亳菊中绿原酸和木樨草苷的含量测定(附件)
摘 要目的：本文对亳菊中的木犀草苷以及绿原酸进行含量测定，并建立亳菊中木犀草苷和绿原酸的HPLC检测方法。方法：采用的色谱条件为：色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，流速1ml·min-1，进样量为10 μL，柱温为25℃，检测波长340 nm。结果：实验结果表明，木犀草苷在0.025-1.100（ug/ml)范围内线性良好；绿原酸在0.055-5.000（ug/ml）范围内线性良好；精密度试验RSD分别为0.5 %、0.03 %（n=6），表明精密度良好；重复性试验RSD为0.29%、，平均含量为0.43 mg·g-1 ，0.53 mg·g-1RSD为表明重复性良好；稳定性试验RSD为0.45%，0.25%，表明稳定性良好；平均加样回收率为99.9%，RSD为0.88%。结论：本实验所建立的方法操作简单、结果准确、可靠、重现性好，可用于亳菊的质量控制。关健词：亳菊；木犀草素；绿原酸；含量测定；高效液相色谱AbstractIn this study , HPLC coupled with diode array detection was successfully developed to determine Lutelin and chlorogenic acid of Chrysanthemum morifolium Ramat. The chromatographic conditions for chromatographic column for DiamonsiL C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 m) as the mobile phase acetonitrile and 0.1% orthophosphoric acid (12: 88), The flow rate was 1.0 ml min-1, the sample injection volume was 10 μL and the column and sample temperature were at 25 ?C. The DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensit
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88), The flow rate was 1.0 ml min-1, the sample injection volume was 10 μL and the column and sample temperature were at 25 ?C. The DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensity. Experimental results show that luteolin was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear and that chlorogenic acid was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear; it showed good precision with RSD 0.5%; In repeatability test, average content is 0.43mg·g-1 ( RSD = 0.5%),which indicated good repeatability; It also showed good stability with RSD=0.48%; In recovery test, the average recovery rate was 99.9%, and the RSD was 0.88%. The method established in this paper is simple, reliable and reproducible, and wich could be used for the quality control of Chrysanthemum morifolium Ramat.Key words: Chrysanthemum morifolium Ramat; Lutelin; chlorogenic acid; determination; HPLC1 概述1.1 菊花的国内外发展概况 21.2 菊花的资源分布 21.3 菊花的产地加工方法 31.4 菊花的主要化学成分 31.4.1 挥发油类 31.4.2 黄酮类化合物 31.4.3 有机酸类 41.4.4 氨基酸 41.4.5 微量元素 51.4.6 其它 51.5 菊花的主要药理活性 61.5.1 抗炎作用 71.5.2 抗菌作用 71.5.3 抗氧化作用 71.5.4 心血管保护作用 71.5.5 抗肿瘤作用 81.5.6抗病毒作用 91.5.7 降脂作用 91.5.8 抗诱变作用 91.5.9 驱铅作用 91.5.10 免疫调节作用 91.6 木犀草苷的概述 91.6.1 木犀草苷的理化性质 91.6.2 木犀草苷的来源 101.6.4 木犀草苷的药理活性 111.6 绿原酸的概述 121.6.1 绿原酸的理化性质 121.6.2 绿原酸的来源 121.6.4 绿原酸的药理活性 131.8 高效液相色谱法的概述 132 实验研究2.1 仪器和试剂 152.1.1 仪器 152.1.2 试剂 152.2 实验方法与结果 152.2.1 色谱条件 152.2.2 对照品溶液制备 162.2.3 供试品溶液的制备 172.2.4 线性关系考察 172.2.5 精密度试验 172.2.6 稳定性试验 172.2.7 重复性试验 172.2.8 加样回收率试验 192.2.9 样品的测定 202.3 讨论 20结论 21参考文献 22致谢 251 概述1.1 选题背景 亳菊亳州药农家家都有种植菊花的习惯轻，质柔润。气清香，味甘，微苦。菊化学成分包括挥发油类、黄酮类、有机酸类、氨基酸类、糖类及微量元素等[1,2]。LC、HPLC、GC- MS、FT-IR 、1 H-NMR以及电化学指纹图谱等现代多种分析方法已被使用在亳菊的鉴定、鉴别和含量测定中。但对道地药材亳菊的专属化学成分和质量评价等方面的研究工作尚显不足，特别是其与目前充斥市场的替代品大亳菊的鉴别方法研究还有待于进一步深入，因此本文采用HPLC对亳菊中的绿原酸和木樨草苷进行含量测定。1.2 菊花的国内外发展概况菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium.的干燥头状花序，是一种传统药食同源的药材，原产于我国，有300多年的栽培历史。春秋时《尔雅》中即有记载。而后在《札记.月令篇》中记有“季秋之月，鞠有黄华”。《埠雅》则日：“菊本作鞠，鞠从鞠，鞠穷也。”菊又名节华，《本草纲目》云：“女节，女华，菊华之名也。治蔷，日精，菊根之名也[3,4]。有研究认为[5]，我国宋朝以前的药用菊花取之于野生品，后经自然选择和人工的栽培选育，至明、清时期逐渐形成了一些优良的药用菊花品种，其产地也趋于固定，如安徽亳县的毫菊，安徽滁州的滁菊、黄山的贡菊，浙江的杭菊等[6]。目前我国药用菊花现有8个产区，长江以南产区的杭白菊、贡菊是以饮用为主，而长江以北产区的滁菊、亳菊、济菊、祁菊、怀菊均以药用为主。在诸多产地所产的药用菊花中，被公认为地道药材的为亳菊、滁菊、贡菊和杭菊及并称中国四大名菊被药典收载[7]。 亳菊在我国具有悠久的栽培历史，其与安徽地区的滁菊、杭菊，河南地区的怀菊，河北地区的祁菊，山东地区的济菊，都是国内享有名誉的茶用菊[8] 。亳菊具有较高茶用价值，同时其具有延年益寿的神奇功效，《补农书》载：“甘菊性甘温，久服最有益”。元代《本草衍义补遗》中记载：菊“花能补阴”。李时珍《本草纲目》中道：“菊能朱孺之皆以服菊成仙”[9] 。可见亳菊的功效之神奇。1.2 菊花的资源分布 菊花目前我国药用菊花现有8个产区，长江以南产区的杭白菊、而长江以北产区的滁菊、亳菊、济菊、祁菊、怀菊均以药用为主。在诸多产地所产的药用菊花中，被公认为地道药材的为亳菊、滁菊、贡菊和杭菊及并称中国四大名菊被药典收载[10] 。 滁菊主产于滁州，属安徽省四大著名道地药材(毫白芍、滁菊花、铜陵凤丹皮、宣木瓜)之一。 “滁菊”之名最早现于清.光绪二十年《滁州志》：“大柳镇产的菊花饮之，可以清热，名日滁菊，颇为药商所重。”滁菊在清朝光绪元年被朝廷纳为贡品，故有“滁州贡菊”之称。滁菊的药用价值曾得到中医药界的高度肯定。 杭菊为药茶两用的菊花，品种主要有杭白菊、杭黄菊两种，杭黄菊习惯于药用，而杭白菊原供茶用，但随着近代中医药发展，杭白菊也已成为药茶兼用之品。杭白菊属浙江道地药材“浙八味”(白术、白芍、浙贝母、杭白菊、延胡索、玄参、览麦冬、温郁金)之一[4]。杭菊首载于明代(公元1573年-1621年)《万历嘉善县志》：“黄茶菊以紫蒂为佳。” 杭菊栽培历史悠久，主产于浙江桐乡等地。其最早关于产地的记载为明末《食物宜忌》中的“海宁”。《补农书》中首次记载“桐乡”产菊花，而后《本草新编》中也出现“杭人多半作茶饮”的记载，《本草纲目拾遗》中所载的产地有“杭州”、“临安”等。 黄山贡菊原名为“徽州贡菊”，也称“徽菊”，贡菊发源地为安徽黄山市县金竹岭村，根据《款县志》记载，其种植始于宋代。因于清代光绪年间被作为贡品献给皇帝，故名“贡菊”，是黄山道地名贵中药材之一。贡菊品质优良，集色、香、味、形于一体，兼有观赏价值、药用价值及茶用价值，为药用和茶用之佳品[12]。毫菊主产于安徽毫州、涡阳一带，亳菊的栽培历史在清朝时引自亳州；祁菊据1936年赵橘黄先生所著的《祁州药志》介绍，也是移自亳菊或怀菊的产地。怀菊形态特征与亳菊完全-致，也有人认为是引自亳州。优特药材，是品质优良，功效独特，驰名中外，开发利用前景广阔的药材。据《中华大辞典》载:"白菊主产安徽亳县，称亳菊，品质最佳";《中药志》称亳菊花、滁菊花在药菊中品质最佳；2世纪中药巨著《中华本草》，也称亳菊和滁菊品质最优[9]。 1.3 菊花的产地加工方法菊花作为常用中药，使用量大，产地多，加工方法各异。中国菊花的药用类群通过人工长期栽培选育已形成一些相对稳定的栽培变种。目前我国菊花药用类群有9个栽培变种，分别为贡菊、湖菊、小白菊、大白菊、小黄菊、滁菊、毫菊、大牙马、大怀菊。不同品种菊花中活性成分含量很不相同，同一品种不同产地的菊花之间差异也很明显，加工方法也对成分组成、特别是有效成分含量有明显的影响。刘金旗等[24] 对菊花中黄酮普的含量进行了分析。从含量结果分析，毫菊、滁菊中金合欢素-7-O-D葡萄糖普的含量明显高于芹菜素-7-O-3-D-葡萄糖普，杭菊和贡菊则相反，这可能与菊花的产地有关。毫菊、滁菊产于长江以北，杭菊、贡菊产于长江以南，从济菊与祁菊的结果分析，也有这种趋势。李卫文[11]等对毫菊采后加工工艺进行研究，于晴天露水千后随机采收半开放的毫菊头状花序，分别置于阴凉通风处阴干，60, 70, 80, 90和100℃烘干、微波杀青烘干，蒸汽杀青烘干；用HPLC法，以绿原酸、木犀草昔和3,5- O-二咖啡酸基奎宁酸等3种有效成分含量分别达到0.20%，0.08%和0.70%作为检测指标，对相同栽培管理条件下，不同采收加工方法处理的毫菊供试品进行有效成分含量的检测。研究结果显示，阴干的毫菊中3种有效成分含量最高，分别达到0.58%, 0.08%和2.64%；烘干加工方法中，70℃烘干的供试品中3种有效成分含量最高，随温度升高，3种有效成分含量逐渐降低，其中木犀草昔含量无法达到标准;微波杀青烘干法处理的毫菊中仅能检测到微量的3,5-O-二咖啡酞基奎宁酸，无法检测到绿原酸和木犀草昔两种成分；蒸汽杀青烘干法处理的毫菊中3种有效成分含量都普遍低，均达不到标准。目前菊花产业生产的加工方法多参考杭白菊，采用蒸汽杀青烘干法或烘干法，但由于不同品种菊花的花序形态构造的差异，加工工艺对毫菊有效成分含量影响较大[13]。本试验结果显示阴干处理郎毫菊中3种有效成分含量最高，均达到药典的标准，为毫菊适宜的加工方法。1.4 菊花的主要化学成分中药菊花的主要化学成分是以绿原酸为代表的有机酸，以木犀草素为代表的黄酮类化合物，以及包含单砧[15]、倍半砧的挥发油和糖类及醋类成分,另外尚含有腺嘌吟、胆碱、水苏碱、糖、氦基酸、脂肪酸、无机元素等成分，有文献对毫菊进行了化学成分的系统研究，从中分离到金合欢素、木犀草素、芹菜素、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-0-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖苷、绿原酸、3, 5-二羟基-4’，6，7, 8-四甲氧基黄酮、β-谷甾醇、正壬酸等[9] 。1.4.1 挥发油类菊花挥发油中包括单萜、倍半萜、脂肪族及含氧衍生物。单砧、倍半萜的含氧衍生物多具有较强的生物活性，是香气药、化妆品和食品工业的重要原料。刘伟等[5] 对不同产地四种菊花：即怀菊、滁菊、毫菊和杭菊中挥发油进行了含量测定，发现滁菊中含量最高；同时采用气质联用技术对挥发油成分进行初步研究，鉴定出二十余种萜类成分。黄保民等[6] 应用气质联用技术对怀菊花及大怀菊中的挥发油化学成分组成和性质进行了分析，实验结果表明菊花挥发油的主要成分为倍半萜、单萜类及其含氧衍生物;此外从怀菊花挥发油中鉴定了40个化合物，从大怀菊中鉴定了27个化合物。王莹等[10] 用气相色谱-质谱-计算机联用技术分析不同炮制品的怀小白菊中挥发油成分，共检出89~90个色谱峰，其中鉴定了75种化合物的结构，占挥发油总量的90.56 %-93.00 %，小白菊中挥发油主要成分为萜类化合物:包括单萜与倍半萜。周维书等[11] 采用GC-MS对香菊挥发油成分进行了质谱分析，发现苦橙油醇、异领撷草酸丁酯、γ-按醇等在常用药用菊花中很少发现的成分，这三个挥发油成分占挥发油总重的15.88 %，能代表香菊的独特香气。殷红等[12] 分析了杭白菊中的挥发油成分，发现采摘期愈早，挥发油含量愈高。经过加工的干花，放置时间对挥发油含量的影响不大。1.4.2 黄酮类化合物黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。它们的分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具有碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，因此又称为黄碱素[16] 。(图1.1)。图1.1 黄酮类化合物的基本结构黄酮类化合物广泛分布于植物界，而且具有多种生物活性，引起了国内外的广泛重视，菊花中含有的黄酮类化合物主要包括黄酮及其苷、黄酮醇及其苷，是菊花中最常见的成分，是菊花药用的重要活性部位。从菊花中已分离得到的黄酮类化合物有：木犀草苷、香叶木素、芹菜素、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖普、刺槐昔、金合欢素、金合欢素-7-O-(6-O-乙酰) -β-D-葡萄糖昔、山奈酚和异泽兰黄素、金合欢素-7-O-β-D-吡喃半乳糖昔、棚皮素、金合欢-7-O-( 6’-鼠李糖基) -β-D-吡喃葡萄糖昔、藤黄菌素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖昔、芹菜素-7-O-β-D-吡喃半乳糖普、芹菜素-7-葡萄糖昔、4’-甲氧基藤黄菌素-7-O-β-D-吡喃半乳糖普、黄琴昔、大波斯菊普、矢车菊素-3-O-6-丙二酰-β-D-吡喃葡萄糖昔[17-20]。不同来源菊花药材的黄酮类成分差异未见报道，但药用菊花不同栽培类型间总黄酮含量有着显著差异。谷彦杰等[3] 对八种主要栽培类型菊花药材的木犀草苷的含量进行测定，发现八种菊花药材的木犀草苷的含量由多到少依次是：毫菊、滁菊、祁菊、贡菊、杭菊、济菊、黄菊、怀菊；刘金旗等[6] 对常见菊花品种的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔的含量进行测定，含量由多到少依次是:济菊、祁菊、黄菊、白菊、贡菊、滁菊、毫菊。1.4.3 有机酸类菊花中广泛存在有机酸类成分[21] ，主要有：绿原酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、隐绿原酸（4-咖啡酰基奎尼酸）、新绿原酸（5-咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸A（3,5-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸B（3,4-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸C（4,5-二咖啡酰基奎尼酸）、1-异丁酰异绿原酸C、异绿原酸C甲酯、异绿原酸A甲酯、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸[25] 、3,4,5-三咖啡酰奎酸、莱蓟素（1,3-二咖啡酰基奎尼酸）、3-香豆酰奎尼，还有棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、鞣花酸以及饱和脂肪酸等[22-24] 。1.4.4 氨基酸王庆兰等[15] 对我国八个主流菊花药材的氨基酸种类和含量进行了测定，结果表明，八种菊花药材均含有17种氨基酸，包括人体所需的8种必需氨基酸，其中以谷氨酸、天冬氨酸、羟脯氨酸的含量最高，组氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸含量低。其中黄菊花药材除含有8种菊花共有的17种氨基酸外，还含有胱氨酸。除脯氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸外，其他15中种氨基酸均较其他品种菊花的含量高。怀菊花除羟脯氨酸、脯氨酸含量高外，其他巧种氨基酸的含量均较低。1.4.5微量元素菊花中镁、磷、钙、硫、钾含量很高，且均含有人体必需的7种微量元素，包括铁、锌、锰、银、铜、钻、硒。1.4.6 其它除上述成分外，从菊花中还分得正戊基甲糖昔、咖啡酸丁酯和乙酯、三萜及甾醇类化合物等。1.5 菊花的主要药理活性中药菊花系为一种常用中药，具有疏风、清热、明目、解毒，止血，消肿等功能的功效。早在《神农本草经》就记载菊花时云:“久服利血气，羟身耐志延年。”后世医药学家对菊花逐渐有了更深的认识，如《名医别录》记载菊花可以“安肠胃，利五脉，调四肢”，《本草拾遗》记载菊花“作枕明目”。专门针对亳菊的药理研究不多，但亳菊中所含的一些已知成分的药理作用已被揭示。 近年来国内外对菊花的分类、鉴定、化学、药理、临床等方面报道较多，其药理作用主要有以下几个方面[26]。1.5.1 抗炎作用 李早在1960年，王凤莲就发现菊花提取物能增加毛细血管抵抗力，影响小鼠毛细血管的通透性，从而具有抗炎作用。近年来，国外学者经研究发现从菊花中分离得到的三萜烯三醇、二醇及其相应的棕榈酸酯和肉豆蔻酸酯对12-O-十四酰大戟二萜醇-13-酰(TPA)诱发的小鼠耳廓水肿胀具有明显的抗炎作用[17]。高宏[18] 研究菊花中微量元素对其抗炎作用的影响，实验结果表明，毫菊与怀菊均有显著的抗炎作用，添加微量元素后，毫菊的抗炎作用有明显提高，表明微量元素对菊花的抗炎作用影响很大。丁香烯具有平喘等作用，是治疗老年性慢性支气管炎的有效成分之一；蒎烯和l，8-按叶素均有较强的祛痰和抗炎作用[27] 。1.5.2 抗菌作用 李英霞等[20] 发现不同产地菊花（怀菊、杭菊、济菊、滁菊）的挥发油对白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、肺炎双球菌均有-定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制效果尤为明显；济菊的鲜花挥发油对肺炎、白葡、变形、乙链菌作用较强，而济菊干花和怀菊、滁菊、杭菊的作用较弱。1.5.3 抗氧化作用秦卫东[28] 用不同有机溶剂提取亳菊中的抗氧化物质，通过实验发现，黄酮类和酚类是亳菊的主要抗氧化成分。孔琪等[22] 通过对菊花黄酮的提取及其抗氧化活性的实验研究表明，菊花黄酮对猪油的氧化具有明显的抑制作用，并且随着质量分数的增大其抗氧化能力也随之增强。不同菊花的提取物具有不同抗氧性，资料研究显示，菊花黄酮类化合物可以减少自由基和超氧阴离子功能。菊花水提液可以提高机体清除自由基能力，降低超氧阴离子损伤生物膜能力，延缓衰老[29] 。1.5.4 心血管保护作用 研究发现具有正性肌力作用：无论离体心脏，还是单个心肌细胞，杭白菊均显示其正性肌力作用[39] 。抗心肌缺血作用：70年代的研究证实，菊花（杭白菊）提取物可以减轻 由于电刺激家兔脑中枢引起的缺血性心电图ST段压低的作用；临床研究表明：由杭白菊水提醇沉淀浸膏制成的菊花冠心片对心绞痛的总有效率达83.0%,能改善心电图，改善慢性冠脉供血不足，对心功能不全的症状如胸闷、心痛也有 明显的改善[39] 。抗心律失常作用：研实验发现杭白菊具有抗乌头碱诱发的大鼠心律失常作用；杭白菊具有抗氯仿诱发的小鼠心律失常作用。另外，发现菊花提取物可以减少结扎大鼠冠状动脉时心律失常的发生率[30] 。对血管舒张作用：菊花中的黄酮苷（木犀草苷-7-0-β-D-葡萄糖苷及芹菜素-7-〇-β-D-葡萄糖苷）及其体内的生物转化产物（木犀草素、芹菜素）对PE预收缩血管均有显著的舒张作用[39] 。对冠脉的作用：有研究表明，由杭白菊水提醇沉浸膏制成的制剂能够浓度 依赖性地增加离体家兔、在体狗心脏的冠脉流量（coronary flow，CF)，在相同剂量时，杭白菊制剂对离体家兔心脏CF的增加程度远大于同剂量丹参；杭白菊制 剂对高胆固醇食物引起的冠状动脉粥样硬化的离体兔心也有显著的增加CF的作用[31] 。杨学远等[40]发现杭白菊制剂的酚性部分可以增加豚鼠离体心脏冠脉流量 并对家兔的心、肝、肾功能无明显毒性作用。菊花对实验性心肌梗塞、实验性冠脉粥样硬化或供血不足的实验动物，能增加血流量和营养性血流量，还有加强心肌收缩和增加耗氧量的作用。1.5.5 抗肿瘤作用有实验发现，从菊花中分离得到的蒲公英赛皖型三蔽烯醇类对小鼠皮肤肿瘤有较显著的抑制作用；另外，从菊花中分离得到的15个三商烯二醇及三醇对由TPA诱发产生的BV2EA早期抗原均具有明显的抑制作用，其中6个化合物对常见肿瘤如肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、白血病等60种人类肿瘤细胞进行体外细胞毒活性实验，结果发现化合物amidiol对白血病HL260细胞具有极其显著的细胞毒活性。1.5.6抗病毒作用 Lee [25] 报道了菊花中具有一种新的抗HIV黄酮葡糖醛酸昔，其抑制HIV-1整合酶的IC50 (50%抑制浓度)为7.24 ug/ml，抗HIV活性的EC50(50%有效浓度)为41.8643 ug/ml。其中绿原酸还具有显著的抗癌作用。各品种菊花药材均有-定的抗病毒作用，其中以毫菊和怀菊作用最好。国外研究发现，菊花对骨髓灰质炎病毒、单纯疤疹病毒((HS V-1)和麻疹病毒具有不同程度的抑制作用，高浓度时对流感病毒(PR8株)也有抑制作用。绿原酸可作为抗艾滋病毒的先导化合物。另外，菊花药材具有抗艾滋病作用，能抑制逆转录酶和HLV复制的活性，从其中分离得到的金合欢素-7-0-β-D-吡喃半乳糖昔是抗HIV的新活性成分，且毒性相当低[32] 。1.5.7降脂作用菊花水煎剂[41] 能抑制大鼠肝微粒体中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR)的活力，激活胆固醇7α-羟化酶，从而起到加速胆固醇代谢的作用。胡春等[42] 研究菊花提取物对大鼠血清胆固醇的升高有明显改善作用，对于正常的基础饲料组大鼠，菊花提取物能保持血清总胆固醇基本不变，而提高有保护作用的HDL浓度，降低有危害作用的LDL浓度，在高脂膳食情况下具有抑制血胆固醇和甘油三酯升高的作用，这对预防和治疗高血脂疾病无疑是有益的。1.5.8抗诱变作用菊花对环磷酰胺诱变的小鼠骨髓PCE的微核率有明显抑制作用，同时平板掺入法实验也证实，菊花药材对由2-氨基药诱发的TA100或TA98菌株的回复突变有明显抑制作用，菊花黄酮类成分对黄曲霉毒素B1等影响肝脏代谢酶的物质和放射引起的基因突变有-定抑制作用[33] 。1.5.9驱铅作用冯超等[34]实验研究表明，将铅染毒的小白鼠给予菊花茶灌胃有明显的驱铅作用，而且具有统计学意义。1.5.10免疫调节作用有研究发现，菊花的提取物在增强抗炎作用的同时，能显著增加小鼠的脾细胞抗体的产生；在绵羊的血红细胞反应中，能够增加小鼠血清的IgA ，IgG水平，揭示其具有增强单核吞噬细胞的活性和细胞免疫调节活性。其他：菊花还有抗衰老，抗寄生虫，解热作用作用，菊花的黄酮类化合物有降压作用[35] 。1.6 木犀草苷概述木犀草苷黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在于多种天然植物中，如：全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、等植物中均含量丰富。其具有消炎抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。临床应用于止咳、祛痰、消炎、肝炎、以及治疗心血管类疾病[43] 。1.6.1 木犀草苷理化性质化学名：3,4,7-四羟黄酮；别名：黄色黄素、黄示灵；化学式：C15H10O6；物理性质：黄色针状结晶，熔点(328-330℃)，微溶于水，具弱酸性，可溶于碱性溶液[44] 。1.6.2 木犀草苷来源木犀草苷自然界中分布广泛，最初是从木犀草科木犀草属的草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离得到的，目前主要存在于金银花、菊花、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄苓属、落花紫珠、筋骨草、百里香草等天然药材中[44] 。1.6.3 木犀草苷的提取工艺1.6.3.1 药材预处理将含有木犀草苷药材，经过洗涤，干燥后，粉碎成粗粉备用[45] 。1.6.3.2 提取纯化药材粉末加入甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，回流提取，提取液减压浓缩后以石油醚、环己烷等溶剂萃取脱脂，水相过弱极性的大孔吸附树脂，用水洗涤至流出液无色后，以95%乙醇为洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩、真空干燥并重结晶后得到木犀草苷品[44-45] 。 1.6.4 木犀草苷药理活性1.6.4.1 抗炎 实验研究发现木犀草苷抗炎活性与抑制一氧化氮(NO)和其他炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的产生有关，同时可抑制蛋白质络氨酸的磷酸化以及核转录因子KB(NF-KB)介导的基因表达[43] 。1.6.4.2 抗肿瘤 通过研究木犀草苷肿瘤细胞的影响实验[43] ，结果发现木犀草苷以选择性抑制前列腺癌和乳腺癌细胞的脂肪酸合成酶活性，抑制肿瘤细胞增长和变异；木犀草苷以显著的降低二甲肼所致的结肠癌的发生率，并且可调节脂质过氧化、抗氧化、抗增殖的作用；木犀草苷制卵巢癌细胞的侵袭运动能力，与其抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的分泌及下调细胞外信号调节激酶2(ERK2)的表达有关[45] 。 1.6.4.3 抗过敏 木犀草苷以抑制免疫球蛋白E介导人的肥大细胞产生的变态反应递质，包括组胺、白三烯、前列腺素D2，以及单核巨噬细胞集落刺激因子的释放，其作用还可以抑制Ca2+内流和蛋白激酶C(PKC)易位的活化[46] 。 1.6.4.4 抗氧化 通过木犀草素体外实验，发现木犀草可以保护少突胶质细胞抵抗过氧化氢诱导的氧化损害，强烈抑制巨噬细胞对髓鞘的吞噬作用，显著减少细胞活性氧簇的产生，减少蛋白质活性的表达[47] 。1.6.4.5 抗纤维化 木犀草苷以降低肝纤维化，降低肝组织中羟脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)的含量以及I型前胶原mRNA的表达，还可以抑制肝星状细胞(HSC)的增殖和胶原合成，并可改善博来霉素所致的肺纤维化组织病理学改变，降低肺重量指数、明显降低MDA、升高HYP，抑制肺组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达，抑制人胚肺纤维细胞的增殖，促进其凋亡[48] 。 1.6.4.6 抗激素作用 木犀草苷有显著的抗着床活性，口服后能明显增加子宫的重量、直径、子宫内膜的厚度以及其上皮细胞的高度，单独应用时具有类雌激素作用，但和炔雌醇合用时却显示具有抗雌激素作用[49] 。 1.6.4.7 对血管的作用 木犀草苷以抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的兔角膜血管的生成；可以抑制鼠异种移植肿瘤模型的肿瘤生长和血管形成；可以抑制VEGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的存活和增殖[49] ；可以显著抑制血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞的增殖和DNA合成；可以阻滞细胞周期的进行；可以降低肾上腺素预收缩血管的张力，拮抗高钾引起的血管收缩，具有动脉舒张作用，其作用机制与直接抑制电压依从性钙通道、受体操纵性钙通道、细胞内钙释放有关[50] 。 1.6.4.8 其他 木犀草苷以抑制多种细菌和病毒，如金黄色葡球菌、大肠杆菌、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒等[51] 。其能抑制艾滋病病毒HIV整合酶的活性,具有潜在的抗HIV的作用。木犀草苷可以与严重急性呼吸道综合征（SARS）冠状病毒的S2蛋白结合，从而抑制病毒进入宿主细胞。1.7 绿原酸的概述绿原酸是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一。绿原酸具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。与咖啡酸相似，口服或腹腔注射时，可提高大鼠的中枢兴奋性。可增加大鼠及小鼠的小肠蠕动和大鼠子宫的张力。有利胆作用，能增进大鼠的胆汁分泌 。对人有致敏作用，吸入含有本品的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等[52] 。1.7.1 绿原酸的理化性质化学结构如图所示：是由咖啡酸与奎尼酸新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物；物理性质：白色针状结晶，熔点208℃，25 ℃水中溶解度为4%，热水中溶解度更大；易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸 乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。(图1.2)。图1.2化学结构如图所示1.7.2 绿原酸的来源绿原酸的来源较为广泛，木杜仲科植物杜仲的叶，忍冬科植物忍冬杜仲红腺忍冬、山银花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花，蔷薇科植物英国山楂的果实，千屈菜科植物千屈菜花，无患子科植物坡柳.，水龙骨科植物欧亚水龙骨根茎，马鞭草科植物假败酱根，十字花科植物卷心菜茎、叶，蓼科植物扁蓄全草，茜草科植物篷子菜全草，忍冬科植物蒴翟.全草。旋花科植物红薯的叶。茜草科植物小果咖啡、中果咖啡及大果咖啡的种子。菊科植物牛蒡的叶和根[53] 。1.7.3 绿原酸的提取工艺1.7.3.1 药材预处理将含有绿原酸的药材，经过洗涤，干燥后，粉碎成粗粉备用[54] 。1.7.3.2 提取纯化药材粉末→干燥→粉碎→筛选→称取一定量→加入一定量的提取溶剂→在超声波清洗器中超声提取一定时间→离心→过滤→测定[55] 。 1.7.4 绿原酸的药理活性张炳仁[28] 等发现绿原酸具有解热作用，说明绿原酸是菊花(桑菊饮)疏风散热的物质基础之一。此外，绿原酸还具有抗炎[29-30] 抗菌[31-32] 、抗氧化[33-34] 、抗肿瘤[35] 、心血管保护[36] 、降糖降脂[37] 、免疫调节[35] 等多种药理活性。1.8 高效液相色谱法的概述 高效液相色谱法又称为层析法，从1985年《中国药典》开始使用，其发展迅速，目前已以成为天然药物中有效成分的含量测定和成分分析的重要方法之一。高效液相色谱法因为其性质稳定、可靠、选择性高、灵敏度高的优点，在药用物质的含量测定和组成分析，以及质量控制方面得到了广泛的应用[56] 。 色谱法的分离原理：是各组分溶于液相中，经过固定相时，与固定相发生作用大小、强弱不同，就会使其在固定相中滞留时间不相同，因此出柱先后不同，进而形成不同的峰高[54] 。 高效液相色谱（HPLC）是在色谱条件的基础上，通过改进填料颗粒度大小和柱压的高低，再在传统液相色谱的基础上引入气相色谱的理论塔板数，同时在技术上引进了高压输液泵，高效的固定相和高灵敏度的检测器使其分析速度快，分离程度高，操作的半自动化强[56] 。 高效液相色谱法的特点：①高压强：流动相为液体，流经色谱柱时，受到较大的阻力时，为了迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。②高效率：分离效能高，可选择最佳固定相和流动相以达到最好的分离效果。③高灵敏度：主要表现在紫外检测器的高精密度和准确性。④应用较广泛：百分之七十八以上的有机化合物都可采用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析，占据优势。⑤分析速度快、载液流速快：较传统液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等特点，但其也存在着缺点，高效液相色谱的缺点是“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低[54] 。2 实验研究2.1 仪器和试剂2.1.1 仪器Waterse2695-2996高效液相色谱系统；Empower工作站（Waters公司）；Diamonsil C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；DJ-02型中药粉碎机（上海淀久机械制造公司），KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.1.2 试剂木犀草苷购于中国食品药品鉴定研究院，批号为：111520-201504）；乙腈（Fisher)；娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯。 亳菊为2015年购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat .的干燥花蕾。2.2 实验方法2.2.1 色谱条件Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，梯度表如表1所示；进样量为10 μL；柱温为25℃；检测波长340 nm，亳菊样品及对照品色谱图如图2.1，图2.2所示。表1流动相梯度表时间流动相A(%)流动相B(%)0-1110→1890→8211-3018→2082→8030-402080图2.1 木犀草苷样品HPLC色谱图图2.2 绿原酸及木犀草苷对照品HPLC色谱图2.2.2 对照品溶液制备精密称取绿原酸和木犀草苷对照品适量，分别置l0ml量瓶中，加入70%甲醇至刻度，摇匀，制成每1 ml含绿原酸0.250 mg、木犀草苷0.550 mg的对照品储备液。在4℃以下保存，备用。2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定毫菊干燥粗粉粉(过40目筛）0.5 g，置具塞锥形瓶中。精密加入70%甲醇10 ml，密塞后称定重量，常温下超声处理(功率300 W，频率40kHz) 40 min 放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，用0.45um微孔滤膜滤过，在4℃以下保存，备用。2.2.4 线性关系考察从对照品储备液中精密量取1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 uL，分别置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到混合对照品溶液，各进样10 uL，按照上述的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度（ug/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，线性范围。并计算木犀草苷回归方程，y=80869x-118532.019，R2=0.99902。结果表明0.025-1.100（ug/ml)内木犀草苷峰面积Y与对照品浓度（ug/ml)X线性关系良好。按上述计算绿原酸的回归方程，y=76879x-116224.7143，R2=0.99904。结果表明0.055-5.000（ug/ml）内绿原酸峰面积Y与对照品浓度（ug/ml)X线性关系良好。结果如表2.1，2.2和图2.3。表2.1 线性关系考查表取储备液的量（uL）1248121620峰面积（木犀草苷）4108058224120264174980238999356980478957峰面积（绿原酸）3986554231110990169901227090334567445798图2.2 绿原酸标准曲线表图2.3 木犀草苷标准曲线表2.2.5 精密度试验 精密取同一质量浓度的绿原酸,木犀草苷对照品溶液10 uL，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，按拟定的色谱条件进行测定，记录峰面积，结果表明，本方法精密度良好。RSD分别为0.5 %、0.03 %（n=6），结果如表2.2所示。表2.2 精密度试验结果实验编号123456RSD（%）峰面积（木犀草素）2617052617152617122616782617122617090.5峰面积（绿原酸）5432554338543475435454363543790.032.2.6 重复性试验分别精密称取亳菊样品适量，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算木犀草苷和绿原酸的平均含量分别为0.43 mg·g-1、0.53 mg·g-1RSD为0.29%、0.43%，结果如表2.3所示。表2.3 重复性试验实验结果实验编号123456RSD（%）峰面积（木犀草素）3137631356314693148131572315790.29峰面积（绿原酸）2712327216272972731427389274510.432.2.7 稳定性试验按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h内重复进样6次，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，结果表明，RSD分别为 0.45%、0.25%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。结果如表2.4所示。表2.4 稳定性试验结果测定时间（h）02481224RSD（%）峰面积（木犀草素）3137631458314973158131694317600.45峰面积（绿原酸）3467834761347993482334895349110.252.2.8 加样回收率试验 取已知各成分质量分数(绿原酸、木犀草苷)的毫菊药材样品粗粉(过40目筛)6份，各约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入适量的含有绿原酸、木犀草苷的对照品储备液、按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，计算回收率。结果平均回收率分99.9%、1.05%，RSD分别为0.88%、0.97%，结果如表2.5和2.6所示。表2.5 木犀草苷及绿原酸的加样回收率实验结果（n=6）序号样品含量/mg对照品加入量/mg实测值回收率/%平均回收率RSD/%木犀草苷0.4880.4550.94099.499.90.880.4580.4550.90999.20.4620.4550.91499.50.4380.4550.895100.50.4280.4550.889101.40.4460.4550.89899.3绿原酸0.4880.4550.94099.41.050.970.4580.4550.90999.20.4620.4550.91499.50.4380.4550.895100.50.4280.4550.889101.40.4460.4550.89899.32.2.9 样品的测定 取3批亳菊样品， 按供试品溶液制备方法及含量测定方法测定其含量，结果见表2.6。表2.6 亳菊样品含量测定结果（n=3）批号木犀草苷含量（ mg·g-1）绿原酸含量（ mg·g-1）15010.4880.57315020.4080.56115030.4630.552平均值0.4530.5412.3 讨论（1）在亳菊木犀草苷和绿原酸测定中，本实验采用不同比例含量的甲醇、乙醇进行提取，结果发现70%甲醇的提取率最高；对提取方法进行比较发现，超声提取法的提取率较高，而回流提取法提取率较低，因此本文采用70%甲醇，超声提取40min对亳菊中的木犀草苷和绿原酸进行含量测定的提取方法。（2）参考文献资料，对亳菊中的木犀草苷和绿原酸的含量测定方法进行比较，发现HPLC法较为简单、快速、准确。同时对色谱条件进行比较筛选。分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸进行比较发现以乙腈-0.1%甲酸为洗脱溶剂，所得色谱图较好，峰的分离度较高；因此，最终确定以乙腈-0.1%磷酸为本实验的流动相。结 论本文是采用HPLC测定亳菊中木犀草苷和绿原酸的含量，通过实验结果可以得出，木犀草苷在0.025-1.100（ug/ml)内范围内线性关系良好以及绿原酸为0.055-5.000（ug/ml)内范围内线性关系良好；精密度分别为（RSD=0.5 %、0.03% n=6）、重复性分别为（RSD=0.29%、0.43%）、稳定性分别为（RSD=0.45%、0.25%）均良好；木犀草苷的平均回收率99.9%，RSD=0.88%(n=6)，表明回收率良好；绿原酸的平均回收率1.05%，RSD=0.97%(n=6)，表明回收率良好；样品的含量测定中，木犀草苷的平均含量为0.453 mg·g-1；样品的含量测定中，绿原酸的平均含量为0.453 mg·g-1。 本实验建立的HPLC检测方法快速简便、可靠易行、准确度、精密度、稳定性均良好，可用于亳菊的质量控制，为评价的亳菊的质量提供理论依据。参考文献[1] 秦霞，靳学远，刘红. 菊花中绿原酸的超高压提取工艺研究[J].湖北农业科学，2010,49 ( 9 ): 2215-2217.[2] 张清华，张玲.菊花化学成分及药理作用的研究进展[J]，食品与药品，2007, 9 (20): 60-63.[3] 谷彦杰. 我国种主流菊花商品药材中木犀草素含量测定明[J].山东中医药大学学报. 2000, 24 (1): 65.[4] 刘金旗. 菊花中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔的含量测定[J] . 中成药，2001, 21 (3): 52-53.[5] 刘伟，郭庭江. 不同产地菊花中挥发油的GC-MS分析[[J] .河南中医学刊，1995, 10 (5):12.[6] 黄保民，刘杰.气质联用法对怀菊花及“大怀菊”挥发油化学成分的分析与比较[[J] .中医研究，1997, 10 (5): 14.[7] 鲍忠定，秦志荣，许荣年，等.杭白菊挥发油化学成分的气相色谱一质谱联用技术分析 [J] .食品科学，2003, 24 (6): 120.[8] 王莹，杨秀伟，不同炮制品怀小白菊挥发油成分的GC-MS分析[J].中国中药杂志，2006, 31 (6): 456-459.[9] 顾瑶华,秦民坚.亳菊的化学成分研究[J].中草药，2006, 37 (12): 1784-1786.[10] 贾凌云, 孙毅, 王春阳, 等.菊花总黄酮提取工艺研究[J]. 中药材，2003, 26 (1): 35-37.[11] 周维书，高艳玲. 香菊挥发油成分的质谱分析[J] .中成药，1998, 02: 34.[12] 殷红，杨鑫骥，盛静. 不同情况下杭白菊中挥发油成分的分析[[J] .药物鉴定，2004, 13 (2): 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88), The flow rate was 1.0 ml min-1, the sample injection volume was 10 μL and the column and sample temperature were at 25 ?C. The DAD was set at 340 nm for real-time monitoring of the peak intensity. Experimental results show that luteolin was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear and that chlorogenic acid was in 0.07312-0.5484 μg with good range linear; it showed good precision with RSD 0.5%; In repeatability test, average content is 0.43mg·g-1 ( RSD = 0.5%),which indicated good repeatability; It also showed good stability with RSD=0.48%; In recovery test, the average recovery rate was 99.9%, and the RSD was 0.88%. The method established in this paper is simple, reliable and reproducible, and wich could be used for the quality control of Chrysanthemum morifolium Ramat.Key words: Chrysanthemum morifolium Ramat; Lutelin; chlorogenic acid; determination; HPLC1 概述1.1 菊花的国内外发展概况 21.2 菊花的资源分布 21.3 菊花的产地加工方法 31.4 菊花的主要化学成分 31.4.1 挥发油类 31.4.2 黄酮类化合物 31.4.3 有机酸类 41.4.4 氨基酸 41.4.5 微量元素 51.4.6 其它 51.5 菊花的主要药理活性 61.5.1 抗炎作用 71.5.2 抗菌作用 71.5.3 抗氧化作用 71.5.4 心血管保护作用 71.5.5 抗肿瘤作用 81.5.6抗病毒作用 91.5.7 降脂作用 91.5.8 抗诱变作用 91.5.9 驱铅作用 91.5.10 免疫调节作用 91.6 木犀草苷的概述 91.6.1 木犀草苷的理化性质 91.6.2 木犀草苷的来源 101.6.4 木犀草苷的药理活性 111.6 绿原酸的概述 121.6.1 绿原酸的理化性质 121.6.2 绿原酸的来源 121.6.4 绿原酸的药理活性 131.8 高效液相色谱法的概述 132 实验研究2.1 仪器和试剂 152.1.1 仪器 152.1.2 试剂 152.2 实验方法与结果 152.2.1 色谱条件 152.2.2 对照品溶液制备 162.2.3 供试品溶液的制备 172.2.4 线性关系考察 172.2.5 精密度试验 172.2.6 稳定性试验 172.2.7 重复性试验 172.2.8 加样回收率试验 192.2.9 样品的测定 202.3 讨论 20结论 21参考文献 22致谢 251 概述1.1 选题背景 亳菊亳州药农家家都有种植菊花的习惯轻，质柔润。气清香，味甘，微苦。菊化学成分包括挥发油类、黄酮类、有机酸类、氨基酸类、糖类及微量元素等[1,2]。LC、HPLC、GC- MS、FT-IR 、1 H-NMR以及电化学指纹图谱等现代多种分析方法已被使用在亳菊的鉴定、鉴别和含量测定中。但对道地药材亳菊的专属化学成分和质量评价等方面的研究工作尚显不足，特别是其与目前充斥市场的替代品大亳菊的鉴别方法研究还有待于进一步深入，因此本文采用HPLC对亳菊中的绿原酸和木樨草苷进行含量测定。1.2 菊花的国内外发展概况菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium.的干燥头状花序，是一种传统药食同源的药材，原产于我国，有300多年的栽培历史。春秋时《尔雅》中即有记载。而后在《札记.月令篇》中记有“季秋之月，鞠有黄华”。《埠雅》则日：“菊本作鞠，鞠从鞠，鞠穷也。”菊又名节华，《本草纲目》云：“女节，女华，菊华之名也。治蔷，日精，菊根之名也[3,4]。有研究认为[5]，我国宋朝以前的药用菊花取之于野生品，后经自然选择和人工的栽培选育，至明、清时期逐渐形成了一些优良的药用菊花品种，其产地也趋于固定，如安徽亳县的毫菊，安徽滁州的滁菊、黄山的贡菊，浙江的杭菊等[6]。目前我国药用菊花现有8个产区，长江以南产区的杭白菊、贡菊是以饮用为主，而长江以北产区的滁菊、亳菊、济菊、祁菊、怀菊均以药用为主。在诸多产地所产的药用菊花中，被公认为地道药材的为亳菊、滁菊、贡菊和杭菊及并称中国四大名菊被药典收载[7]。 亳菊在我国具有悠久的栽培历史，其与安徽地区的滁菊、杭菊，河南地区的怀菊，河北地区的祁菊，山东地区的济菊，都是国内享有名誉的茶用菊[8] 。亳菊具有较高茶用价值，同时其具有延年益寿的神奇功效，《补农书》载：“甘菊性甘温，久服最有益”。元代《本草衍义补遗》中记载：菊“花能补阴”。李时珍《本草纲目》中道：“菊能朱孺之皆以服菊成仙”[9] 。可见亳菊的功效之神奇。1.2 菊花的资源分布 菊花目前我国药用菊花现有8个产区，长江以南产区的杭白菊、而长江以北产区的滁菊、亳菊、济菊、祁菊、怀菊均以药用为主。在诸多产地所产的药用菊花中，被公认为地道药材的为亳菊、滁菊、贡菊和杭菊及并称中国四大名菊被药典收载[10] 。 滁菊主产于滁州，属安徽省四大著名道地药材(毫白芍、滁菊花、铜陵凤丹皮、宣木瓜)之一。 “滁菊”之名最早现于清.光绪二十年《滁州志》：“大柳镇产的菊花饮之，可以清热，名日滁菊，颇为药商所重。”滁菊在清朝光绪元年被朝廷纳为贡品，故有“滁州贡菊”之称。滁菊的药用价值曾得到中医药界的高度肯定。 杭菊为药茶两用的菊花，品种主要有杭白菊、杭黄菊两种，杭黄菊习惯于药用，而杭白菊原供茶用，但随着近代中医药发展，杭白菊也已成为药茶兼用之品。杭白菊属浙江道地药材“浙八味”(白术、白芍、浙贝母、杭白菊、延胡索、玄参、览麦冬、温郁金)之一[4]。杭菊首载于明代(公元1573年-1621年)《万历嘉善县志》：“黄茶菊以紫蒂为佳。” 杭菊栽培历史悠久，主产于浙江桐乡等地。其最早关于产地的记载为明末《食物宜忌》中的“海宁”。《补农书》中首次记载“桐乡”产菊花，而后《本草新编》中也出现“杭人多半作茶饮”的记载，《本草纲目拾遗》中所载的产地有“杭州”、“临安”等。 黄山贡菊原名为“徽州贡菊”，也称“徽菊”，贡菊发源地为安徽黄山市县金竹岭村，根据《款县志》记载，其种植始于宋代。因于清代光绪年间被作为贡品献给皇帝，故名“贡菊”，是黄山道地名贵中药材之一。贡菊品质优良，集色、香、味、形于一体，兼有观赏价值、药用价值及茶用价值，为药用和茶用之佳品[12]。毫菊主产于安徽毫州、涡阳一带，亳菊的栽培历史在清朝时引自亳州；祁菊据1936年赵橘黄先生所著的《祁州药志》介绍，也是移自亳菊或怀菊的产地。怀菊形态特征与亳菊完全-致，也有人认为是引自亳州。优特药材，是品质优良，功效独特，驰名中外，开发利用前景广阔的药材。据《中华大辞典》载:"白菊主产安徽亳县，称亳菊，品质最佳";《中药志》称亳菊花、滁菊花在药菊中品质最佳；2世纪中药巨著《中华本草》，也称亳菊和滁菊品质最优[9]。 1.3 菊花的产地加工方法菊花作为常用中药，使用量大，产地多，加工方法各异。中国菊花的药用类群通过人工长期栽培选育已形成一些相对稳定的栽培变种。目前我国菊花药用类群有9个栽培变种，分别为贡菊、湖菊、小白菊、大白菊、小黄菊、滁菊、毫菊、大牙马、大怀菊。不同品种菊花中活性成分含量很不相同，同一品种不同产地的菊花之间差异也很明显，加工方法也对成分组成、特别是有效成分含量有明显的影响。刘金旗等[24] 对菊花中黄酮普的含量进行了分析。从含量结果分析，毫菊、滁菊中金合欢素-7-O-D葡萄糖普的含量明显高于芹菜素-7-O-3-D-葡萄糖普，杭菊和贡菊则相反，这可能与菊花的产地有关。毫菊、滁菊产于长江以北，杭菊、贡菊产于长江以南，从济菊与祁菊的结果分析，也有这种趋势。李卫文[11]等对毫菊采后加工工艺进行研究，于晴天露水千后随机采收半开放的毫菊头状花序，分别置于阴凉通风处阴干，60, 70, 80, 90和100℃烘干、微波杀青烘干，蒸汽杀青烘干；用HPLC法，以绿原酸、木犀草昔和3,5- O-二咖啡酸基奎宁酸等3种有效成分含量分别达到0.20%，0.08%和0.70%作为检测指标，对相同栽培管理条件下，不同采收加工方法处理的毫菊供试品进行有效成分含量的检测。研究结果显示，阴干的毫菊中3种有效成分含量最高，分别达到0.58%, 0.08%和2.64%；烘干加工方法中，70℃烘干的供试品中3种有效成分含量最高，随温度升高，3种有效成分含量逐渐降低，其中木犀草昔含量无法达到标准;微波杀青烘干法处理的毫菊中仅能检测到微量的3,5-O-二咖啡酞基奎宁酸，无法检测到绿原酸和木犀草昔两种成分；蒸汽杀青烘干法处理的毫菊中3种有效成分含量都普遍低，均达不到标准。目前菊花产业生产的加工方法多参考杭白菊，采用蒸汽杀青烘干法或烘干法，但由于不同品种菊花的花序形态构造的差异，加工工艺对毫菊有效成分含量影响较大[13]。本试验结果显示阴干处理郎毫菊中3种有效成分含量最高，均达到药典的标准，为毫菊适宜的加工方法。1.4 菊花的主要化学成分中药菊花的主要化学成分是以绿原酸为代表的有机酸，以木犀草素为代表的黄酮类化合物，以及包含单砧[15]、倍半砧的挥发油和糖类及醋类成分,另外尚含有腺嘌吟、胆碱、水苏碱、糖、氦基酸、脂肪酸、无机元素等成分，有文献对毫菊进行了化学成分的系统研究，从中分离到金合欢素、木犀草素、芹菜素、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-0-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖苷、绿原酸、3, 5-二羟基-4’，6，7, 8-四甲氧基黄酮、β-谷甾醇、正壬酸等[9] 。1.4.1 挥发油类菊花挥发油中包括单萜、倍半萜、脂肪族及含氧衍生物。单砧、倍半萜的含氧衍生物多具有较强的生物活性，是香气药、化妆品和食品工业的重要原料。刘伟等[5] 对不同产地四种菊花：即怀菊、滁菊、毫菊和杭菊中挥发油进行了含量测定，发现滁菊中含量最高；同时采用气质联用技术对挥发油成分进行初步研究，鉴定出二十余种萜类成分。黄保民等[6] 应用气质联用技术对怀菊花及大怀菊中的挥发油化学成分组成和性质进行了分析，实验结果表明菊花挥发油的主要成分为倍半萜、单萜类及其含氧衍生物;此外从怀菊花挥发油中鉴定了40个化合物，从大怀菊中鉴定了27个化合物。王莹等[10] 用气相色谱-质谱-计算机联用技术分析不同炮制品的怀小白菊中挥发油成分，共检出89~90个色谱峰，其中鉴定了75种化合物的结构，占挥发油总量的90.56 %-93.00 %，小白菊中挥发油主要成分为萜类化合物:包括单萜与倍半萜。周维书等[11] 采用GC-MS对香菊挥发油成分进行了质谱分析，发现苦橙油醇、异领撷草酸丁酯、γ-按醇等在常用药用菊花中很少发现的成分，这三个挥发油成分占挥发油总重的15.88 %，能代表香菊的独特香气。殷红等[12] 分析了杭白菊中的挥发油成分，发现采摘期愈早，挥发油含量愈高。经过加工的干花，放置时间对挥发油含量的影响不大。1.4.2 黄酮类化合物黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。它们的分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具有碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，因此又称为黄碱素[16] 。(图1.1)。图1.1 黄酮类化合物的基本结构黄酮类化合物广泛分布于植物界，而且具有多种生物活性，引起了国内外的广泛重视，菊花中含有的黄酮类化合物主要包括黄酮及其苷、黄酮醇及其苷，是菊花中最常见的成分，是菊花药用的重要活性部位。从菊花中已分离得到的黄酮类化合物有：木犀草苷、香叶木素、芹菜素、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖普、刺槐昔、金合欢素、金合欢素-7-O-(6-O-乙酰) -β-D-葡萄糖昔、山奈酚和异泽兰黄素、金合欢素-7-O-β-D-吡喃半乳糖昔、棚皮素、金合欢-7-O-( 6’-鼠李糖基) -β-D-吡喃葡萄糖昔、藤黄菌素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖昔、芹菜素-7-O-β-D-吡喃半乳糖普、芹菜素-7-葡萄糖昔、4’-甲氧基藤黄菌素-7-O-β-D-吡喃半乳糖普、黄琴昔、大波斯菊普、矢车菊素-3-O-6-丙二酰-β-D-吡喃葡萄糖昔[17-20]。不同来源菊花药材的黄酮类成分差异未见报道，但药用菊花不同栽培类型间总黄酮含量有着显著差异。谷彦杰等[3] 对八种主要栽培类型菊花药材的木犀草苷的含量进行测定，发现八种菊花药材的木犀草苷的含量由多到少依次是：毫菊、滁菊、祁菊、贡菊、杭菊、济菊、黄菊、怀菊；刘金旗等[6] 对常见菊花品种的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔的含量进行测定，含量由多到少依次是:济菊、祁菊、黄菊、白菊、贡菊、滁菊、毫菊。1.4.3 有机酸类菊花中广泛存在有机酸类成分[21] ，主要有：绿原酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸甲酯、绿原酸乙酯、隐绿原酸（4-咖啡酰基奎尼酸）、新绿原酸（5-咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸A（3,5-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸B（3,4-二咖啡酰基奎尼酸）、异绿原酸C（4,5-二咖啡酰基奎尼酸）、1-异丁酰异绿原酸C、异绿原酸C甲酯、异绿原酸A甲酯、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸[25] 、3,4,5-三咖啡酰奎酸、莱蓟素（1,3-二咖啡酰基奎尼酸）、3-香豆酰奎尼，还有棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、鞣花酸以及饱和脂肪酸等[22-24] 。1.4.4 氨基酸王庆兰等[15] 对我国八个主流菊花药材的氨基酸种类和含量进行了测定，结果表明，八种菊花药材均含有17种氨基酸，包括人体所需的8种必需氨基酸，其中以谷氨酸、天冬氨酸、羟脯氨酸的含量最高，组氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸含量低。其中黄菊花药材除含有8种菊花共有的17种氨基酸外，还含有胱氨酸。除脯氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸外，其他15中种氨基酸均较其他品种菊花的含量高。怀菊花除羟脯氨酸、脯氨酸含量高外，其他巧种氨基酸的含量均较低。1.4.5微量元素菊花中镁、磷、钙、硫、钾含量很高，且均含有人体必需的7种微量元素，包括铁、锌、锰、银、铜、钻、硒。1.4.6 其它除上述成分外，从菊花中还分得正戊基甲糖昔、咖啡酸丁酯和乙酯、三萜及甾醇类化合物等。1.5 菊花的主要药理活性中药菊花系为一种常用中药，具有疏风、清热、明目、解毒，止血，消肿等功能的功效。早在《神农本草经》就记载菊花时云:“久服利血气，羟身耐志延年。”后世医药学家对菊花逐渐有了更深的认识，如《名医别录》记载菊花可以“安肠胃，利五脉，调四肢”，《本草拾遗》记载菊花“作枕明目”。专门针对亳菊的药理研究不多，但亳菊中所含的一些已知成分的药理作用已被揭示。 近年来国内外对菊花的分类、鉴定、化学、药理、临床等方面报道较多，其药理作用主要有以下几个方面[26]。1.5.1 抗炎作用 李早在1960年，王凤莲就发现菊花提取物能增加毛细血管抵抗力，影响小鼠毛细血管的通透性，从而具有抗炎作用。近年来，国外学者经研究发现从菊花中分离得到的三萜烯三醇、二醇及其相应的棕榈酸酯和肉豆蔻酸酯对12-O-十四酰大戟二萜醇-13-酰(TPA)诱发的小鼠耳廓水肿胀具有明显的抗炎作用[17]。高宏[18] 研究菊花中微量元素对其抗炎作用的影响，实验结果表明，毫菊与怀菊均有显著的抗炎作用，添加微量元素后，毫菊的抗炎作用有明显提高，表明微量元素对菊花的抗炎作用影响很大。丁香烯具有平喘等作用，是治疗老年性慢性支气管炎的有效成分之一；蒎烯和l，8-按叶素均有较强的祛痰和抗炎作用[27] 。1.5.2 抗菌作用 李英霞等[20] 发现不同产地菊花（怀菊、杭菊、济菊、滁菊）的挥发油对白色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、肺炎双球菌均有-定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制效果尤为明显；济菊的鲜花挥发油对肺炎、白葡、变形、乙链菌作用较强，而济菊干花和怀菊、滁菊、杭菊的作用较弱。1.5.3 抗氧化作用秦卫东[28] 用不同有机溶剂提取亳菊中的抗氧化物质，通过实验发现，黄酮类和酚类是亳菊的主要抗氧化成分。孔琪等[22] 通过对菊花黄酮的提取及其抗氧化活性的实验研究表明，菊花黄酮对猪油的氧化具有明显的抑制作用，并且随着质量分数的增大其抗氧化能力也随之增强。不同菊花的提取物具有不同抗氧性，资料研究显示，菊花黄酮类化合物可以减少自由基和超氧阴离子功能。菊花水提液可以提高机体清除自由基能力，降低超氧阴离子损伤生物膜能力，延缓衰老[29] 。1.5.4 心血管保护作用 研究发现具有正性肌力作用：无论离体心脏，还是单个心肌细胞，杭白菊均显示其正性肌力作用[39] 。抗心肌缺血作用：70年代的研究证实，菊花（杭白菊）提取物可以减轻 由于电刺激家兔脑中枢引起的缺血性心电图ST段压低的作用；临床研究表明：由杭白菊水提醇沉淀浸膏制成的菊花冠心片对心绞痛的总有效率达83.0%,能改善心电图，改善慢性冠脉供血不足，对心功能不全的症状如胸闷、心痛也有 明显的改善[39] 。抗心律失常作用：研实验发现杭白菊具有抗乌头碱诱发的大鼠心律失常作用；杭白菊具有抗氯仿诱发的小鼠心律失常作用。另外，发现菊花提取物可以减少结扎大鼠冠状动脉时心律失常的发生率[30] 。对血管舒张作用：菊花中的黄酮苷（木犀草苷-7-0-β-D-葡萄糖苷及芹菜素-7-〇-β-D-葡萄糖苷）及其体内的生物转化产物（木犀草素、芹菜素）对PE预收缩血管均有显著的舒张作用[39] 。对冠脉的作用：有研究表明，由杭白菊水提醇沉浸膏制成的制剂能够浓度 依赖性地增加离体家兔、在体狗心脏的冠脉流量（coronary flow，CF)，在相同剂量时，杭白菊制剂对离体家兔心脏CF的增加程度远大于同剂量丹参；杭白菊制 剂对高胆固醇食物引起的冠状动脉粥样硬化的离体兔心也有显著的增加CF的作用[31] 。杨学远等[40]发现杭白菊制剂的酚性部分可以增加豚鼠离体心脏冠脉流量 并对家兔的心、肝、肾功能无明显毒性作用。菊花对实验性心肌梗塞、实验性冠脉粥样硬化或供血不足的实验动物，能增加血流量和营养性血流量，还有加强心肌收缩和增加耗氧量的作用。1.5.5 抗肿瘤作用有实验发现，从菊花中分离得到的蒲公英赛皖型三蔽烯醇类对小鼠皮肤肿瘤有较显著的抑制作用；另外，从菊花中分离得到的15个三商烯二醇及三醇对由TPA诱发产生的BV2EA早期抗原均具有明显的抑制作用，其中6个化合物对常见肿瘤如肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、白血病等60种人类肿瘤细胞进行体外细胞毒活性实验，结果发现化合物amidiol对白血病HL260细胞具有极其显著的细胞毒活性。1.5.6抗病毒作用 Lee [25] 报道了菊花中具有一种新的抗HIV黄酮葡糖醛酸昔，其抑制HIV-1整合酶的IC50 (50%抑制浓度)为7.24 ug/ml，抗HIV活性的EC50(50%有效浓度)为41.8643 ug/ml。其中绿原酸还具有显著的抗癌作用。各品种菊花药材均有-定的抗病毒作用，其中以毫菊和怀菊作用最好。国外研究发现，菊花对骨髓灰质炎病毒、单纯疤疹病毒((HS V-1)和麻疹病毒具有不同程度的抑制作用，高浓度时对流感病毒(PR8株)也有抑制作用。绿原酸可作为抗艾滋病毒的先导化合物。另外，菊花药材具有抗艾滋病作用，能抑制逆转录酶和HLV复制的活性，从其中分离得到的金合欢素-7-0-β-D-吡喃半乳糖昔是抗HIV的新活性成分，且毒性相当低[32] 。1.5.7降脂作用菊花水煎剂[41] 能抑制大鼠肝微粒体中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR)的活力，激活胆固醇7α-羟化酶，从而起到加速胆固醇代谢的作用。胡春等[42] 研究菊花提取物对大鼠血清胆固醇的升高有明显改善作用，对于正常的基础饲料组大鼠，菊花提取物能保持血清总胆固醇基本不变，而提高有保护作用的HDL浓度，降低有危害作用的LDL浓度，在高脂膳食情况下具有抑制血胆固醇和甘油三酯升高的作用，这对预防和治疗高血脂疾病无疑是有益的。1.5.8抗诱变作用菊花对环磷酰胺诱变的小鼠骨髓PCE的微核率有明显抑制作用，同时平板掺入法实验也证实，菊花药材对由2-氨基药诱发的TA100或TA98菌株的回复突变有明显抑制作用，菊花黄酮类成分对黄曲霉毒素B1等影响肝脏代谢酶的物质和放射引起的基因突变有-定抑制作用[33] 。1.5.9驱铅作用冯超等[34]实验研究表明，将铅染毒的小白鼠给予菊花茶灌胃有明显的驱铅作用，而且具有统计学意义。1.5.10免疫调节作用有研究发现，菊花的提取物在增强抗炎作用的同时，能显著增加小鼠的脾细胞抗体的产生；在绵羊的血红细胞反应中，能够增加小鼠血清的IgA ，IgG水平，揭示其具有增强单核吞噬细胞的活性和细胞免疫调节活性。其他：菊花还有抗衰老，抗寄生虫，解热作用作用，菊花的黄酮类化合物有降压作用[35] 。1.6 木犀草苷概述木犀草苷黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在于多种天然植物中，如：全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、等植物中均含量丰富。其具有消炎抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。临床应用于止咳、祛痰、消炎、肝炎、以及治疗心血管类疾病[43] 。1.6.1 木犀草苷理化性质化学名：3,4,7-四羟黄酮；别名：黄色黄素、黄示灵；化学式：C15H10O6；物理性质：黄色针状结晶，熔点(328-330℃)，微溶于水，具弱酸性，可溶于碱性溶液[44] 。1.6.2 木犀草苷来源木犀草苷自然界中分布广泛，最初是从木犀草科木犀草属的草本植物木犀草的叶、茎、枝中分离得到的，目前主要存在于金银花、菊花、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄苓属、落花紫珠、筋骨草、百里香草等天然药材中[44] 。1.6.3 木犀草苷的提取工艺1.6.3.1 药材预处理将含有木犀草苷药材，经过洗涤，干燥后，粉碎成粗粉备用[45] 。1.6.3.2 提取纯化药材粉末加入甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，回流提取，提取液减压浓缩后以石油醚、环己烷等溶剂萃取脱脂，水相过弱极性的大孔吸附树脂，用水洗涤至流出液无色后，以95%乙醇为洗脱剂洗脱，洗脱液减压浓缩、真空干燥并重结晶后得到木犀草苷品[44-45] 。 1.6.4 木犀草苷药理活性1.6.4.1 抗炎 实验研究发现木犀草苷抗炎活性与抑制一氧化氮(NO)和其他炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的产生有关，同时可抑制蛋白质络氨酸的磷酸化以及核转录因子KB(NF-KB)介导的基因表达[43] 。1.6.4.2 抗肿瘤 通过研究木犀草苷肿瘤细胞的影响实验[43] ，结果发现木犀草苷以选择性抑制前列腺癌和乳腺癌细胞的脂肪酸合成酶活性，抑制肿瘤细胞增长和变异；木犀草苷以显著的降低二甲肼所致的结肠癌的发生率，并且可调节脂质过氧化、抗氧化、抗增殖的作用；木犀草苷制卵巢癌细胞的侵袭运动能力，与其抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的分泌及下调细胞外信号调节激酶2(ERK2)的表达有关[45] 。 1.6.4.3 抗过敏 木犀草苷以抑制免疫球蛋白E介导人的肥大细胞产生的变态反应递质，包括组胺、白三烯、前列腺素D2，以及单核巨噬细胞集落刺激因子的释放，其作用还可以抑制Ca2+内流和蛋白激酶C(PKC)易位的活化[46] 。 1.6.4.4 抗氧化 通过木犀草素体外实验，发现木犀草可以保护少突胶质细胞抵抗过氧化氢诱导的氧化损害，强烈抑制巨噬细胞对髓鞘的吞噬作用，显著减少细胞活性氧簇的产生，减少蛋白质活性的表达[47] 。1.6.4.5 抗纤维化 木犀草苷以降低肝纤维化，降低肝组织中羟脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)的含量以及I型前胶原mRNA的表达，还可以抑制肝星状细胞(HSC)的增殖和胶原合成，并可改善博来霉素所致的肺纤维化组织病理学改变，降低肺重量指数、明显降低MDA、升高HYP，抑制肺组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达，抑制人胚肺纤维细胞的增殖，促进其凋亡[48] 。 1.6.4.6 抗激素作用 木犀草苷有显著的抗着床活性，口服后能明显增加子宫的重量、直径、子宫内膜的厚度以及其上皮细胞的高度，单独应用时具有类雌激素作用，但和炔雌醇合用时却显示具有抗雌激素作用[49] 。 1.6.4.7 对血管的作用 木犀草苷以抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的兔角膜血管的生成；可以抑制鼠异种移植肿瘤模型的肿瘤生长和血管形成；可以抑制VEGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的存活和增殖[49] ；可以显著抑制血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）诱导的血管平滑肌细胞的增殖和DNA合成；可以阻滞细胞周期的进行；可以降低肾上腺素预收缩血管的张力，拮抗高钾引起的血管收缩，具有动脉舒张作用，其作用机制与直接抑制电压依从性钙通道、受体操纵性钙通道、细胞内钙释放有关[50] 。 1.6.4.8 其他 木犀草苷以抑制多种细菌和病毒，如金黄色葡球菌、大肠杆菌、单纯疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒等[51] 。其能抑制艾滋病病毒HIV整合酶的活性,具有潜在的抗HIV的作用。木犀草苷可以与严重急性呼吸道综合征（SARS）冠状病毒的S2蛋白结合，从而抑制病毒进入宿主细胞。1.7 绿原酸的概述绿原酸是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一。绿原酸具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。与咖啡酸相似，口服或腹腔注射时，可提高大鼠的中枢兴奋性。可增加大鼠及小鼠的小肠蠕动和大鼠子宫的张力。有利胆作用，能增进大鼠的胆汁分泌 。对人有致敏作用，吸入含有本品的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等[52] 。1.7.1 绿原酸的理化性质化学结构如图所示：是由咖啡酸与奎尼酸新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸，1-羟基六氢没食子酸）生成的缩酚酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物；物理性质：白色针状结晶，熔点208℃，25 ℃水中溶解度为4%，热水中溶解度更大；易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸 乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。(图1.2)。图1.2化学结构如图所示1.7.2 绿原酸的来源绿原酸的来源较为广泛，木杜仲科植物杜仲的叶，忍冬科植物忍冬杜仲红腺忍冬、山银花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花，蔷薇科植物英国山楂的果实，千屈菜科植物千屈菜花，无患子科植物坡柳.，水龙骨科植物欧亚水龙骨根茎，马鞭草科植物假败酱根，十字花科植物卷心菜茎、叶，蓼科植物扁蓄全草，茜草科植物篷子菜全草，忍冬科植物蒴翟.全草。旋花科植物红薯的叶。茜草科植物小果咖啡、中果咖啡及大果咖啡的种子。菊科植物牛蒡的叶和根[53] 。1.7.3 绿原酸的提取工艺1.7.3.1 药材预处理将含有绿原酸的药材，经过洗涤，干燥后，粉碎成粗粉备用[54] 。1.7.3.2 提取纯化药材粉末→干燥→粉碎→筛选→称取一定量→加入一定量的提取溶剂→在超声波清洗器中超声提取一定时间→离心→过滤→测定[55] 。 1.7.4 绿原酸的药理活性张炳仁[28] 等发现绿原酸具有解热作用，说明绿原酸是菊花(桑菊饮)疏风散热的物质基础之一。此外，绿原酸还具有抗炎[29-30] 抗菌[31-32] 、抗氧化[33-34] 、抗肿瘤[35] 、心血管保护[36] 、降糖降脂[37] 、免疫调节[35] 等多种药理活性。1.8 高效液相色谱法的概述 高效液相色谱法又称为层析法，从1985年《中国药典》开始使用，其发展迅速，目前已以成为天然药物中有效成分的含量测定和成分分析的重要方法之一。高效液相色谱法因为其性质稳定、可靠、选择性高、灵敏度高的优点，在药用物质的含量测定和组成分析，以及质量控制方面得到了广泛的应用[56] 。 色谱法的分离原理：是各组分溶于液相中，经过固定相时，与固定相发生作用大小、强弱不同，就会使其在固定相中滞留时间不相同，因此出柱先后不同，进而形成不同的峰高[54] 。 高效液相色谱（HPLC）是在色谱条件的基础上，通过改进填料颗粒度大小和柱压的高低，再在传统液相色谱的基础上引入气相色谱的理论塔板数，同时在技术上引进了高压输液泵，高效的固定相和高灵敏度的检测器使其分析速度快，分离程度高，操作的半自动化强[56] 。 高效液相色谱法的特点：①高压强：流动相为液体，流经色谱柱时，受到较大的阻力时，为了迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。②高效率：分离效能高，可选择最佳固定相和流动相以达到最好的分离效果。③高灵敏度：主要表现在紫外检测器的高精密度和准确性。④应用较广泛：百分之七十八以上的有机化合物都可采用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析，占据优势。⑤分析速度快、载液流速快：较传统液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等特点，但其也存在着缺点，高效液相色谱的缺点是“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低[54] 。2 实验研究2.1 仪器和试剂2.1.1 仪器Waterse2695-2996高效液相色谱系统；Empower工作站（Waters公司）；Diamonsil C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；DJ-02型中药粉碎机（上海淀久机械制造公司），KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.1.2 试剂木犀草苷购于中国食品药品鉴定研究院，批号为：111520-201504）；乙腈（Fisher)；娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯。 亳菊为2015年购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院雷国莲教授鉴定为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat .的干燥花蕾。2.2 实验方法2.2.1 色谱条件Diamonsil C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，梯度表如表1所示；进样量为10 μL；柱温为25℃；检测波长340 nm，亳菊样品及对照品色谱图如图2.1，图2.2所示。表1流动相梯度表时间流动相A(%)流动相B(%)0-1110→1890→8211-3018→2082→8030-402080图2.1 木犀草苷样品HPLC色谱图图2.2 绿原酸及木犀草苷对照品HPLC色谱图2.2.2 对照品溶液制备精密称取绿原酸和木犀草苷对照品适量，分别置l0ml量瓶中，加入70%甲醇至刻度，摇匀，制成每1 ml含绿原酸0.250 mg、木犀草苷0.550 mg的对照品储备液。在4℃以下保存，备用。2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定毫菊干燥粗粉粉(过40目筛）0.5 g，置具塞锥形瓶中。精密加入70%甲醇10 ml，密塞后称定重量，常温下超声处理(功率300 W，频率40kHz) 40 min 放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，用0.45um微孔滤膜滤过，在4℃以下保存，备用。2.2.4 线性关系考察从对照品储备液中精密量取1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 uL，分别置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到混合对照品溶液，各进样10 uL，按照上述的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度（ug/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，线性范围。并计算木犀草苷回归方程，y=80869x-118532.019，R2=0.99902。结果表明0.025-1.100（ug/ml)内木犀草苷峰面积Y与对照品浓度（ug/ml)X线性关系良好。按上述计算绿原酸的回归方程，y=76879x-116224.7143，R2=0.99904。结果表明0.055-5.000（ug/ml）内绿原酸峰面积Y与对照品浓度（ug/ml)X线性关系良好。结果如表2.1，2.2和图2.3。表2.1 线性关系考查表取储备液的量（uL）1248121620峰面积（木犀草苷）4108058224120264174980238999356980478957峰面积（绿原酸）3986554231110990169901227090334567445798图2.2 绿原酸标准曲线表图2.3 木犀草苷标准曲线表2.2.5 精密度试验 精密取同一质量浓度的绿原酸,木犀草苷对照品溶液10 uL，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，按拟定的色谱条件进行测定，记录峰面积，结果表明，本方法精密度良好。RSD分别为0.5 %、0.03 %（n=6），结果如表2.2所示。表2.2 精密度试验结果实验编号123456RSD（%）峰面积（木犀草素）2617052617152617122616782617122617090.5峰面积（绿原酸）5432554338543475435454363543790.032.2.6 重复性试验分别精密称取亳菊样品适量，平行6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，计算木犀草苷和绿原酸的平均含量分别为0.43 mg·g-1、0.53 mg·g-1RSD为0.29%、0.43%，结果如表2.3所示。表2.3 重复性试验实验结果实验编号123456RSD（%）峰面积（木犀草素）3137631356314693148131572315790.29峰面积（绿原酸）2712327216272972731427389274510.432.2.7 稳定性试验按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h内重复进样6次，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，结果表明，RSD分别为 0.45%、0.25%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。结果如表2.4所示。表2.4 稳定性试验结果测定时间（h）02481224RSD（%）峰面积（木犀草素）3137631458314973158131694317600.45峰面积（绿原酸）3467834761347993482334895349110.252.2.8 加样回收率试验 取已知各成分质量分数(绿原酸、木犀草苷)的毫菊药材样品粗粉(过40目筛)6份，各约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入适量的含有绿原酸、木犀草苷的对照品储备液、按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件进行，测定峰面积，计算回收率。结果平均回收率分99.9%、1.05%，RSD分别为0.88%、0.97%，结果如表2.5和2.6所示。表2.5 木犀草苷及绿原酸的加样回收率实验结果（n=6）序号样品含量/mg对照品加入量/mg实测值回收率/%平均回收率RSD/%木犀草苷0.4880.4550.94099.499.90.880.4580.4550.90999.20.4620.4550.91499.50.4380.4550.895100.50.4280.4550.889101.40.4460.4550.89899.3绿原酸0.4880.4550.94099.41.050.970.4580.4550.90999.20.4620.4550.91499.50.4380.4550.895100.50.4280.4550.889101.40.4460.4550.89899.32.2.9 样品的测定 取3批亳菊样品， 按供试品溶液制备方法及含量测定方法测定其含量，结果见表2.6。表2.6 亳菊样品含量测定结果（n=3）批号木犀草苷含量（ mg·g-1）绿原酸含量（ mg·g-1）15010.4880.57315020.4080.56115030.4630.552平均值0.4530.5412.3 讨论（1）在亳菊木犀草苷和绿原酸测定中，本实验采用不同比例含量的甲醇、乙醇进行提取，结果发现70%甲醇的提取率最高；对提取方法进行比较发现，超声提取法的提取率较高，而回流提取法提取率较低，因此本文采用70%甲醇，超声提取40min对亳菊中的木犀草苷和绿原酸进行含量测定的提取方法。（2）参考文献资料，对亳菊中的木犀草苷和绿原酸的含量测定方法进行比较，发现HPLC法较为简单、快速、准确。同时对色谱条件进行比较筛选。分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸进行比较发现以乙腈-0.1%甲酸为洗脱溶剂，所得色谱图较好，峰的分离度较高；因此，最终确定以乙腈-0.1%磷酸为本实验的流动相。结 论本文是采用HPLC测定亳菊中木犀草苷和绿原酸的含量，通过实验结果可以得出，木犀草苷在0.025-1.100（ug/ml)内范围内线性关系良好以及绿原酸为0.055-5.000（ug/ml)内范围内线性关系良好；精密度分别为（RSD=0.5 %、0.03% n=6）、重复性分别为（RSD=0.29%、0.43%）、稳定性分别为（RSD=0.45%、0.25%）均良好；木犀草苷的平均回收率99.9%，RSD=0.88%(n=6)，表明回收率良好；绿原酸的平均回收率1.05%，RSD=0.97%(n=6)，表明回收率良好；样品的含量测定中，木犀草苷的平均含量为0.453 mg·g-1；样品的含量测定中，绿原酸的平均含量为0.453 mg·g-1。 本实验建立的HPLC检测方法快速简便、可靠易行、准确度、精密度、稳定性均良好，可用于亳菊的质量控制，为评价的亳菊的质量提供理论依据。参考文献[1] 秦霞，靳学远，刘红. 菊花中绿原酸的超高压提取工艺研究[J].湖北农业科学，2010,49 ( 9 ): 2215-2217.[2] 张清华，张玲.菊花化学成分及药理作用的研究进展[J]，食品与药品，2007, 9 (20): 60-63.[3] 谷彦杰. 我国种主流菊花商品药材中木犀草素含量测定明[J].山东中医药大学学报. 2000, 24 (1): 65.[4] 刘金旗. 菊花中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖昔的含量测定[J] . 中成药，2001, 21 (3): 52-53.[5] 刘伟，郭庭江. 不同产地菊花中挥发油的GC-MS分析[[J] .河南中医学刊，1995, 10 (5):12.[6] 黄保民，刘杰.气质联用法对怀菊花及“大怀菊”挥发油化学成分的分析与比较[[J] .中医研究，1997, 10 (5): 14.[7] 鲍忠定，秦志荣，许荣年，等.杭白菊挥发油化学成分的气相色谱一质谱联用技术分析 [J] .食品科学，2003, 24 (6): 120.[8] 王莹，杨秀伟，不同炮制品怀小白菊挥发油成分的GC-MS分析[J].中国中药杂志，2006, 31 (6): 456-459.[9] 顾瑶华,秦民坚.亳菊的化学成分研究[J].中草药，2006, 37 (12): 1784-1786.[10] 贾凌云, 孙毅, 王春阳, 等.菊花总黄酮提取工艺研究[J]. 中药材，2003, 26 (1): 35-37.[11] 周维书，高艳玲. 香菊挥发油成分的质谱分析[J] .中成药，1998, 02: 34.[12] 殷红，杨鑫骥，盛静. 不同情况下杭白菊中挥发油成分的分析[[J] .药物鉴定，2004, 13 (2): 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