黄花蒿挥发油的提取及体外抑菌活性研究
摘 要 本实验采用水蒸气蒸馏法提取黄花蒿挥发油,比较黄花蒿叶和茎中挥发油含量；将得到的挥发油利用纸片法和试管法测定其抑菌活性和最低抑菌浓度(MIC),比较黄花蒿挥发油对12种常见的细菌和真菌的抑菌活性。结果表明：黄花蒿叶中的挥发油的含量比黄花蒿茎中的挥发油含量高；黄花蒿挥发油对12种实验菌表现出不同的抑制活性,真菌对黄花蒿挥发油具有更强的敏感性,黄花蒿挥发油对真菌的抑菌作用比较稳定,由强到弱依次为黑曲霉、啤酒酵母菌、产黄青霉、马青霉、毛霉、青霉和根霉。关 键 词：黄花蒿；挥发油；真菌；细菌；最低抑菌浓度。 AbstractThe essential oil of Artemisia was extracted by steam distillation. To compare the contents of essential oil in leaves and stems of Artemisia, the antimicrobial activity and the minimum inhibitory concentration (MIC) To compare the antibacterial activity of volatile oil from Artemisia to 12 common bacteria and fungi The results show that: The content of volatile oil in the leaves of Artemisia was higher than that in the stems of Artemisia The essential oil of Artemisia L. had different inhibitory activity against 12 kinds of experimental bacteria, and the fungus had a stronger sensitivity to the essential oil of Artemisia. The antimicrobial activity of essential oil from Artemisia to fungi was relatively stable. From str
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experimental bacteria, and the fungus had a stronger sensitivity to the essential oil of Artemisia. The antimicrobial activity of essential oil from Artemisia to fungi was relatively stable. From strong to weak were Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Penicillium, Mucor, Rhizopus and Ma Qingmei.Key words : Artemisia annua ;essential oil ;fungi bacteria ;minimum inhibitory concentration.1 文献综述1.1 黄花蒿的概况 11.1.1 黄花蒿的鉴别 11.1.2 植物形态 21.2 药用成分 21.2.1 倍半萜类成分 21.2.2 黄酮类成分 21.2.3 挥发性成分 21.2.4 香豆素类成分 21.3 药理作用 21.3.1 抗疟作用 21.3.2 抗菌作用 31.3.3 抗寄生虫作用 31.3.4 解热作用 31.3.5 免疫作用 41.3.6 对心血管系统的作用 41.3.7 其它作用 41.4. 挥发油的研究进展 41.4.1 挥发油简介 41.4.2 挥发油的组成 51.4.3 挥发油的理化性质 61.4.5 本研究的目的和意义 82 实验内容2.1 实验仪器、材料 92.1.1 实验仪器 92.1.2 材料 92.1.3 实验试药 92.1.4 培养基的制备 92.2 实验方法 102.2.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较 102.2.2 纸片法测定抑菌浓度 102.2.3 试管法测定最低抑菌浓度（MIC） 102.3 结果及分析 112.3.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较 112.3.2 不同质量浓度的黄花蒿挥发油的抑菌效果 122.3.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定 12总结 14参考文献 15致谢 181 文献综述1.1 黄花蒿的概况黄花蒿菊科蒿属，别名青蒿、丑蒿、香蒿、苦蒿。为一年生草本植物，地上部分叶片、未开放的花蕾供药用。其有效成分—青蒿素，在抗疟方面与传统的奎宁类抗疟疾病具有不同的作用机理，在全国各地均有分布，是一种传统中草药，其地上部分成为青蒿。据我国药典记载，黄花蒿性苦、辛、寒；归肝、胆经［1］。具有清热解暑、除蒸、截虐的功效［2］。黄花蒿的主要有效成份为青蒿素和挥发油等，现代药理研究表明，黄花蒿具有抗疟、抗病毒、杀螨虫、解热抗炎、抗氧化和提高免疫力等多种功效［3］。研究证实，对黄花蒿采用不同的提取方法和各种有机溶剂进行提取，提取物对多种菌，如金色葡萄球菌、大肠杆菌、单核增多性李氏杆菌和白色念珠菌等均有不同程度的抑菌作用。另一些研究结果显示黄花蒿的有机溶剂提取物对许多植物性病原真菌具有显著的抑制作用。1.1.1 黄花蒿的鉴别1.1.1.1 形状鉴别干燥全草，长约60～100 cm。全株黄绿色，茎圆柱形，上部多分枝，长约30～80 cm， 直径0.2～0.6 cm。表面浅棕色或灰棕色，有纵向棱线，质略硬，易折断且断面粗糙，中央有白色的髓；叶互生，暗绿色或棕绿色，卷缩易碎，完整者展平后为三回羽状深裂，裂片及小裂片矩圆形或长椭圆形，两面被短毛。嫩枝具多数叶片，质脆，易碎裂。带果穗或花序的枝，叶片多已脱落，花序仅残存小球状棕黄色的苞片，如鱼子，质脆易碎。有特异香气，味苦，有清凉感。以色黄绿、气香、无杂质者为佳［4］。1.1.1.2 显微鉴别叶表面制片：①上下表皮细胞不规则，垂周壁波状弯曲，脉脊上的表皮细胞为窄长方形。②不定式气孔微突于表面，保卫细胞肾形。③腺毛呈椭圆形，常充满黄色挥发油，其两个半圆形分泌细胞的排列方向一般与最终裂片的中脉平行。④表面密布丁字形非腺毛，其壁横向延伸或在柄部着生处折成V字形，柄细胞小，单列，3～8个，在中脉附近可见只具有柄细胞的毛［4］。通过最终裂片的中脉横切面：①表皮细胞1列，长椭圆形，排列紧密，可见有气孔、丁字毛及腺毛。②叶肉组织等面型。③上面栅栏组织细胞延续至中脉，下面于中脉处中断。④维管束位于中心［4］。1.1.2 植物形态 一年生草本，高达1.5 m，全体近于无毛。茎直立，圆柱形，表面具有纵浅槽，幼时绿色，老时变为枯黄色；下部木质化，上部多分枝。茎叶互生；3回羽状细裂，裂片先端尖，上面绿色，下面黄绿色，叶轴两侧有狭翅，茎上部的叶，向上渐小，分裂更细。头状花序球形，下垂，排列成金字塔形、具有叶片的圆锥花序，几乎密布在全植物体上部；每一头状花序有短花柄，基部具有或不具有线形苞片；总苞平滑无毛，苞片2～3层，背面中央部分为绿色，边缘呈淡黄色，膜质状而透明；花托矩圆形，花均为管状花，黄色，外围为雌花，仅有雌蕊1枚；中央为两性花，花冠先端5裂，雄蕊5枚，聚药，花药合生，花丝细短，着生于花冠管内面中部，雌蕊1枚，花柱丝状，柱头2裂，呈叉状。瘦果卵形，微小，淡褐色，表面具隆起的纵条纹。花期8～10月。果期10～11月。 生于荒野、山坡、路边及河岸边。分布遍及全国。本植物的果实（黄花蒿子）亦供药用［6］。1.2 药用成分1.2.1 倍半萜类成分青蒿素、 青蒿素G、青蒿甲素、青蒿乙素、青蒿醇、青蒿酸甲酯等。1.2.2 黄酮类成分山奈黄素、槲皮黄素、黄色黄素等。1.2.3 挥发性成分异蒿酮、左旋樟脑、β-丁香烯、β-蒎烯、蒿酮1，8-桉油精、樟脑等。1.2.4 香豆素类成分香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、东莨菪内酯等。1.3 药理作用1.3.1 抗疟作用黄花蒿乙醚提取中性部分和其稀醇浸膏对鼠疟、猴疟和人疟均呈显著抗疟作用［7］。体内试验表明，黄花蒿素对疟原虫红细胞内期有杀灭作用，而对红细胞外期和红细胞前期无效。黄花蒿素具有快速抑制原虫成熟的作用。蒿甲醚乳剂的抗疟效果优于还原黄花蒿素琥珀酸钠水剂，是治疗凶险型疟疾的理想剂型。黄花蒿琥酯2。5、5、10、15 mg/kg，2次/天，连续3天，皮肤外搽，治疗猴疟均有不同程度疗效。5、10 mg/kg，2次/天，连续10天，皮肤外搽即可使猴疟转阴。加入适量促透氮酮，可提高抗疟作用［8，9］。脱羰黄花蒿素和碳杂脱羰黄花蒿素对小鼠体内的伯氏疟原虫K173株的ED50和ED90分别为12.6 mg/kg和25.8 mg/kg。体外试验表明，黄花蒿素可明显抑制恶性疟原虫无性体的生长，有直接杀伤作用。黄花蒿素、蒿甲醚和氯喹对恶性疟原虫的IC50分别为75.2，29.4 mol/mL 和43.2 mol/mL。黄花蒿素酯钠对恶性疟原虫6个分离株（包括抗氯喹株）有抑制作用［8，10］。1.3.2 抗菌作用黄花蒿水煎液对表皮葡萄球菌、卡他球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌有较强的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、结核秆菌等也有一定的抑制作用［11］。黄花蒿挥发油在0.25%浓度时，对所有皮肤癣菌有抑菌作用，在1%浓度时，对所有皮肤癣菌有杀菌作用。黄花蒿素有抗流感病毒的作用［12］。黄花蒿酯钠对金葡萄、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌、卡他球菌，甲型和乙型副伤寒秆菌均有一定的抗菌作用［11］。黄花蒿中的谷甾醇和豆甾醇亦有抗病毒作用［12］。1.3.3 抗寄生虫作用黄花蒿乙醚提取物、稀醇浸膏及黄花蒿素对鼠疟、猴疟、人疟均呈显着抗疟作用。体外培养提示，黄花蒿素对疟原虫有直接杀灭作用［13］。电镜观察证明，黄花蒿素主要作用于疟原虫红细胞内期无性体的膜相结构，首先作用于食物色膜、表膜和线粒体膜，其次是核膜和内质网。此外对核内染色体亦有影响。由于食物泡膜发生变化，阻断了疟原虫摄取营养的早期阶段，使疟原虫迅速发生氨基酸饥饿，形成自噬泡，并不断排出体外，使泡浆大量损失，内部结构瓦解而死亡。黄花蒿素对间日疟、恶性疟及抗氯喹地区恶性疟均有疗效高、退热及原虫转阴时间快的特点，尤其适于抢救凶险性疟疾，但复燃率高。此外，黄花蒿尚有抗血吸虫及钩端螺旋体作用［11］。1.3.4 解热作用用蒸馏法制备的黄花蒿注射液，对百、白、破三联疫苗致热的家兔有明显的解热作用［14］。黄花蒿与金银花组方，利用蒸馏法制备的青银注射液，对伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗致热的家免，有比单味黄花蒿注射液更为显着的退热效果，其降温特点迅速而持久，优于柴胡和安痛定注射液对照组。金银花与黄花蒿有协同解热作用［15，16］。 1.3.5 免疫作用用小鼠足垫试验、淋巴细胞转化试验、兔疫特异玫瑰花试验和溶血空斑试验等4项免疫指标观察黄花蒿素的免疫作用，发现黄花蒿素对体液免疫有明显的抑制作用，对细胞免疫有促进作用，可能具有免疫调节作用。黄花蒿素、蒿甲醚有促进脾TS细胞增殖功能。肌肉注射蒿甲醚对Begle大外周血T、B、Tu及Tr淋巴细胞亦有明显抑制作用［17］。亦明显降低正常小鼠血清IgG含量、增加脾脏重量［18］。降低鸡红细胞致敏小鼠血清IgG含量［19］。静脉注射黄花蒿素50～100 mg/kg能显着提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率（50.2～53.1%）和吞噬指数（1.58～1.91%）。黄花蒿素还可提高淋巴细胞转化率，促进细胞免疫作用［12］。黄花蒿琥酯可促进Ts细胞增殖，抑制TE细胞产生，阻止白细胞介素及各种炎症介质的释放，从而起到免疫调节作用［20］。1.3.6 对心血管系统的作用兔心灌注表明，黄花蒿素可减慢心率，抑制心肌收缩力，降低冠脉流量。静脉注射有降血压作用，但不影响去甲肾上腺素的升压反应，认为主要系对心脏的直接抑制所改。静脉注射20 mg/kg黄花蒿素可抗乌头碱所致兔心律失常［8，21］。1.3.7 其它作用黄花蒿琥酯能显著缩短小鼠戊巴比妥睡眼时间。黄花蒿素对实验性矽肺有明显疗效。蒿甲醚对小鼠有辐射防护作用［22］。黄花蒿挥发油和东莨素有明显的镇咳，平喘作用［23］，还有杀灭红细胞配子体，减少细胞破裂及虫体代谢产物的致热原作用［24，25］1.4 挥发油的研究进展 1.4.1 挥发油简介挥发油又称香精油、精油或芳香油。存在植物的腺毛、油管、油室、树脂道或分泌细胞等组织器官中，是一类具有特殊气味、分子量小，常温条件下可随水蒸气蒸出而又与水不混溶的挥发性油状成分的总称。挥发油大多具有多方面较强的生物活性，为中药中一类重要的化学成分。同一品种种植由于生长环境、采收季、挥发油的提取方法等因素不同，挥发油的品质及含量均可能呈现显著的差别［26］。挥发油在植物体在部位常随品种的不同而各异，有的全株都含有，有的则集中于根或根茎、叶、花、果实某一器官。植物中含挥发油随品种不同，存在部位、生长环境、产地或采收季节不同，差异较大，一般在1%以下，也有少数含量较高，高达10%以上，如丁香含挥发油达14%以上。全草类药材一般以开花前期或含苞待放时含量较高，而根茎类药材则以秋天成熟后采集为宜。随着人类生活环境的改变和生活水平的提高，逐渐促使现代医学的由单一疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，从而使中药类产品和其他大自然成分产品有了巨大的市场需求，加之从化学合成中筛选新药周期延长，耗资巨大，产品还有毒副作用大的隐患，人们开始把这种需求的目光转向天然产物。近几年来植物为原材料的药品、功能食品、保健品、日用化妆品的市场不断扩大，而植物挥发油的研究和开发也成为热点之一。早在古代的医疗实践中人们就已经注意到挥发油的许多主要药用价值，如镇咳、平喘、祛痰、解热镇痛、驱风、解痉、健胃、抗菌消炎等。挥发油还具有多种药理活性，如抗炎、抗过敏、抗癌、抗突变、抗菌、抗病毒、抗氧、化驱虫、酶抑制及对神经系统的镇静作用等［27,28］。1.4.2 挥发油的组成1.4.2.1 萜类化合物 挥发油的组成成分中的萜类所占比例最大，且主要是单萜、倍半萜及其含氧衍生物，其含氧衍生物多是该油中生物活性较强或芳香气味的主要成分。如黄花蒿全草含挥发油0.3～0.5%；薄荷油含薄荷醇80%左右；山苍子油含柠檬醛80%左右［29］。1.4.2.2 芳香族化合物组成挥发油的芳香族化合物多为小分子的芳香成分，大多是苯丙素类衍生物，具有C6-C3骨架，有些是一些挥发油的主要组成成分，如黄花蒿中含有芳香族化合物0.3～0.4%；丁香油中约含85%的丁香酚；茴香油、小茴香油、八角茴香油中含50%～80%的茴香脑。有些是萜源化合物，如百里香酚。还有些具有C6-C3或C6-C1骨架的化合物，如花椒油素［29］。1.4.2.3 脂肪族化合物 一些小分子的脂肪族化合物在挥发油中也广泛存在，但含量和作用一般不如萜类和芳香族化合物。如黄花蒿中的青蒿内酯，青蒿醇等；人参挥发油的人参炔醇和鱼腥草挥发油中的癸酰乙醛即鱼腥草素等都属于挥发油中的脂肪族化合物［29］。1.4.2.4 其他类化合物 除了以上三种化合物以外，有些中药经过水蒸气蒸馏能分解出挥发性成分，如芥子油、原白头翁素、大蒜油，也常称之为“挥发油”。这些成分在植物体内，多数以苷形式存在，经酶解后的苷元随水蒸气一同溜出而成油，如黑芥子油是芥子苷经芥子酶水解后产生的异硫氰酸烯丙酯；原白头翁素是毛茛苷水解后产生的化合物；大蒜油则是大蒜中大蒜氨酸经酶水解后产生含大蒜辣素等的挥发性油状物。经有机溶剂分离可得黄酮类、香豆素类、生物碱类等，如黄花蒿中黄酮类主要有3，5-二羟基-6，7，3，4，-四甲氧基黄酮醇，3，5，3，-三羟基-6，7，4，-三甲氧基黄酮，泽兰黄素，鼠李黄素等；黄花蒿中的香豆素类主要有6-甲氧基香豆素，东莨菪内酯，6，8-二甲基-7-羟基香豆素等。此外，如川芎、麻黄等挥发油中的川芎嗪以及烟碱［29］。1.4.3 挥发油的理化性质1.4.3.1 形状常温下挥发油大多为无色或淡黄色的油状液体，少数挥发油有其他颜色，如黄花蒿的挥发油淡黄色，艾叶油显蓝绿色，麝香草油显红色，桂皮油显红棕色。有些挥发油主要成分在低温下可以析出结晶，这种析出物习称为“脑”，如薄荷脑、樟脑，此过程亦被称为“析脑”。滤去析出物的油称为“脱脑油”。挥发油大多具有特殊而强烈的香气和辛辣味，少数具有难闻的臭气和腥气味，如土荆芥油有臭气，鱼腥草油有腥气味。挥发油的气味有时可作为其品质优劣的标志。芳香性挥发油在药剂上还常用作矫味剂［29］。1.4.3.2 挥发性挥发油在常温下可自然挥发，如滴在纸片上可自行挥发，且不留下持久性的油斑，借此可与脂肪油相区别［29］。1.4.3.3 溶解性挥发油不溶于水，而易溶于各种有机溶剂，如石油醚、乙醚、二硫化碳、油脂等。在高浓度乙醇中能全部溶解，然而在低浓度乙醇中只能溶解一部分［29］。1.4.3.4 物理常数挥发油多数比水轻，也有的比水重（如丁香油、桂皮油），相对密度一般0.850～1.065之间。挥发油几乎均有光学活性，比旋度在+97°～117°范围内。多具有强的折光性，折光率在1.43～1.61之间。挥发油的沸点一般在70 ℃～300 ℃ 之间［29］。1.4.3.5 不稳定性挥发油与空气、光线经常接触会逐渐氧化变质，使挥发油的相对密度增加，颜色变深，失去原有香味，形成树脂样物质，不能随水蒸气蒸馏。因此，制备挥发油方法的选择要合适，产品也要装入棕色瓶内用密塞塞好并低温保存。另外，挥发油组成成分常含有双键、醇羟基、醛、酮、酸性基团、内酯等结构，故相应的能与溴及亚硫酸氢钠发生加成反应、与肼类产生缩合反应、异羟肟酸铁反应。皂化反应及遇碱成盐反应等［29］。1.4.4 国内外关于该论题的研究现状和发展趋势为了探讨黄花蒿挥发油提取产业化的可行，我国将对某些地区野生黄花蒿进行了挥发油的含量测定。黄花蒿为重要的药用植物，富含多种挥发性和非挥发性的活性成分。挥发性的主要成分是挥发油，在植物体内的量约为0.2%-0.5% 。但其量及成分因地区分布不同而差异很大。如湖南雪峰山地区野生黄花蒿挥发油收油率为0.5% ，鉴定出45个化学成分［30］；甘肃地区的野生黄花蒿挥发油超临界CO2萃取提取得率为1.2% ，鉴定出86种化合物［31］；从山东地区黄花蒿挥发油中共鉴定出59个化学成分[32]。黄花蒿挥发油中萜类和半萜类化合物含量高达90% 以上[33]，萜类化合物在生活中常被用作食品、医药、农药和食品添加剂、动物添加剂等，由于其功效特殊，用途广泛，开发前景十分广阔，在我国实际上已逐渐成为研究热点[3]。我们生存的环境中存在着大量有害的微生物，许多有害致病菌威胁着人们的健康，而同时，这给食品的生产、食用、保存也带来了众多的不便。为抑制有害微生物的生长，避免其对人类健康的危害，人们将化学防腐剂应用于食品生产中。但经长期研究发现，许多使用的合成防腐剂有引起食物中毒等潜在危害，有的甚至会使人致畸、致癌，危害令人难以想象。同时还存在着防腐效果难以控制的问题，因为合成的防腐剂易受到微生物种类、溶解度以及pH值等诸多因子的影响。由于种种原因，很难找到理想的抑菌抗菌物质，使得开发新型合成抗菌防腐剂的难度在不断增大。由于上述原因，天然抗菌防腐剂的使用受到人们的青睐，也显得尤为重要。而天然抗菌防腐剂可选用天然抗菌物质为原料研制，也可直接使用天然物质作抗菌防腐剂。其来源有动植物源抗菌防腐剂和微生物源抗菌防腐剂，具体可作为抗菌剂的物质包括精油、生物碱、和多糖等[34]。临床上，由于长期使用合成的抗生素，大多数的敏感菌株不断被杀灭，而耐药菌株则会大量繁殖，取代敏感菌株，而使细菌的耐药率不断升高。同时药物不良反应也在逐步增加，问题也变得日趋严重，这种局面使临床用药受到一定限制，急需新型天然的抑菌药物[35]。然而由于中草药成分的复杂性，有抑菌作用的中草药，其作用成分可能是其所含的某一单一成分，也可能是多种成分的协同作用，所以其抗菌作用显得尤为复杂。而通常，中草药中所含的挥发油成分都具有良好的抗虫、抑菌生物活性本章实验。在考虑到这些因素的情况下，综合现实因素，选择常见的菌种：变形杆菌、枯草杆菌、四联球菌、产气杆菌、粪便链球菌，以及根霉、青霉、黑曲霉、毛霉、马青酶、产黄青酶、啤酒酵母菌作为观察研究对象，对黄花蒿挥发油进行了体外抑菌杀菌活性试验。1.4.5 本研究的目的和意义黄花蒿菊科蒿属，性苦、辛、寒；归肝胆经[1]。具有清热解暑，除蒸，截疟的功效[2]。黄花蒿的主要有效成为青蒿素和挥发油等，黄花蒿挥发油具有抗疟疾、抗病毒、杀螨虫、解热抗炎、抗氧化和提高免疫力等[3]。本实验是以水蒸汽蒸馏法，提取黄花蒿叶和茎的挥发油，比较叶和茎的挥发油含量，进而提高黄花蒿挥发油的提取产率；研究了黄花蒿挥发油对几种常见细菌和真菌的抑制作用，测定抑菌浓度，为黄花蒿挥发油的进一步利用奠定基础。2 实验内容2.1 实验仪器、材料2.1.1 实验仪器圆底烧瓶、锥形瓶、冷凝管、移液管、打孔机、无菌操作台等。 2.1.2 材料秦岭野生黄花蒿全草鲜品2.1.2.1 供试菌种细菌：变形杆菌、枯草杆菌、四联球菌、产气杆菌和粪便链球菌真菌：根霉、青霉、毛霉、马青霉、产黄青霉、黑曲霉和啤酒酵母酶 以上供试菌均来自于广东环凯微生物科技有限公司。2.1.2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基（细菌用）、沙保培养基（真菌用），121 ℃高压灭菌20 min ，备用。2.1.3 实验试剂吐温-80（广州苏穗化工有限公司）、乙醚（广州钱盛化工有限公司）；牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）、氯化钠（分析纯，广东光华科技股份有限公司）、琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司）、蒸馏水2.1.4 培养基的制备2.1.4.1 牛肉蛋白胨培养基量取1000 mL 蒸馏水，将牛肉膏取3.2 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.1 g微热，待其完全溶解后，再加入琼脂19.3 g，使其充分溶解。装入锥形瓶中，加塞，调整酸碱度为ph 6.8～7.4置于蒸汽灭菌器中，在103.43 KPa、121 ℃下高压灭菌20 min后，取出，备用。2.1.4.2 沙保培养基量取1000 mL蒸馏水，麦芽糖40.2 g、蛋白胨10.0 g、使其充分溶解，再加入琼脂20.5 g再使其充分溶解，装入锥形瓶中，加塞，调整酸碱度为ph 4.0～6.0。2.2 实验方法2.2.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较采用水蒸气蒸馏法提取［36］（挥发油与水不相溶，当受热后，二者蒸汽压的总和与大气压相等时，溶液即开始沸腾，继续加热则挥发油可随水蒸气蒸馏出来）：分别称取黄花蒿叶和茎质量的各5份，叶的分别为70.25 g、70.55 g、70.45 g、70.12 g、70.46 g，分别放入圆底烧瓶中，再分别加入500 mL蒸馏水；茎的分别为200.55 g、200.50 g、200.25 g、200.65 g、200.60 g，再分别放入圆底烧瓶中，分别加入1600 mL蒸馏水，加热蒸馏2 h，蒸馏完毕后，取少量的乙醚分别冲洗冷凝管，等充分分层后，分别收集乙醚层，挥干乙醚得到淡黄色油状物即为黄花蒿挥发油，得到的叶和茎的挥发油分别标记为1、2、3、4、5；6、7、8、9、10。2.2.2 纸片法测定抑菌浓度将2.2.1中得到的黄花蒿挥发油，用吐温-80乳化，再溶解与一定体积的水中，（精密定量配挥发油和水的量）制成3.125-50.00 mg/mL（3.125，6.25，12.5，25.00，50.00 mg/mL）倍比稀释的不同浓度梯度的溶液，放置冰箱中4 ℃保存备用［36］。采用滤纸片法测定水蒸气蒸馏法提取的黄花蒿挥发油的抑菌活性［37］。用打孔器将干净的滤纸制成直径为0.5 cm的小圆纸片若干个，干热灭菌后，分别浸入不同质量浓度的溶液中，使其充分的吸收，备用。在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量的无菌水，制成菌悬液，用无菌的1 mL移液管吸收取菌悬液，注入平板，涂布均匀。将浸泡处理过的滤纸片沥干，贴在上述含菌平板上，每个平板上贴3片相同的黄花蒿挥发油质量浓度的滤纸片。吐温-80和无菌水的混合液作为空白对照，反复3次。置于培养箱中，细菌32 ℃培养24～48 h，真菌28 ℃培养3～5 h。取出量取抑菌圈直径，测量实验结果，取平均值。2.2.3 试管法测定最低抑菌浓度（MIC）根据滤纸片法所得的结果，采用试管法对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定（MIC) ［38,39］。培养基以每管总体积5 mL，分装与试管中，121 ℃，0.1 MPa条件下灭菌20 min。当灭菌培养基冷却至50 ℃左右时，加入黄花蒿挥发油，倍比稀释成 0.3125-20.00 mg/mL（0.3125 mg/mL，0.625 mg/mL，1.25m g/mL，2.50 mg/mL，5.00 mg/mL，10.00 mg/mL，20.00 mg/mL）梯度的质量浓度，充分混匀，无菌水作对照，分别制成斜面。将生长良好的受试菌划线接种于斜面上，细菌放于32 ℃温箱中培养24～48 h，观察菌落的生长状态。真菌放于28 ℃温箱中培养3～5 d，观察菌落生长状态。取完全不生长状态管样品最低质量浓度为最低抑菌浓度（MIC)。2.3 结果及分析2.3.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较 水蒸气蒸馏法提取黄花蒿叶和茎中的挥发油结果见表2.1和表2.2。表2.1 黄花蒿叶盛期叶部挥发油含量测定结果序号 样品（g） 挥发油（g） 收率（%） 1 70.25 0.87 1.25 2 70.55 0.84 1.203 70.45 0.85 1.214 70.12 0.86 1.225 70.46 0.87 1.23表2.2 叶盛期茎中挥发油含量测定结果序号 样品（g） 挥发油（g） 收率（%） 6 200.55 0.12 0.06 7 200.50 0.12 0.06 8 200.25 0.10 0.05 9 200.65 0.08 0.04 10 200.60 0.12 0.06由表2.1和表2.2可以看出，黄花蒿不同质量的叶和茎提取的挥发油含量差异比较，很明显黄花蒿叶中挥发油的含量明显比茎中挥发油的含量多，收率也比较高，在提取黄花蒿挥发油时选择提取叶中的挥发油可大大提高挥发油的提取率。2.3.2 不同质量浓度的黄花蒿挥发油的抑菌效果用吐温-80和无菌水配制50.00、25.00、12.50、6.25、3.125 mg/mL的挥发油溶液，采用滤纸片扩散法测定抑菌直径的结果见表2.3。表2.3 黄花蒿挥发油的抑菌活性（抑菌圈直径/mm）测定结果供试菌 黄花蒿挥发油质量浓度（mg/mL） 50 25 12.5 6.25 3.125枯草杆菌 9.1 8.6 6.6 5.3 —粪便链球菌 9.7 9.0 8.3 8.1 6.9 四联球菌 9.6 9.2 8.0 6.6 —产气杆菌 9.0 8.5 8.2 6.8 —变形杆菌 7.0 6.7 6.3 — —黑曲霉 17.1 15.2 13.8 11.6 8.0啤酒酵母酶 15.7 13.4 10.1 9.2 8.7产黄青霉 15.0 13.4 11.2 9.4 7.3 马青梅霉 13.1 12.1 10.2 8.6 7.6 毛霉 11.6 9.4 7.3 6.8 7.0青霉 12.7 10.2 8.6 6.4 —根霉 11.5 10.1 8.1 6.5 — 吐温-80 — — — — — 由表2.3可知，黄花蒿挥发油对供试的5种细菌，7种真菌都有较强的抑菌活性，因此，黄花蒿挥发油具有较广泛的抑菌作用。与细菌比较，真菌对黄花蒿挥发油较为敏感，黄花蒿挥发油对真菌的抑菌效果更加明显。2.3.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定黄花蒿挥发油最低抑菌浓度结果见表2.4。 表2.4 黄花蒿挥发油最低抑菌浓度 挥发油质量浓度（mg/mL） MIC供试菌种 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 枯草杆菌 +++ ++ + + — — — 5粪便链球菌 +++ ++ + + — — — 5四联球菌 +++ +++ ++ + — — — 5产气杆菌 +++ +++ ++ ++ — — — 5变形杆菌 +++ +++ ++ + + — — 10黑曲霉 + + — — — — — 1.25啤酒酵母酶 + + — — — — — 1.25 产黄青霉 ++ + — — — — — 1.25 马青霉 +++ ++ — — — — — 1.25 毛霉 ++ ++ — — — — — 2.5青霉 +++ ++ + — — — — 2.5根霉 +++ ++ + — — — — 2.5吐温-80 — — — — — — — —注：—，菌完全生长；+，菌生长迟缓，形成的菌落很小；++，菌生长比较快，形成菌落较大；+++，菌生长迅速但菌落比较正常小；++++，菌生长迅速与正常相同。由表2.4可以看出，黄花蒿挥发油对真菌的抑菌效果显著高于细菌，黄花蒿挥发油对真菌的MIC<2.5 mg/mL，而对细菌的MIC<10 mg/mL，此结果与滤纸片法结果相一致。总结 （1）通过本实验表明，黄花蒿叶和茎的挥发油含量差异明显，叶中的含量显著高于茎的挥发油含量，通过此实验为黄花蒿挥发油提取产率的提高、能源成本的节约提供一定的理论依据。 （2）从黄花蒿挥发油抑菌实验的结果看出，随着质量浓度的增大，黄花蒿挥发油对供试菌种的抑菌效果均呈上升趋势。黄花蒿挥发油有广泛的抑菌性，黄花蒿挥发油对受试菌种都有很强的抑菌作用，对真菌抑制作用要显著强于细菌的抑菌作用。 中草药中所含的挥发油成分大都具有良好的抗虫、抑菌等生物活性,有很好的开发前景。由于黄花蒿的资源丰富，黄花蒿挥发油含量较高，易提取，有很好的生物活性，所以黄花蒿挥发油有很大的开发潜力。参考文献[1] 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experimental bacteria, and the fungus had a stronger sensitivity to the essential oil of Artemisia. The antimicrobial activity of essential oil from Artemisia to fungi was relatively stable. From strong to weak were Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Penicillium, Mucor, Rhizopus and Ma Qingmei.Key words : Artemisia annua ;essential oil ;fungi bacteria ;minimum inhibitory concentration.1 文献综述1.1 黄花蒿的概况 11.1.1 黄花蒿的鉴别 11.1.2 植物形态 21.2 药用成分 21.2.1 倍半萜类成分 21.2.2 黄酮类成分 21.2.3 挥发性成分 21.2.4 香豆素类成分 21.3 药理作用 21.3.1 抗疟作用 21.3.2 抗菌作用 31.3.3 抗寄生虫作用 31.3.4 解热作用 31.3.5 免疫作用 41.3.6 对心血管系统的作用 41.3.7 其它作用 41.4. 挥发油的研究进展 41.4.1 挥发油简介 41.4.2 挥发油的组成 51.4.3 挥发油的理化性质 61.4.5 本研究的目的和意义 82 实验内容2.1 实验仪器、材料 92.1.1 实验仪器 92.1.2 材料 92.1.3 实验试药 92.1.4 培养基的制备 92.2 实验方法 102.2.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较 102.2.2 纸片法测定抑菌浓度 102.2.3 试管法测定最低抑菌浓度（MIC） 102.3 结果及分析 112.3.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较 112.3.2 不同质量浓度的黄花蒿挥发油的抑菌效果 122.3.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定 12总结 14参考文献 15致谢 181 文献综述1.1 黄花蒿的概况黄花蒿菊科蒿属，别名青蒿、丑蒿、香蒿、苦蒿。为一年生草本植物，地上部分叶片、未开放的花蕾供药用。其有效成分—青蒿素，在抗疟方面与传统的奎宁类抗疟疾病具有不同的作用机理，在全国各地均有分布，是一种传统中草药，其地上部分成为青蒿。据我国药典记载，黄花蒿性苦、辛、寒；归肝、胆经［1］。具有清热解暑、除蒸、截虐的功效［2］。黄花蒿的主要有效成份为青蒿素和挥发油等，现代药理研究表明，黄花蒿具有抗疟、抗病毒、杀螨虫、解热抗炎、抗氧化和提高免疫力等多种功效［3］。研究证实，对黄花蒿采用不同的提取方法和各种有机溶剂进行提取，提取物对多种菌，如金色葡萄球菌、大肠杆菌、单核增多性李氏杆菌和白色念珠菌等均有不同程度的抑菌作用。另一些研究结果显示黄花蒿的有机溶剂提取物对许多植物性病原真菌具有显著的抑制作用。1.1.1 黄花蒿的鉴别1.1.1.1 形状鉴别干燥全草，长约60～100 cm。全株黄绿色，茎圆柱形，上部多分枝，长约30～80 cm， 直径0.2～0.6 cm。表面浅棕色或灰棕色，有纵向棱线，质略硬，易折断且断面粗糙，中央有白色的髓；叶互生，暗绿色或棕绿色，卷缩易碎，完整者展平后为三回羽状深裂，裂片及小裂片矩圆形或长椭圆形，两面被短毛。嫩枝具多数叶片，质脆，易碎裂。带果穗或花序的枝，叶片多已脱落，花序仅残存小球状棕黄色的苞片，如鱼子，质脆易碎。有特异香气，味苦，有清凉感。以色黄绿、气香、无杂质者为佳［4］。1.1.1.2 显微鉴别叶表面制片：①上下表皮细胞不规则，垂周壁波状弯曲，脉脊上的表皮细胞为窄长方形。②不定式气孔微突于表面，保卫细胞肾形。③腺毛呈椭圆形，常充满黄色挥发油，其两个半圆形分泌细胞的排列方向一般与最终裂片的中脉平行。④表面密布丁字形非腺毛，其壁横向延伸或在柄部着生处折成V字形，柄细胞小，单列，3～8个，在中脉附近可见只具有柄细胞的毛［4］。通过最终裂片的中脉横切面：①表皮细胞1列，长椭圆形，排列紧密，可见有气孔、丁字毛及腺毛。②叶肉组织等面型。③上面栅栏组织细胞延续至中脉，下面于中脉处中断。④维管束位于中心［4］。1.1.2 植物形态 一年生草本，高达1.5 m，全体近于无毛。茎直立，圆柱形，表面具有纵浅槽，幼时绿色，老时变为枯黄色；下部木质化，上部多分枝。茎叶互生；3回羽状细裂，裂片先端尖，上面绿色，下面黄绿色，叶轴两侧有狭翅，茎上部的叶，向上渐小，分裂更细。头状花序球形，下垂，排列成金字塔形、具有叶片的圆锥花序，几乎密布在全植物体上部；每一头状花序有短花柄，基部具有或不具有线形苞片；总苞平滑无毛，苞片2～3层，背面中央部分为绿色，边缘呈淡黄色，膜质状而透明；花托矩圆形，花均为管状花，黄色，外围为雌花，仅有雌蕊1枚；中央为两性花，花冠先端5裂，雄蕊5枚，聚药，花药合生，花丝细短，着生于花冠管内面中部，雌蕊1枚，花柱丝状，柱头2裂，呈叉状。瘦果卵形，微小，淡褐色，表面具隆起的纵条纹。花期8～10月。果期10～11月。 生于荒野、山坡、路边及河岸边。分布遍及全国。本植物的果实（黄花蒿子）亦供药用［6］。1.2 药用成分1.2.1 倍半萜类成分青蒿素、 青蒿素G、青蒿甲素、青蒿乙素、青蒿醇、青蒿酸甲酯等。1.2.2 黄酮类成分山奈黄素、槲皮黄素、黄色黄素等。1.2.3 挥发性成分异蒿酮、左旋樟脑、β-丁香烯、β-蒎烯、蒿酮1，8-桉油精、樟脑等。1.2.4 香豆素类成分香豆素、6-甲氧基-7-羟基香豆素、东莨菪内酯等。1.3 药理作用1.3.1 抗疟作用黄花蒿乙醚提取中性部分和其稀醇浸膏对鼠疟、猴疟和人疟均呈显著抗疟作用［7］。体内试验表明，黄花蒿素对疟原虫红细胞内期有杀灭作用，而对红细胞外期和红细胞前期无效。黄花蒿素具有快速抑制原虫成熟的作用。蒿甲醚乳剂的抗疟效果优于还原黄花蒿素琥珀酸钠水剂，是治疗凶险型疟疾的理想剂型。黄花蒿琥酯2。5、5、10、15 mg/kg，2次/天，连续3天，皮肤外搽，治疗猴疟均有不同程度疗效。5、10 mg/kg，2次/天，连续10天，皮肤外搽即可使猴疟转阴。加入适量促透氮酮，可提高抗疟作用［8，9］。脱羰黄花蒿素和碳杂脱羰黄花蒿素对小鼠体内的伯氏疟原虫K173株的ED50和ED90分别为12.6 mg/kg和25.8 mg/kg。体外试验表明，黄花蒿素可明显抑制恶性疟原虫无性体的生长，有直接杀伤作用。黄花蒿素、蒿甲醚和氯喹对恶性疟原虫的IC50分别为75.2，29.4 mol/mL 和43.2 mol/mL。黄花蒿素酯钠对恶性疟原虫6个分离株（包括抗氯喹株）有抑制作用［8，10］。1.3.2 抗菌作用黄花蒿水煎液对表皮葡萄球菌、卡他球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌有较强的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、结核秆菌等也有一定的抑制作用［11］。黄花蒿挥发油在0.25%浓度时，对所有皮肤癣菌有抑菌作用，在1%浓度时，对所有皮肤癣菌有杀菌作用。黄花蒿素有抗流感病毒的作用［12］。黄花蒿酯钠对金葡萄、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌、卡他球菌，甲型和乙型副伤寒秆菌均有一定的抗菌作用［11］。黄花蒿中的谷甾醇和豆甾醇亦有抗病毒作用［12］。1.3.3 抗寄生虫作用黄花蒿乙醚提取物、稀醇浸膏及黄花蒿素对鼠疟、猴疟、人疟均呈显着抗疟作用。体外培养提示，黄花蒿素对疟原虫有直接杀灭作用［13］。电镜观察证明，黄花蒿素主要作用于疟原虫红细胞内期无性体的膜相结构，首先作用于食物色膜、表膜和线粒体膜，其次是核膜和内质网。此外对核内染色体亦有影响。由于食物泡膜发生变化，阻断了疟原虫摄取营养的早期阶段，使疟原虫迅速发生氨基酸饥饿，形成自噬泡，并不断排出体外，使泡浆大量损失，内部结构瓦解而死亡。黄花蒿素对间日疟、恶性疟及抗氯喹地区恶性疟均有疗效高、退热及原虫转阴时间快的特点，尤其适于抢救凶险性疟疾，但复燃率高。此外，黄花蒿尚有抗血吸虫及钩端螺旋体作用［11］。1.3.4 解热作用用蒸馏法制备的黄花蒿注射液，对百、白、破三联疫苗致热的家兔有明显的解热作用［14］。黄花蒿与金银花组方，利用蒸馏法制备的青银注射液，对伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗致热的家免，有比单味黄花蒿注射液更为显着的退热效果，其降温特点迅速而持久，优于柴胡和安痛定注射液对照组。金银花与黄花蒿有协同解热作用［15，16］。 1.3.5 免疫作用用小鼠足垫试验、淋巴细胞转化试验、兔疫特异玫瑰花试验和溶血空斑试验等4项免疫指标观察黄花蒿素的免疫作用，发现黄花蒿素对体液免疫有明显的抑制作用，对细胞免疫有促进作用，可能具有免疫调节作用。黄花蒿素、蒿甲醚有促进脾TS细胞增殖功能。肌肉注射蒿甲醚对Begle大外周血T、B、Tu及Tr淋巴细胞亦有明显抑制作用［17］。亦明显降低正常小鼠血清IgG含量、增加脾脏重量［18］。降低鸡红细胞致敏小鼠血清IgG含量［19］。静脉注射黄花蒿素50～100 mg/kg能显着提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率（50.2～53.1%）和吞噬指数（1.58～1.91%）。黄花蒿素还可提高淋巴细胞转化率，促进细胞免疫作用［12］。黄花蒿琥酯可促进Ts细胞增殖，抑制TE细胞产生，阻止白细胞介素及各种炎症介质的释放，从而起到免疫调节作用［20］。1.3.6 对心血管系统的作用兔心灌注表明，黄花蒿素可减慢心率，抑制心肌收缩力，降低冠脉流量。静脉注射有降血压作用，但不影响去甲肾上腺素的升压反应，认为主要系对心脏的直接抑制所改。静脉注射20 mg/kg黄花蒿素可抗乌头碱所致兔心律失常［8，21］。1.3.7 其它作用黄花蒿琥酯能显著缩短小鼠戊巴比妥睡眼时间。黄花蒿素对实验性矽肺有明显疗效。蒿甲醚对小鼠有辐射防护作用［22］。黄花蒿挥发油和东莨素有明显的镇咳，平喘作用［23］，还有杀灭红细胞配子体，减少细胞破裂及虫体代谢产物的致热原作用［24，25］1.4 挥发油的研究进展 1.4.1 挥发油简介挥发油又称香精油、精油或芳香油。存在植物的腺毛、油管、油室、树脂道或分泌细胞等组织器官中，是一类具有特殊气味、分子量小，常温条件下可随水蒸气蒸出而又与水不混溶的挥发性油状成分的总称。挥发油大多具有多方面较强的生物活性，为中药中一类重要的化学成分。同一品种种植由于生长环境、采收季、挥发油的提取方法等因素不同，挥发油的品质及含量均可能呈现显著的差别［26］。挥发油在植物体在部位常随品种的不同而各异，有的全株都含有，有的则集中于根或根茎、叶、花、果实某一器官。植物中含挥发油随品种不同，存在部位、生长环境、产地或采收季节不同，差异较大，一般在1%以下，也有少数含量较高，高达10%以上，如丁香含挥发油达14%以上。全草类药材一般以开花前期或含苞待放时含量较高，而根茎类药材则以秋天成熟后采集为宜。随着人类生活环境的改变和生活水平的提高，逐渐促使现代医学的由单一疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，从而使中药类产品和其他大自然成分产品有了巨大的市场需求，加之从化学合成中筛选新药周期延长，耗资巨大，产品还有毒副作用大的隐患，人们开始把这种需求的目光转向天然产物。近几年来植物为原材料的药品、功能食品、保健品、日用化妆品的市场不断扩大，而植物挥发油的研究和开发也成为热点之一。早在古代的医疗实践中人们就已经注意到挥发油的许多主要药用价值，如镇咳、平喘、祛痰、解热镇痛、驱风、解痉、健胃、抗菌消炎等。挥发油还具有多种药理活性，如抗炎、抗过敏、抗癌、抗突变、抗菌、抗病毒、抗氧、化驱虫、酶抑制及对神经系统的镇静作用等［27,28］。1.4.2 挥发油的组成1.4.2.1 萜类化合物 挥发油的组成成分中的萜类所占比例最大，且主要是单萜、倍半萜及其含氧衍生物，其含氧衍生物多是该油中生物活性较强或芳香气味的主要成分。如黄花蒿全草含挥发油0.3～0.5%；薄荷油含薄荷醇80%左右；山苍子油含柠檬醛80%左右［29］。1.4.2.2 芳香族化合物组成挥发油的芳香族化合物多为小分子的芳香成分，大多是苯丙素类衍生物，具有C6-C3骨架，有些是一些挥发油的主要组成成分，如黄花蒿中含有芳香族化合物0.3～0.4%；丁香油中约含85%的丁香酚；茴香油、小茴香油、八角茴香油中含50%～80%的茴香脑。有些是萜源化合物，如百里香酚。还有些具有C6-C3或C6-C1骨架的化合物，如花椒油素［29］。1.4.2.3 脂肪族化合物 一些小分子的脂肪族化合物在挥发油中也广泛存在，但含量和作用一般不如萜类和芳香族化合物。如黄花蒿中的青蒿内酯，青蒿醇等；人参挥发油的人参炔醇和鱼腥草挥发油中的癸酰乙醛即鱼腥草素等都属于挥发油中的脂肪族化合物［29］。1.4.2.4 其他类化合物 除了以上三种化合物以外，有些中药经过水蒸气蒸馏能分解出挥发性成分，如芥子油、原白头翁素、大蒜油，也常称之为“挥发油”。这些成分在植物体内，多数以苷形式存在，经酶解后的苷元随水蒸气一同溜出而成油，如黑芥子油是芥子苷经芥子酶水解后产生的异硫氰酸烯丙酯；原白头翁素是毛茛苷水解后产生的化合物；大蒜油则是大蒜中大蒜氨酸经酶水解后产生含大蒜辣素等的挥发性油状物。经有机溶剂分离可得黄酮类、香豆素类、生物碱类等，如黄花蒿中黄酮类主要有3，5-二羟基-6，7，3，4，-四甲氧基黄酮醇，3，5，3，-三羟基-6，7，4，-三甲氧基黄酮，泽兰黄素，鼠李黄素等；黄花蒿中的香豆素类主要有6-甲氧基香豆素，东莨菪内酯，6，8-二甲基-7-羟基香豆素等。此外，如川芎、麻黄等挥发油中的川芎嗪以及烟碱［29］。1.4.3 挥发油的理化性质1.4.3.1 形状常温下挥发油大多为无色或淡黄色的油状液体，少数挥发油有其他颜色，如黄花蒿的挥发油淡黄色，艾叶油显蓝绿色，麝香草油显红色，桂皮油显红棕色。有些挥发油主要成分在低温下可以析出结晶，这种析出物习称为“脑”，如薄荷脑、樟脑，此过程亦被称为“析脑”。滤去析出物的油称为“脱脑油”。挥发油大多具有特殊而强烈的香气和辛辣味，少数具有难闻的臭气和腥气味，如土荆芥油有臭气，鱼腥草油有腥气味。挥发油的气味有时可作为其品质优劣的标志。芳香性挥发油在药剂上还常用作矫味剂［29］。1.4.3.2 挥发性挥发油在常温下可自然挥发，如滴在纸片上可自行挥发，且不留下持久性的油斑，借此可与脂肪油相区别［29］。1.4.3.3 溶解性挥发油不溶于水，而易溶于各种有机溶剂，如石油醚、乙醚、二硫化碳、油脂等。在高浓度乙醇中能全部溶解，然而在低浓度乙醇中只能溶解一部分［29］。1.4.3.4 物理常数挥发油多数比水轻，也有的比水重（如丁香油、桂皮油），相对密度一般0.850～1.065之间。挥发油几乎均有光学活性，比旋度在+97°～117°范围内。多具有强的折光性，折光率在1.43～1.61之间。挥发油的沸点一般在70 ℃～300 ℃ 之间［29］。1.4.3.5 不稳定性挥发油与空气、光线经常接触会逐渐氧化变质，使挥发油的相对密度增加，颜色变深，失去原有香味，形成树脂样物质，不能随水蒸气蒸馏。因此，制备挥发油方法的选择要合适，产品也要装入棕色瓶内用密塞塞好并低温保存。另外，挥发油组成成分常含有双键、醇羟基、醛、酮、酸性基团、内酯等结构，故相应的能与溴及亚硫酸氢钠发生加成反应、与肼类产生缩合反应、异羟肟酸铁反应。皂化反应及遇碱成盐反应等［29］。1.4.4 国内外关于该论题的研究现状和发展趋势为了探讨黄花蒿挥发油提取产业化的可行，我国将对某些地区野生黄花蒿进行了挥发油的含量测定。黄花蒿为重要的药用植物，富含多种挥发性和非挥发性的活性成分。挥发性的主要成分是挥发油，在植物体内的量约为0.2%-0.5% 。但其量及成分因地区分布不同而差异很大。如湖南雪峰山地区野生黄花蒿挥发油收油率为0.5% ，鉴定出45个化学成分［30］；甘肃地区的野生黄花蒿挥发油超临界CO2萃取提取得率为1.2% ，鉴定出86种化合物［31］；从山东地区黄花蒿挥发油中共鉴定出59个化学成分[32]。黄花蒿挥发油中萜类和半萜类化合物含量高达90% 以上[33]，萜类化合物在生活中常被用作食品、医药、农药和食品添加剂、动物添加剂等，由于其功效特殊，用途广泛，开发前景十分广阔，在我国实际上已逐渐成为研究热点[3]。我们生存的环境中存在着大量有害的微生物，许多有害致病菌威胁着人们的健康，而同时，这给食品的生产、食用、保存也带来了众多的不便。为抑制有害微生物的生长，避免其对人类健康的危害，人们将化学防腐剂应用于食品生产中。但经长期研究发现，许多使用的合成防腐剂有引起食物中毒等潜在危害，有的甚至会使人致畸、致癌，危害令人难以想象。同时还存在着防腐效果难以控制的问题，因为合成的防腐剂易受到微生物种类、溶解度以及pH值等诸多因子的影响。由于种种原因，很难找到理想的抑菌抗菌物质，使得开发新型合成抗菌防腐剂的难度在不断增大。由于上述原因，天然抗菌防腐剂的使用受到人们的青睐，也显得尤为重要。而天然抗菌防腐剂可选用天然抗菌物质为原料研制，也可直接使用天然物质作抗菌防腐剂。其来源有动植物源抗菌防腐剂和微生物源抗菌防腐剂，具体可作为抗菌剂的物质包括精油、生物碱、和多糖等[34]。临床上，由于长期使用合成的抗生素，大多数的敏感菌株不断被杀灭，而耐药菌株则会大量繁殖，取代敏感菌株，而使细菌的耐药率不断升高。同时药物不良反应也在逐步增加，问题也变得日趋严重，这种局面使临床用药受到一定限制，急需新型天然的抑菌药物[35]。然而由于中草药成分的复杂性，有抑菌作用的中草药，其作用成分可能是其所含的某一单一成分，也可能是多种成分的协同作用，所以其抗菌作用显得尤为复杂。而通常，中草药中所含的挥发油成分都具有良好的抗虫、抑菌生物活性本章实验。在考虑到这些因素的情况下，综合现实因素，选择常见的菌种：变形杆菌、枯草杆菌、四联球菌、产气杆菌、粪便链球菌，以及根霉、青霉、黑曲霉、毛霉、马青酶、产黄青酶、啤酒酵母菌作为观察研究对象，对黄花蒿挥发油进行了体外抑菌杀菌活性试验。1.4.5 本研究的目的和意义黄花蒿菊科蒿属，性苦、辛、寒；归肝胆经[1]。具有清热解暑，除蒸，截疟的功效[2]。黄花蒿的主要有效成为青蒿素和挥发油等，黄花蒿挥发油具有抗疟疾、抗病毒、杀螨虫、解热抗炎、抗氧化和提高免疫力等[3]。本实验是以水蒸汽蒸馏法，提取黄花蒿叶和茎的挥发油，比较叶和茎的挥发油含量，进而提高黄花蒿挥发油的提取产率；研究了黄花蒿挥发油对几种常见细菌和真菌的抑制作用，测定抑菌浓度，为黄花蒿挥发油的进一步利用奠定基础。2 实验内容2.1 实验仪器、材料2.1.1 实验仪器圆底烧瓶、锥形瓶、冷凝管、移液管、打孔机、无菌操作台等。 2.1.2 材料秦岭野生黄花蒿全草鲜品2.1.2.1 供试菌种细菌：变形杆菌、枯草杆菌、四联球菌、产气杆菌和粪便链球菌真菌：根霉、青霉、毛霉、马青霉、产黄青霉、黑曲霉和啤酒酵母酶 以上供试菌均来自于广东环凯微生物科技有限公司。2.1.2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基（细菌用）、沙保培养基（真菌用），121 ℃高压灭菌20 min ，备用。2.1.3 实验试剂吐温-80（广州苏穗化工有限公司）、乙醚（广州钱盛化工有限公司）；牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）、氯化钠（分析纯，广东光华科技股份有限公司）、琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司）、蒸馏水2.1.4 培养基的制备2.1.4.1 牛肉蛋白胨培养基量取1000 mL 蒸馏水，将牛肉膏取3.2 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.1 g微热，待其完全溶解后，再加入琼脂19.3 g，使其充分溶解。装入锥形瓶中，加塞，调整酸碱度为ph 6.8～7.4置于蒸汽灭菌器中，在103.43 KPa、121 ℃下高压灭菌20 min后，取出，备用。2.1.4.2 沙保培养基量取1000 mL蒸馏水，麦芽糖40.2 g、蛋白胨10.0 g、使其充分溶解，再加入琼脂20.5 g再使其充分溶解，装入锥形瓶中，加塞，调整酸碱度为ph 4.0～6.0。2.2 实验方法2.2.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较采用水蒸气蒸馏法提取［36］（挥发油与水不相溶，当受热后，二者蒸汽压的总和与大气压相等时，溶液即开始沸腾，继续加热则挥发油可随水蒸气蒸馏出来）：分别称取黄花蒿叶和茎质量的各5份，叶的分别为70.25 g、70.55 g、70.45 g、70.12 g、70.46 g，分别放入圆底烧瓶中，再分别加入500 mL蒸馏水；茎的分别为200.55 g、200.50 g、200.25 g、200.65 g、200.60 g，再分别放入圆底烧瓶中，分别加入1600 mL蒸馏水，加热蒸馏2 h，蒸馏完毕后，取少量的乙醚分别冲洗冷凝管，等充分分层后，分别收集乙醚层，挥干乙醚得到淡黄色油状物即为黄花蒿挥发油，得到的叶和茎的挥发油分别标记为1、2、3、4、5；6、7、8、9、10。2.2.2 纸片法测定抑菌浓度将2.2.1中得到的黄花蒿挥发油，用吐温-80乳化，再溶解与一定体积的水中，（精密定量配挥发油和水的量）制成3.125-50.00 mg/mL（3.125，6.25，12.5，25.00，50.00 mg/mL）倍比稀释的不同浓度梯度的溶液，放置冰箱中4 ℃保存备用［36］。采用滤纸片法测定水蒸气蒸馏法提取的黄花蒿挥发油的抑菌活性［37］。用打孔器将干净的滤纸制成直径为0.5 cm的小圆纸片若干个，干热灭菌后，分别浸入不同质量浓度的溶液中，使其充分的吸收，备用。在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量的无菌水，制成菌悬液，用无菌的1 mL移液管吸收取菌悬液，注入平板，涂布均匀。将浸泡处理过的滤纸片沥干，贴在上述含菌平板上，每个平板上贴3片相同的黄花蒿挥发油质量浓度的滤纸片。吐温-80和无菌水的混合液作为空白对照，反复3次。置于培养箱中，细菌32 ℃培养24～48 h，真菌28 ℃培养3～5 h。取出量取抑菌圈直径，测量实验结果，取平均值。2.2.3 试管法测定最低抑菌浓度（MIC）根据滤纸片法所得的结果，采用试管法对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定（MIC) ［38,39］。培养基以每管总体积5 mL，分装与试管中，121 ℃，0.1 MPa条件下灭菌20 min。当灭菌培养基冷却至50 ℃左右时，加入黄花蒿挥发油，倍比稀释成 0.3125-20.00 mg/mL（0.3125 mg/mL，0.625 mg/mL，1.25m g/mL，2.50 mg/mL，5.00 mg/mL，10.00 mg/mL，20.00 mg/mL）梯度的质量浓度，充分混匀，无菌水作对照，分别制成斜面。将生长良好的受试菌划线接种于斜面上，细菌放于32 ℃温箱中培养24～48 h，观察菌落的生长状态。真菌放于28 ℃温箱中培养3～5 d，观察菌落生长状态。取完全不生长状态管样品最低质量浓度为最低抑菌浓度（MIC)。2.3 结果及分析2.3.1 黄花蒿叶和茎中挥发油的比较 水蒸气蒸馏法提取黄花蒿叶和茎中的挥发油结果见表2.1和表2.2。表2.1 黄花蒿叶盛期叶部挥发油含量测定结果序号 样品（g） 挥发油（g） 收率（%） 1 70.25 0.87 1.25 2 70.55 0.84 1.203 70.45 0.85 1.214 70.12 0.86 1.225 70.46 0.87 1.23表2.2 叶盛期茎中挥发油含量测定结果序号 样品（g） 挥发油（g） 收率（%） 6 200.55 0.12 0.06 7 200.50 0.12 0.06 8 200.25 0.10 0.05 9 200.65 0.08 0.04 10 200.60 0.12 0.06由表2.1和表2.2可以看出，黄花蒿不同质量的叶和茎提取的挥发油含量差异比较，很明显黄花蒿叶中挥发油的含量明显比茎中挥发油的含量多，收率也比较高，在提取黄花蒿挥发油时选择提取叶中的挥发油可大大提高挥发油的提取率。2.3.2 不同质量浓度的黄花蒿挥发油的抑菌效果用吐温-80和无菌水配制50.00、25.00、12.50、6.25、3.125 mg/mL的挥发油溶液，采用滤纸片扩散法测定抑菌直径的结果见表2.3。表2.3 黄花蒿挥发油的抑菌活性（抑菌圈直径/mm）测定结果供试菌 黄花蒿挥发油质量浓度（mg/mL） 50 25 12.5 6.25 3.125枯草杆菌 9.1 8.6 6.6 5.3 —粪便链球菌 9.7 9.0 8.3 8.1 6.9 四联球菌 9.6 9.2 8.0 6.6 —产气杆菌 9.0 8.5 8.2 6.8 —变形杆菌 7.0 6.7 6.3 — —黑曲霉 17.1 15.2 13.8 11.6 8.0啤酒酵母酶 15.7 13.4 10.1 9.2 8.7产黄青霉 15.0 13.4 11.2 9.4 7.3 马青梅霉 13.1 12.1 10.2 8.6 7.6 毛霉 11.6 9.4 7.3 6.8 7.0青霉 12.7 10.2 8.6 6.4 —根霉 11.5 10.1 8.1 6.5 — 吐温-80 — — — — — 由表2.3可知，黄花蒿挥发油对供试的5种细菌，7种真菌都有较强的抑菌活性，因此，黄花蒿挥发油具有较广泛的抑菌作用。与细菌比较，真菌对黄花蒿挥发油较为敏感，黄花蒿挥发油对真菌的抑菌效果更加明显。2.3.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定黄花蒿挥发油最低抑菌浓度结果见表2.4。 表2.4 黄花蒿挥发油最低抑菌浓度 挥发油质量浓度（mg/mL） MIC供试菌种 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 枯草杆菌 +++ ++ + + — — — 5粪便链球菌 +++ ++ + + — — — 5四联球菌 +++ +++ ++ + — — — 5产气杆菌 +++ +++ ++ ++ — — — 5变形杆菌 +++ +++ ++ + + — — 10黑曲霉 + + — — — — — 1.25啤酒酵母酶 + + — — — — — 1.25 产黄青霉 ++ + — — — — — 1.25 马青霉 +++ ++ — — — — — 1.25 毛霉 ++ ++ — — — — — 2.5青霉 +++ ++ + — — — — 2.5根霉 +++ ++ + — — — — 2.5吐温-80 — — — — — — — —注：—，菌完全生长；+，菌生长迟缓，形成的菌落很小；++，菌生长比较快，形成菌落较大；+++，菌生长迅速但菌落比较正常小；++++，菌生长迅速与正常相同。由表2.4可以看出，黄花蒿挥发油对真菌的抑菌效果显著高于细菌，黄花蒿挥发油对真菌的MIC<2.5 mg/mL，而对细菌的MIC<10 mg/mL，此结果与滤纸片法结果相一致。总结 （1）通过本实验表明，黄花蒿叶和茎的挥发油含量差异明显，叶中的含量显著高于茎的挥发油含量，通过此实验为黄花蒿挥发油提取产率的提高、能源成本的节约提供一定的理论依据。 （2）从黄花蒿挥发油抑菌实验的结果看出，随着质量浓度的增大，黄花蒿挥发油对供试菌种的抑菌效果均呈上升趋势。黄花蒿挥发油有广泛的抑菌性，黄花蒿挥发油对受试菌种都有很强的抑菌作用，对真菌抑制作用要显著强于细菌的抑菌作用。 中草药中所含的挥发油成分大都具有良好的抗虫、抑菌等生物活性,有很好的开发前景。由于黄花蒿的资源丰富，黄花蒿挥发油含量较高，易提取，有很好的生物活性，所以黄花蒿挥发油有很大的开发潜力。参考文献[1] 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