复方脑肽神经节苷脂注射液呼吸活力测定研究(附件)
摘 要呼吸活力测定即生物活性测定是利用药物对于生物体（整体动物、离体组织、微生物或细胞等）的作用以测定其效价或其活性大小的一种方法。复方脑肽神经节甘质注射液属于多组分生化药注射剂，按照国家技术标准要求，必须测试其生物活性，本研究以复方脑肽神经节苷脂注射液为研究对象，确定其呼吸活力测定方法及样品加样量，为提高复方脑肽神经节苷脂注射液质量标准提供依据。本研究中采用国产微量呼吸检压仪测定活力，并对选定的试验方法进行重复性，确定加样量，并对不同批次的注射液进行呼吸活力测定，并计算刺激因子。明确复方脑肽神经节苷脂注射液呼吸活力测定的方法。 目 录
1 引言
1.1 论文选题的目的和意义 1
1.2 多组分生化药呼吸活力测定研究进展 1
1.2.1 呼吸活力测定在多组分药物质量控制中的应用 2
1.2.2 活力表示方法 2
1.2.3 呼吸活力测定方法在多组分生化药注射剂中应用的可行性研究 3
1.3 复方脑肽神经节苷脂注射液的研究 4
1.3.1 主要成分 4
1.3.2 复方脑肽神经节苷脂注射液生物活性研究 5
2 呼吸活力测定试验
2.1 仪器和试剂 6
2.1.1 仪器 6
2.1.2 试剂 6
2.2 方法 7
2.2.1 肝匀浆液制备 7
2.2.2 测定法 7
2.2.3 计算 8
2.3 结果 8
2.3.1 供试品加样量实验 8
2.3.2 重复性试验 9
2.3.3 复方脑肽神经节苷脂注射液呼吸活力测定实验 9
讨论与结论
1 讨论 10
2 结论 11
参考文献 12
致谢 14
1 引言
1.1 论文选题的目的和意义
近几年，药品的安全性、稳定性和有效性等问题越来越受到社会关注，国家食品药品监督管理总局对药品生产及质量控制也越来越重视。目前对于一些化学结构明确，构效关系清楚的单组份化学药品，多
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讨论与结论
1 讨论 10
2 结论 11
参考文献 12
致谢 14
1 引言
1.1 论文选题的目的和意义
近几年，药品的安全性、稳定性和有效性等问题越来越受到社会关注，国家食品药品监督管理总局对药品生产及质量控制也越来越重视。目前对于一些化学结构明确，构效关系清楚的单组份化学药品，多采用定性、定量的测定有效成分和有关物质等方法控制产品质量，而多组分生化药有效成分不是特别清楚、成分十分复杂，又无明确的构效关系，单纯的定性定量的测定有效成分来控制产品质量的方法并不合适，为了提高多组分生化药的质量控制水平，在含量测定的基础上，加入了呼吸活力测定作为质量控制的又一手段。呼吸活力测定即生物活性测定是利用药物对于生物体（整体动物、离体组织、微生物或细胞等）的作用以测定其效价或其活性大小的一种方法。以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试药品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量比例，来测得供试药品的活力[1]。活力即生物活性是代谢作用的重要指标之一，注射液的呼吸活力测定主要用于检验产品的药效，是国家食品药品监督管理局对多组分生化药注射剂检验的基本要求，是药品生产企业对产品质量控制的重要手段之一。活力的测定受多种因素的影响，实验结果往往不能令人满意，目前关于多组分生化药注射剂呼吸活力测定的报道较少。
复方脑肽神经节苷脂注射液是由多肽、次黄嘌呤和神经节苷脂等成分组成的一种多组分生化药注射剂，是以动物组织为原料提取的具有多种活性的复方制剂，根据食品药品监督管理局颁布的多组分生化药注射剂技术要求，应该测定生物活性，本研究欲通过复方神经节苷脂注射液呼吸活力测定的研究，确定测定方法，极限剂量等，为产品质量控制提供依据，为复方脑肽神经节苷脂质量标准的提高增奠定理论基础。
1.2 多组分生化药呼吸活力测定研究进展
在现行药品标准中，呼吸活力测定主要应用于多组分的药品标准中，如生物药品、生化药品、生物技术药品和少量的中成药[24]。中国药典2010年版三部收载生物制品，首次将《中国生物制品规程》并入药典。药典三部收载101种，均采用了相应方法测定其生物活性。中国药典2015年版二部收载生化制品109个，其中32个品种有生物活性测定方法[5]。
1.2.1 呼吸活力测定在多组分药物质量控制中的应用
目前，绝大多数注射剂主要使用理化分析方法，化学成份的定性、定量测定是现行中药质量控制的常用方法[6]。这种方法，通常针对已知的1～2种指标成分或活性成分，进行定性鉴别和定量测定，但多组分生化药品的质量稳定性单靠测定已知的有效成分是不够的，它是以其整体作为有效物质[7,8]。在生化药物的质量控制中，单纯依赖化学成分测定方法，难以达到有效控制制剂疗效的目的。近年来发展的中药指纹图谱技术，虽能较好地反映生化药物多组分现状，但也不与药效呈相关性[9]，现在指纹图谱的研究与应用限定在鉴别范畴。在多组分生化注射剂基本技术要求（试行）中明确提出：如终产品具有生物活性，则应建立起生物活性测定方法，测定指标应跟药物的治疗作用密切相关，生化药物，如能找到较好的方法进行生物活性测定，使药物的生物活性与临床药效直接相关。近年来采用小鼠、大鼠急性肝损伤保护实验测定肝炎灵的活性[10]；采用小鼠脑血栓形成实验和小鼠脑循环障碍实验测定灯盏花素注射液的生物活性[11]；采用平衡析法测定血浆蛋白结合率[12]。药物血浆蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一，影响药物在体内的分布、排泄和代谢速率，与药物的药理药效作用密切相关[13]。目前，国内外采用斑马鱼建立了止血、炎症、细胞凋亡、细胞增殖等动物模型，相继开展了对止血、抗炎、抗肿瘤药物的相关生物活性研究。采用斑马鱼体内实验与小鼠体内实验相比，优势明显，获得了一系列研究成果[14,15]。这些方法既可用于控制产品的质量，又能起到保证临床用药安全有效的目的。生物活性测定的原理能够体现和说明药物的“功能主治”，能够体现药物的主要药效。我们希望采用生物活性测定方法与主要活性成分理化分析方法相结合的中药质量标准，应更能全面综合的控制中药的安全性和有效性，从而有效的推动中药在全球的使用面。
1.2.2 活力表示方法
在药品质量控制中，目前药典中呼吸活力测定表示方法通常有2种，一种用百分含量表示，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物，这类药物一般结构明确、组分单一、产品高纯。用常规方法来进行质量控制，常用物理化学方法和生化鉴别法，如化学鉴别法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、酶法、电泳法、样品脱盐后用等电点聚焦法测定。另一种用生物效价或酶活力单位表示，适用于酶类、蛋白质类等药物的测定。蛋白质、多糖、多肽、核酸类等大分子的化合物，有的化学结构不确定，分析时需进行纯度检查和分子量的测定[17]。对大分子的药物而言，即使组分相同，由于分子量不同而产生不同的生理活性。一般用传统工艺生产，导致生化药品有时结构不明、组分变异、产品不纯。呼吸活力测定法检测生化药品生物活性，利用生物体进行试验来测定药品的活性，以此来评定药品质量的优劣和安全性。
1.2.3 呼吸活力测定方法在多组分生化药注射剂中应用的可行性研究
呼吸活力测定方法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用，长期以来是检验药品质量的重要检验方法，特别适用于成分复杂、具有多种活性成分和未知药效或毒性成分的药品[18]，多组分生化药的药材来源广泛、多变、制备工艺复杂，使得其制剂的质量控制比较困难，此外，多组分生化药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效，我们需要采用生物活性测定与主要活性成分理化分析方法相结合的方式，综合评价其质量，保证药品的安全性、有效性和质量可控性。目前，用生物活性方法测定多组分生化药的内在活性质量的研究在国内外均已开始进行探索。2008年国家
1 引言
1.1 论文选题的目的和意义 1
1.2 多组分生化药呼吸活力测定研究进展 1
1.2.1 呼吸活力测定在多组分药物质量控制中的应用 2
1.2.2 活力表示方法 2
1.2.3 呼吸活力测定方法在多组分生化药注射剂中应用的可行性研究 3
1.3 复方脑肽神经节苷脂注射液的研究 4
1.3.1 主要成分 4
1.3.2 复方脑肽神经节苷脂注射液生物活性研究 5
2 呼吸活力测定试验
2.1 仪器和试剂 6
2.1.1 仪器 6
2.1.2 试剂 6
2.2 方法 7
2.2.1 肝匀浆液制备 7
2.2.2 测定法 7
2.2.3 计算 8
2.3 结果 8
2.3.1 供试品加样量实验 8
2.3.2 重复性试验 9
2.3.3 复方脑肽神经节苷脂注射液呼吸活力测定实验 9
讨论与结论
1 讨论 10
2 结论 11
参考文献 12
致谢 14
1 引言
1.1 论文选题的目的和意义
近几年，药品的安全性、稳定性和有效性等问题越来越受到社会关注，国家食品药品监督管理总局对药品生产及质量控制也越来越重视。目前对于一些化学结构明确，构效关系清楚的单组份化学药品，多
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讨论与结论
1 讨论 10
2 结论 11
参考文献 12
致谢 14
1 引言
1.1 论文选题的目的和意义
近几年，药品的安全性、稳定性和有效性等问题越来越受到社会关注，国家食品药品监督管理总局对药品生产及质量控制也越来越重视。目前对于一些化学结构明确，构效关系清楚的单组份化学药品，多采用定性、定量的测定有效成分和有关物质等方法控制产品质量，而多组分生化药有效成分不是特别清楚、成分十分复杂，又无明确的构效关系，单纯的定性定量的测定有效成分来控制产品质量的方法并不合适，为了提高多组分生化药的质量控制水平，在含量测定的基础上，加入了呼吸活力测定作为质量控制的又一手段。呼吸活力测定即生物活性测定是利用药物对于生物体（整体动物、离体组织、微生物或细胞等）的作用以测定其效价或其活性大小的一种方法。以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试药品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量比例，来测得供试药品的活力[1]。活力即生物活性是代谢作用的重要指标之一，注射液的呼吸活力测定主要用于检验产品的药效，是国家食品药品监督管理局对多组分生化药注射剂检验的基本要求，是药品生产企业对产品质量控制的重要手段之一。活力的测定受多种因素的影响，实验结果往往不能令人满意，目前关于多组分生化药注射剂呼吸活力测定的报道较少。
复方脑肽神经节苷脂注射液是由多肽、次黄嘌呤和神经节苷脂等成分组成的一种多组分生化药注射剂，是以动物组织为原料提取的具有多种活性的复方制剂，根据食品药品监督管理局颁布的多组分生化药注射剂技术要求，应该测定生物活性，本研究欲通过复方神经节苷脂注射液呼吸活力测定的研究，确定测定方法，极限剂量等，为产品质量控制提供依据，为复方脑肽神经节苷脂质量标准的提高增奠定理论基础。
1.2 多组分生化药呼吸活力测定研究进展
在现行药品标准中，呼吸活力测定主要应用于多组分的药品标准中，如生物药品、生化药品、生物技术药品和少量的中成药[24]。中国药典2010年版三部收载生物制品，首次将《中国生物制品规程》并入药典。药典三部收载101种，均采用了相应方法测定其生物活性。中国药典2015年版二部收载生化制品109个，其中32个品种有生物活性测定方法[5]。
1.2.1 呼吸活力测定在多组分药物质量控制中的应用
目前，绝大多数注射剂主要使用理化分析方法，化学成份的定性、定量测定是现行中药质量控制的常用方法[6]。这种方法，通常针对已知的1～2种指标成分或活性成分，进行定性鉴别和定量测定，但多组分生化药品的质量稳定性单靠测定已知的有效成分是不够的，它是以其整体作为有效物质[7,8]。在生化药物的质量控制中，单纯依赖化学成分测定方法，难以达到有效控制制剂疗效的目的。近年来发展的中药指纹图谱技术，虽能较好地反映生化药物多组分现状，但也不与药效呈相关性[9]，现在指纹图谱的研究与应用限定在鉴别范畴。在多组分生化注射剂基本技术要求（试行）中明确提出：如终产品具有生物活性，则应建立起生物活性测定方法，测定指标应跟药物的治疗作用密切相关，生化药物，如能找到较好的方法进行生物活性测定，使药物的生物活性与临床药效直接相关。近年来采用小鼠、大鼠急性肝损伤保护实验测定肝炎灵的活性[10]；采用小鼠脑血栓形成实验和小鼠脑循环障碍实验测定灯盏花素注射液的生物活性[11]；采用平衡析法测定血浆蛋白结合率[12]。药物血浆蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一，影响药物在体内的分布、排泄和代谢速率，与药物的药理药效作用密切相关[13]。目前，国内外采用斑马鱼建立了止血、炎症、细胞凋亡、细胞增殖等动物模型，相继开展了对止血、抗炎、抗肿瘤药物的相关生物活性研究。采用斑马鱼体内实验与小鼠体内实验相比，优势明显，获得了一系列研究成果[14,15]。这些方法既可用于控制产品的质量，又能起到保证临床用药安全有效的目的。生物活性测定的原理能够体现和说明药物的“功能主治”，能够体现药物的主要药效。我们希望采用生物活性测定方法与主要活性成分理化分析方法相结合的中药质量标准，应更能全面综合的控制中药的安全性和有效性，从而有效的推动中药在全球的使用面。
1.2.2 活力表示方法
在药品质量控制中，目前药典中呼吸活力测定表示方法通常有2种，一种用百分含量表示，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物，这类药物一般结构明确、组分单一、产品高纯。用常规方法来进行质量控制，常用物理化学方法和生化鉴别法，如化学鉴别法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、酶法、电泳法、样品脱盐后用等电点聚焦法测定。另一种用生物效价或酶活力单位表示，适用于酶类、蛋白质类等药物的测定。蛋白质、多糖、多肽、核酸类等大分子的化合物，有的化学结构不确定，分析时需进行纯度检查和分子量的测定[17]。对大分子的药物而言，即使组分相同，由于分子量不同而产生不同的生理活性。一般用传统工艺生产，导致生化药品有时结构不明、组分变异、产品不纯。呼吸活力测定法检测生化药品生物活性，利用生物体进行试验来测定药品的活性，以此来评定药品质量的优劣和安全性。
1.2.3 呼吸活力测定方法在多组分生化药注射剂中应用的可行性研究
呼吸活力测定方法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用，长期以来是检验药品质量的重要检验方法，特别适用于成分复杂、具有多种活性成分和未知药效或毒性成分的药品[18]，多组分生化药的药材来源广泛、多变、制备工艺复杂，使得其制剂的质量控制比较困难，此外，多组分生化药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效，我们需要采用生物活性测定与主要活性成分理化分析方法相结合的方式，综合评价其质量，保证药品的安全性、有效性和质量可控性。目前，用生物活性方法测定多组分生化药的内在活性质量的研究在国内外均已开始进行探索。2008年国家
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