凹叶厚朴内生真菌代谢产物定性研究
摘 要利用现代科学技术对药用植物凹叶厚朴中内生真菌代谢产物进行定性研究，深入了解凹叶厚朴内生真菌代谢产物中有效化学成分，在制药、临床、化妆品等方面增加厚朴酚与和厚朴酚的应用；同时也是为了解决凹叶厚朴植物生长缓慢、资源不足等因素带来的药源紧张和生态破坏问题。通过对凹叶厚朴中分离得到的34株内生真菌进行液体发酵培养，用甲醇和乙酸乙酯分别提取发酵液中所含成分，采用紫外-可见分光光度法，高效液相色谱法筛选出代谢含有厚朴酚与和厚朴酚的菌株。实验结果发现，其中有1株菌YX-13与厚朴酚对照品在相同HPLC条件下保留时间相似，判断其内生真菌代谢产物含厚朴酚；另有1株菌YX-10与和厚朴酚对照品在相同HPLC条件下保留时间相似，判断其内生真菌代谢产物含和厚朴酚；6株与厚朴酚及和厚朴酚对照品在相同UV、HPLC条件下保留时间较接近，判断其内生真菌代谢产物拟似含有厚朴酚或其结构类似物。因此，发酵产物中可能含有厚朴酚与和厚朴酚，为下一步研发凹叶厚朴内生真菌代谢产物提供理论依据，丰富内生真菌菌种资源库。目 录
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.1.1 凹叶厚朴的简介 1
1.1.2 凹叶厚朴野生资源现状 1
1.2 凹叶厚朴人工栽培现状 1
1.3 凹叶厚朴的成分及药理活性 2
1.3.1 化学成分 2
1.3.2 厚朴酚与和厚朴酚的药理作用 3
1.4 内生真菌研究进展与分析 5
1.4.1 内生真菌简介 5
1.4.2 凹叶厚朴与内生真菌的关系 5
1.4.3 植物内生真菌的代谢产物 6
1.4.4 植物内生真菌代谢产物的多样性 6
2 实验部分
2.1 试验材料 8
2.1.1 菌种 8
2.1.2 实验设备及试剂 8
2.1.3 培养基及主要溶液的配制 8
2.2 实验方法 9
2.2.1 凹叶厚朴内生真菌的复壮培养 9
2.2.2 内生真菌的液体发酵培养 9
2.2.3 内生真菌发酵液的提取 9
2.2.4 内生真菌代谢产物定性分析 9
8
2.1.1 菌种 8
2.1.2 实验设备及试剂 8
2.1.3 培养基及主要溶液的配制 8
2.2 实验方法 9
2.2.1 凹叶厚朴内生真菌的复壮培养 9
2.2.2 内生真菌的液体发酵培养 9
2.2.3 内生真菌发酵液的提取 9
2.2.4 内生真菌代谢产物定性分析 9
2.3 结果与分析 10
2.3.1 实验结果 10
2.3.2 分析讨论 12
结论 14
参考文献 15
致谢 19
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状
1.1.1 凹叶厚朴的简介
厚朴(Magnolia offiei. nalis Rehd.etWils.) (又名川朴、温朴、紫油厚朴)和凹叶厚朴（又名庐山厚朴、温朴）落叶乔木，中国特有的木兰科木兰属植物。凹叶厚朴(M.biloba(Rehd. Et Wils) Cheng)为厚朴的亚种，是我国特产的药用植物之一，入药历史悠久也是国家重点保护的中药材[1]。其根、树皮、花、果都可入药，具有温中、明目、下气、镇痛、燥湿、消痰、化食功能。主要用于治疗食积气滞、祛除风寒、缓解头痛、便秘、抑制焦虑、食欲不振、燥热健脾、咳嗽多痰等临床症状[2]。其主要药效成分为厚朴酚与和厚朴酚，这两种化合物都具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、治疗糖尿病、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性。野生凹叶厚朴主要分布在陕西、四川、湖北九宫山、安徽、浙江云和、福建三明、江西武夷山等地[3]。
1.1.2 凹叶厚朴野生资源现状
我国凹叶厚朴资源开发利用历史悠久，野生厚朴资源一直以来都是中药材的主要来源。随着中药现代化的快速发展，对凹叶厚朴的需求量不断增长，但是由于生态环境变化，植物自身繁殖能力下降[4]，多年来产区群众不分时节、不管成熟度的常年采挖，导致资源破坏。而厚朴生长周期长，更新缓慢，一般要生长16年左右才能砍树剥皮供药用，且一经剥皮，则全株死亡导致凹叶厚朴资源逐年减少[5]，自然恢复速度远远跟不上采剥速度，使林区凹叶厚朴出现“无皮可剥，无花可收”的情况，导致开发需求与利用的野生资源较少。近几十年来，厚朴资源受到很大破坏，日趋减少的的凹叶厚朴资源似乎无法满足社会需求，将面临“巧妇难为无米之炊”的窘境。现阶段仅依靠大量的人工种植来满足社会需求并及时保护凹叶厚朴资源。
1.2 凹叶厚朴人工栽培现状
目前人工栽培凹叶厚朴面积逐年增大，国家医疗部门先后在湖北恩施、四川灌县（现为都江堰）、五峰、浙江景宁、广西、湖南永州资源等地营造大规模的人工厚朴基地[6]。虽然凹叶厚朴人工栽培面积大，资源分布广，但普遍存在选地不当，大多数种植户盲目大面积种植，未曾考虑当地的地理条件，导致产量不高，品质不优，给生产者提供的原料质量参差不齐，同时缺乏按质量标准要求进行生产，无法实现厚朴的加工增值，最终导致国内厚朴竞争力弱，产业发展缓慢[7]。其次，凹叶厚朴资源利用率低且浪费现象严重，一些具有潜在的药用价值并未开发出来。研究发现，凹叶厚朴叶中也含有厚朴的主要有效成分，但是酚类含量较少，根和树干除木材加工应用外，目前不曾供药用[8]。凹叶厚朴生长缓慢，目前人们对它的需求量增加，因此如何合理利用凹叶厚朴资源，同时保护凹叶厚朴的种植资源多样性的问题迫在眉睫。
1.3 凹叶厚朴的成分及药理活性
1.3.1 化学成分
1.3.1.1 酚类
凹叶厚朴中酚类化合物主要有厚朴酚、和厚朴酚、异厚朴酚、三羟基厚朴酚、去氧三羟基厚朴酚、三羟基厚朴醛、聚厚朴酚甲、丙。其中对人类最重要的是厚朴酚与和厚朴酚，两者具有明显的抗癌、抗菌等作用[9]。
1.3.1.2 生物碱类
凹叶厚朴中生物碱类物质主要有：番荔枝碱、木兰箭毒碱、木兰花碱、白兰花碱，生物碱的含量很低，约0.08%，但与人类关系密切，对抗菌消炎与降压具有很好的作用，也是凹叶厚朴中不可或缺的成分[10]。
1.3.1.3 挥发油类
挥发油是药用凹叶厚朴中的重要成分，主要来源于芳香类化合物，其中的主要成分是β桉油醇，其次为a按叶油醇，对聚伞花序，a旅烯，D柠檬烯，芳樟醇等[11]。具有抗过敏、驱虫作用等。但它容易被氧化、分解，制剂过程不易操作。研究表明药材应含有β按叶油醇的厚朴及代用品方可供药用。
1.3.1.4 其它类
凹叶厚朴中还含有其它少量的化合物，如：伞形花素和芥子醛[12]、棕榈酮、槲皮苷、芦丁、花生酸、胡萝卜苷等物质[13]。
1.3.2 厚朴酚与和厚朴酚的药理作用
厚朴酚与和厚朴酚是凹叶厚朴的主要成分，也是主要活性成分，关于厚朴酚与和厚朴酚的研究报道较多。
1.3.2.1抗菌作用
厚朴酚与和厚朴酚具有明显的、持久的抗菌、抗病原微生物的作用[14]。研究表明，和厚朴酚与厚朴酚对多种菌的生长具有很强的抑制作用[15]，且抗菌性质稳定，不易受热、酸、碱的破坏。如：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、肺炎双球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、百日咳杆菌、大肠杆菌、溶血性链球杆菌、炭疽杆菌等[16]。
1.3.2.
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.1.1 凹叶厚朴的简介 1
1.1.2 凹叶厚朴野生资源现状 1
1.2 凹叶厚朴人工栽培现状 1
1.3 凹叶厚朴的成分及药理活性 2
1.3.1 化学成分 2
1.3.2 厚朴酚与和厚朴酚的药理作用 3
1.4 内生真菌研究进展与分析 5
1.4.1 内生真菌简介 5
1.4.2 凹叶厚朴与内生真菌的关系 5
1.4.3 植物内生真菌的代谢产物 6
1.4.4 植物内生真菌代谢产物的多样性 6
2 实验部分
2.1 试验材料 8
2.1.1 菌种 8
2.1.2 实验设备及试剂 8
2.1.3 培养基及主要溶液的配制 8
2.2 实验方法 9
2.2.1 凹叶厚朴内生真菌的复壮培养 9
2.2.2 内生真菌的液体发酵培养 9
2.2.3 内生真菌发酵液的提取 9
2.2.4 内生真菌代谢产物定性分析 9
8
2.1.1 菌种 8
2.1.2 实验设备及试剂 8
2.1.3 培养基及主要溶液的配制 8
2.2 实验方法 9
2.2.1 凹叶厚朴内生真菌的复壮培养 9
2.2.2 内生真菌的液体发酵培养 9
2.2.3 内生真菌发酵液的提取 9
2.2.4 内生真菌代谢产物定性分析 9
2.3 结果与分析 10
2.3.1 实验结果 10
2.3.2 分析讨论 12
结论 14
参考文献 15
致谢 19
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴的研究现状
1.1.1 凹叶厚朴的简介
厚朴(Magnolia offiei. nalis Rehd.etWils.) (又名川朴、温朴、紫油厚朴)和凹叶厚朴（又名庐山厚朴、温朴）落叶乔木，中国特有的木兰科木兰属植物。凹叶厚朴(M.biloba(Rehd. Et Wils) Cheng)为厚朴的亚种，是我国特产的药用植物之一，入药历史悠久也是国家重点保护的中药材[1]。其根、树皮、花、果都可入药，具有温中、明目、下气、镇痛、燥湿、消痰、化食功能。主要用于治疗食积气滞、祛除风寒、缓解头痛、便秘、抑制焦虑、食欲不振、燥热健脾、咳嗽多痰等临床症状[2]。其主要药效成分为厚朴酚与和厚朴酚，这两种化合物都具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、治疗糖尿病、抗神经变性、抗抑郁等多种药理活性。野生凹叶厚朴主要分布在陕西、四川、湖北九宫山、安徽、浙江云和、福建三明、江西武夷山等地[3]。
1.1.2 凹叶厚朴野生资源现状
我国凹叶厚朴资源开发利用历史悠久，野生厚朴资源一直以来都是中药材的主要来源。随着中药现代化的快速发展，对凹叶厚朴的需求量不断增长，但是由于生态环境变化，植物自身繁殖能力下降[4]，多年来产区群众不分时节、不管成熟度的常年采挖，导致资源破坏。而厚朴生长周期长，更新缓慢，一般要生长16年左右才能砍树剥皮供药用，且一经剥皮，则全株死亡导致凹叶厚朴资源逐年减少[5]，自然恢复速度远远跟不上采剥速度，使林区凹叶厚朴出现“无皮可剥，无花可收”的情况，导致开发需求与利用的野生资源较少。近几十年来，厚朴资源受到很大破坏，日趋减少的的凹叶厚朴资源似乎无法满足社会需求，将面临“巧妇难为无米之炊”的窘境。现阶段仅依靠大量的人工种植来满足社会需求并及时保护凹叶厚朴资源。
1.2 凹叶厚朴人工栽培现状
目前人工栽培凹叶厚朴面积逐年增大，国家医疗部门先后在湖北恩施、四川灌县（现为都江堰）、五峰、浙江景宁、广西、湖南永州资源等地营造大规模的人工厚朴基地[6]。虽然凹叶厚朴人工栽培面积大，资源分布广，但普遍存在选地不当，大多数种植户盲目大面积种植，未曾考虑当地的地理条件，导致产量不高，品质不优，给生产者提供的原料质量参差不齐，同时缺乏按质量标准要求进行生产，无法实现厚朴的加工增值，最终导致国内厚朴竞争力弱，产业发展缓慢[7]。其次，凹叶厚朴资源利用率低且浪费现象严重，一些具有潜在的药用价值并未开发出来。研究发现，凹叶厚朴叶中也含有厚朴的主要有效成分，但是酚类含量较少，根和树干除木材加工应用外，目前不曾供药用[8]。凹叶厚朴生长缓慢，目前人们对它的需求量增加，因此如何合理利用凹叶厚朴资源，同时保护凹叶厚朴的种植资源多样性的问题迫在眉睫。
1.3 凹叶厚朴的成分及药理活性
1.3.1 化学成分
1.3.1.1 酚类
凹叶厚朴中酚类化合物主要有厚朴酚、和厚朴酚、异厚朴酚、三羟基厚朴酚、去氧三羟基厚朴酚、三羟基厚朴醛、聚厚朴酚甲、丙。其中对人类最重要的是厚朴酚与和厚朴酚，两者具有明显的抗癌、抗菌等作用[9]。
1.3.1.2 生物碱类
凹叶厚朴中生物碱类物质主要有：番荔枝碱、木兰箭毒碱、木兰花碱、白兰花碱，生物碱的含量很低，约0.08%，但与人类关系密切，对抗菌消炎与降压具有很好的作用，也是凹叶厚朴中不可或缺的成分[10]。
1.3.1.3 挥发油类
挥发油是药用凹叶厚朴中的重要成分，主要来源于芳香类化合物，其中的主要成分是β桉油醇，其次为a按叶油醇，对聚伞花序，a旅烯，D柠檬烯，芳樟醇等[11]。具有抗过敏、驱虫作用等。但它容易被氧化、分解，制剂过程不易操作。研究表明药材应含有β按叶油醇的厚朴及代用品方可供药用。
1.3.1.4 其它类
凹叶厚朴中还含有其它少量的化合物，如：伞形花素和芥子醛[12]、棕榈酮、槲皮苷、芦丁、花生酸、胡萝卜苷等物质[13]。
1.3.2 厚朴酚与和厚朴酚的药理作用
厚朴酚与和厚朴酚是凹叶厚朴的主要成分，也是主要活性成分，关于厚朴酚与和厚朴酚的研究报道较多。
1.3.2.1抗菌作用
厚朴酚与和厚朴酚具有明显的、持久的抗菌、抗病原微生物的作用[14]。研究表明，和厚朴酚与厚朴酚对多种菌的生长具有很强的抑制作用[15]，且抗菌性质稳定，不易受热、酸、碱的破坏。如：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、肺炎双球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、百日咳杆菌、大肠杆菌、溶血性链球杆菌、炭疽杆菌等[16]。
1.3.2.
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