 PEDV TX株的分离鉴定结果和意义16
3.2 3日龄仔猪饲养过程中出现大量提前死亡仔猪原因的讨论及解决方法 16
3.3 攻毒模型的建立16
3.3 两次攻毒实验结果一致的讨论16
3.4 攻毒模型的建立17
致谢 17
参考文献 17
猪流行性腹泻病毒（PEDV）TX毒株对
不同日龄仔猪攻毒模型的建立
引言
引言
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diar-rhea virus, PEDV)引起的一种以严重腹泻、呕吐、脱水、酸中毒为主要特征的猪病毒性肠道传染病[1，2,8]。
1971年英国首次报道了PED的出现[10]，之后逐渐在世界上大部分地区开始流行。1977年，比利时的Pensaert等首先从病料中分离出一株与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）不同的病毒，并将其命名为冠状病毒（CVL）CV777株[12,13]，即第一株PEDV。我国于20世纪80年代初开始陆续流行本病，并于1980年首次分离到PEDV[4]。
PED在冬季发病率远高于夏季，可感染各年龄的猪，但年龄越大发病率和致死率越低。当前在我国主要对10日龄以内仔猪造成主要影响，发病率、致死率高，对养猪业造成巨大的损失[8]。PED发生率居高不下,并且常与其他病呈混合感染[5]。
当前我国防治猪流行性腹泻病毒（PEDV）的常用疫苗是以CV777为疫苗株，不能对我国当前的流行毒株起有效免疫保护作用。本研究通过建立动物攻毒模型为将来评价在流行性腹泻新疫苗中添加佐剂以提高猪对流行性腹泻免疫力试验奠定基础。新的流行性腹泻疫苗若能对当前流行毒株其保护作用，即可大量减少仔猪感染PEDV的风险，不仅可 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
以带来可观的收益，同时也为养猪行业带来巨大利益。
1.实验材料与方法
1．1 实验材料：
1．1．1 实验动物：
1．1．1．1 分离提取实验：泰兴某猪场2014年3月发腹泻疾病的仔猪
1．1．1．2 3日龄仔猪攻毒实验：21头1日龄仔猪，购自丹阳云立牧业有限公司，未吃初乳
1．1．1．3 10日龄仔猪攻毒实验：23头10日龄仔猪，购自丹阳云立牧业有限公司，未吃初乳
1．1．2 PEDV TX株小肠毒：2014年3月份分离于泰兴某猪场，经1日龄未吃初乳仔猪复壮1代，经鉴定无其他病原污染。
1．1．3 实验器材：
手术刀具一套；一次性塑料手套；乳胶手套；涡旋混匀器(Crystal，型号：HYQ-2121A) ；干式恒温器（又称金属浴）（杭州朗基科学仪器有限公司，型号：B025）
梯度PCR仪（Biometra）；离心机（HITACHI，型号：CT15RE）；
超净台（AIRTECH，型号：BHC-1000II）；移液枪（Eppendorf Research plu）；
手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：LX-100）；
计时器（MDBIO）；冰箱（海尔，型号：BCD-649WE,温度：-17/4℃）；
精密电子天平（上海良平仪器仪表有限公司，型号：JA1003）；抽风机（乐田牌）
美的微波炉；Taron核酸电泳仪；研磨器；各型号EP管；EP管；EP管盒；冰盒；尼康相机；注射针头若干；塑料奶瓶；蒙牛牛奶若干箱；欧世蒙牛优品装婴儿配方奶粉（900g装）；保温灯；足量垫草；猪笼若干；塑料饲养箱若干；加热水壶；手术刀具一套；
1．1．4实验试剂：
质粒小量制备试剂盒（GENERAY BIOTECH,开封日期：2014.3.20）
胶回收试剂盒（Axygen Biosciences）
新配PBS、Iso plus、异丙醇、75%无水乙醇、DEPC水溶液
摘要：猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起以严重腹泻、呕吐、脱水、酸中毒为主要特征的猪病毒性肠道传染病。该病是目前我国养猪业最严重的病毒性腹泻传染病之一，特别针对10日龄以内的仔猪，发病率高，致死率高。本实验旨在通过从江苏地区某猪场的发病猪中分离并鉴定出一株猪流行性腹泻病毒流行毒株，并测定该毒株对3日龄及10日龄的未吃过初乳的仔猪的半数致死量，为将来流行性腹泻疫苗免疫效果的评价奠定基础。
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关键字:猪流行性腹泻病毒；分离鉴定；进化树分析；半数致死量；攻毒模型
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摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1实验材料与方法 5
1.1实验材料 5
1.1.1实验动物 5
1.1.2 PEDV TX株小肠毒 5
1.1.3实验器材 5
1.1.4实验试剂 5
1.2实验方法 5
1.2.1猪流行性腹泻病毒TX株的获取与鉴定5
1.2.1.1病料的采集 5
1.2.1.2 样品处理 5
1.2.1.3 RNA病毒的提取与反转录 6
1.2.1.4 病毒的PCR鉴定 6
1.2.1.5 扩增产物的核酸电泳 7
1.2.1.5.1 1%核酸胶的制备 7
1.2.1.5.2 核酸电泳 7
1.2.1.6 目的条带回收7
1.2.1.7 目的条带连接载体7
1.2.1.8 质粒转化及测序7
1.2.1.9 序列分析8
1.2.2 PEDV TX株病毒对3日龄仔猪半数感染量测定试验8
1.2.2.1仔猪的看护与喂养8
1.2.2.2 病毒的稀释8
1.2.2.3 实验猪的分组与攻毒8
1.2.2.4 攻毒后观察9
1.2.2.5 攻毒后病料的检测9
1.2.2.6 PEDV TX株对3日龄仔猪半数感染量的计算 9
1.2.3 PEDV TX株病毒对10日龄仔猪半数感染量测定试验9
1.2.3.1 仔猪的看护与喂养9
1.2.3.2 病毒的稀释 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
10
1.2.3.3 实验猪的分组与攻毒10
1.2.3.4 攻毒后观察10
1.2.3.5 攻毒后病料的检测10
1.2.3.6 PEDV TX株对10日龄仔猪半数感染量的计算10
2.结果与分析 10
2.1猪流行性腹泻病毒TX株的获取与鉴定 10
2.1.1分离病毒的PCR鉴定结果10
2.1.2 进化树分析11
2.2 PEDV TX株病毒对3日龄仔猪半数感染量测定试验12
2.2.1 试验猪攻毒后72h及以后发病情况12
2.2.2 试验猪攻毒后病料检测结果13
2.2.3 试验猪死亡后剖检照片13
2.2.4 PEDV TX株对3日龄仔猪半数感染量的计算 13
2.2.5 结论14
2.3 PEDV TX株病毒对10日龄仔猪半数感染量测定试验14
2.3.1试验猪攻毒后72h及以后发病情况14
2.3.2试验猪攻毒后病料检测结果15
2.3.3 试验猪死亡后剖检照片15
2.3.4 PEDV TX株对10日龄仔猪半数感染量的计算15
2.3.5 结论16
3.讨论 16
3.1 PEDV TX株的分离鉴定结果和意义16
3.2 3日龄仔猪饲养过程中出现大量提前死亡仔猪原因的讨论及解决方法 16
3.3 攻毒模型的建立16
3.3 两次攻毒实验结果一致的讨论16
3.4 攻毒模型的建立17
致谢 17
参考文献 17
猪流行性腹泻病毒（PEDV）TX毒株对
不同日龄仔猪攻毒模型的建立
引言
引言
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diar-rhea virus, PEDV)引起的一种以严重腹泻、呕吐、脱水、酸中毒为主要特征的猪病毒性肠道传染病[1，2,8]。
1971年英国首次报道了PED的出现[10]，之后逐渐在世界上大部分地区开始流行。1977年，比利时的Pensaert等首先从病料中分离出一株与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）不同的病毒，并将其命名为冠状病毒（CVL）CV777株[12,13]，即第一株PEDV。我国于20世纪80年代初开始陆续流行本病，并于1980年首次分离到PEDV[4]。
PED在冬季发病率远高于夏季，可感染各年龄的猪，但年龄越大发病率和致死率越低。当前在我国主要对10日龄以内仔猪造成主要影响，发病率、致死率高，对养猪业造成巨大的损失[8]。PED发生率居高不下,并且常与其他病呈混合感染[5]。
当前我国防治猪流行性腹泻病毒（PEDV）的常用疫苗是以CV777为疫苗株，不能对我国当前的流行毒株起有效免疫保护作用。本研究通过建立动物攻毒模型为将来评价在流行性腹泻新疫苗中添加佐剂以提高猪对流行性腹泻免疫力试验奠定基础。新的流行性腹泻疫苗若能对当前流行毒株其保护作用，即可大量减少仔猪感染PEDV的风险，不仅可 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
以带来可观的收益，同时也为养猪行业带来巨大利益。
1.实验材料与方法
1．1 实验材料：
1．1．1 实验动物：
1．1．1．1 分离提取实验：泰兴某猪场2014年3月发腹泻疾病的仔猪
1．1．1．2 3日龄仔猪攻毒实验：21头1日龄仔猪，购自丹阳云立牧业有限公司，未吃初乳
1．1．1．3 10日龄仔猪攻毒实验：23头10日龄仔猪，购自丹阳云立牧业有限公司，未吃初乳
1．1．2 PEDV TX株小肠毒：2014年3月份分离于泰兴某猪场，经1日龄未吃初乳仔猪复壮1代，经鉴定无其他病原污染。
1．1．3 实验器材：
手术刀具一套；一次性塑料手套；乳胶手套；涡旋混匀器(Crystal，型号：HYQ-2121A) ；干式恒温器（又称金属浴）（杭州朗基科学仪器有限公司，型号：B025）
梯度PCR仪（Biometra）；离心机（HITACHI，型号：CT15RE）；
超净台（AIRTECH，型号：BHC-1000II）；移液枪（Eppendorf Research plu）；
手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：LX-100）；
计时器（MDBIO）；冰箱（海尔，型号：BCD-649WE,温度：-17/4℃）；
精密电子天平（上海良平仪器仪表有限公司，型号：JA1003）；抽风机（乐田牌）
美的微波炉；Taron核酸电泳仪；研磨器；各型号EP管；EP管；EP管盒；冰盒；尼康相机；注射针头若干；塑料奶瓶；蒙牛牛奶若干箱；欧世蒙牛优品装婴儿配方奶粉（900g装）；保温灯；足量垫草；猪笼若干；塑料饲养箱若干；加热水壶；手术刀具一套；
1．1．4实验试剂：
质粒小量制备试剂盒（GENERAY BIOTECH,开封日期：2014.3.20）
胶回收试剂盒（Axygen Biosciences）
新配PBS、Iso plus、异丙醇、75%无水乙醇、DEPC水溶液
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