水稻基因组中dr位点的rtpcr验证
DNA-RNA杂合体是真核生物基因转录过程的自然产物，对真核生物基因表达具有重要的调节作用。对部分通过DRIP-seq方法在全基因组水平鉴定的DNA-RNA杂合体位点进行RT-PCR验证，将有助于证实生物信息学分析方法的可信度。本研究以水稻野生型日本晴为研究对象，利用链特异性RT-PCR技术，首次验证了用于鉴定植物全基因组DNA-RNA杂合体位点的DRIP-seq新方法，初步证明该方法的可靠性，并证实了DRIP-seq技术在水稻体系中已初步建立；为进一步分析DNA-RNA杂合体对水稻基因表达的调节作用奠定了坚实的基础，同时为下一步在植物体系中广泛运用该方法奠定了初步基础。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 水稻材料 4
1.2 水稻基因组DNA提取 4
1.3 水稻总RNA提取 5
1.4 DR位点验证 5
1.5 可变剪切验证 6
2 结果与分析 7
2.1 DR验证结果 7
2.2 AS验证结果 7
3 讨论 8
3.1 水稻基因组中DNARNA杂合体位点的验证 8
3.2 水稻基因组中杂合体位点基因的选择性剪切验证 9
致谢 9
参考文献 9
附录A 水稻基因组DNARNA杂合体验证结果及合成的特异引物 11
附录B 水稻基因组中DNARNA杂合体位点基因的选择性剪切验证合成引物及测序结果 14
水稻基因组中DR位点的RTPCR验证
引言
引言 模式真核生物基因组的最新研究结果表明，除基因组较小的酿酒酵母外，与编码蛋白质基因相比，非编码RNAs（noncoding RNAs, ncRNAs）基因在人和动植物基因组中占了绝大部分比例。例如，人和拟南芥基因组中非编码RNAs基因分别大约占了98%和71%。越来越多的研究结果证实，在转录和转录后水平，作为功能性RNAs分子的非编码RNAs可通过调节相关基因表达来介导动植物胚胎发育、细胞分化、组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
织器官发生、信号转导和衰老等正常生长发育过程。另外，非编码RNAs在逆境应答、重大疾病的发生和发展等过程也同样有着十分重要的调节功能。
目前，植物的研究结果表明，植物ncRNAs在植物正常生长发育及逆境胁迫应答等过程同样发挥了重要调节作用，如植物开花、生物和非生物胁迫应答反应等。并且部分小RNAs的产生及调节机制研究相对比较清楚，但相比之下，植物lncRNAs的研究仍处于起步阶段，其作用机制还有待于进一步深入研究。真核生物基因组的转录过程中，一些位点新生RNA链与其DNA模版链结合形成DNARNA两链体结构，这种结构也称为Rloops（如图1）。最近越来越多的研究结果表明，在人和酵母基因组中，lncRNAs可通过形成Rloop结构（DNARNA杂合体）来发挥重要的生物学功能。目前已运用DRIPseq或DRIPchip方法在全基因组水平鉴定了人和酵母DNARNA杂合体位点。Rloops的形成是基因组转录过程的自然产物，它在基因表达、染色质结构调整以及基因组动态变化过程中扮演了重要的角色[1]。但在植物基因组中，lncRNAs是否能通过与相关DNA形成DNARNA杂合体来介导其功能的报道还不多见。
图1.DNARNA杂合体示意图
特别是，与酵母和人相比，植物DNARNA杂合体（DR）的鉴定及功能研究远远滞后。因此，在植物中开展DNARNA杂合体的鉴定以及分析DNARNA杂合体调控基因表达、选择性剪切等生物学过程的表观遗传学机理分析，一方面有利于鉴定新的ncRNAs，特别是lncRNAs，从而大大丰富植物ncRNAs的数量和类型。另一方面有利于明确植物基因组中DNARNA杂合体（Rloops）调控基因表达和选择性剪切等生物事件的表观遗传学机理，从而为植物ncRNA的研究提供新的思路。目前我们已初步建立了水稻幼苗组织的DNARNA杂合体富集方法（DRIPseq）。该方法的建立将有利于物种特异（如单子叶与双子叶植物和C3和C4植物等）、组织特异（如根、叶及花等组织）及生物与非生物胁迫相关的ncRNA的大规模鉴定与功能分析，从而丰富和推动植物RNA组学研究进程。
同一mRNA前体（premRNA）在产生成熟mRNA的过程中剪除内含子的方式可能不同，这种机制最早在1978年由Walter Gilbert首先描述，并称之为可变剪接（Alternative splicing, AS）。可变剪接被认为是导致蛋白功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物[2]。研究Rloops的存在和可变剪切发生的相关性有助于进一步了解Rloops的表观调节机制。通过DRIPseq我们初步鉴定了水稻基因组的DNARNA杂合体位点（如图2），初步统计了其数量以及在全基因组的分布情况。相关性分析的初步结果表明，含有Rloops的基因发生选择性剪切的机率要明显高于不含有Rloops的基因，从而暗示Rloops可能参与了基因选择性剪切事件。
图2.生物信息学方法对LOC_Os04g01230基因的分析结果
但是目前我们还不清楚通过DRIPseq方法鉴定的DNARNA杂合体位点的准确程度如何，因此本研究主要通过连特异RTPCR对DRIPseq方法鉴定的水稻基因组DR位点的可靠性进行验证。同时验证了DR的存在影响基因选择性剪切的真实性。该研究可初步证明DRIPSeq所鉴定的DR位点的可靠性，从而证实了DRIPseq技术在水稻体系中已初步建立。为进一步在水稻全基因组水平分析DR位点的表观遗传学结构特征以及对基因表达的调节作用奠定了初步基础，并为下一步在植物体系中广泛运用该方法奠定了必要的前期基础
材料与方法
水稻材料
水稻粳亚种日本晴，国际水稻基因组计划中作为典型粳稻基因组供体，已经完成基因组测序，序列信息以及后基因组研究信息已比较全面，相关数据可在NCBI等国际公用数据库查询。试验材料为水培（国际水稻所水稻专用营养液配方）2周的日本晴水稻幼苗，种子来自扬州大学农学院于恒秀课题组，种植于大学理科楼的植物培养室。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 水稻材料 4
1.2 水稻基因组DNA提取 4
1.3 水稻总RNA提取 5
1.4 DR位点验证 5
1.5 可变剪切验证 6
2 结果与分析 7
2.1 DR验证结果 7
2.2 AS验证结果 7
3 讨论 8
3.1 水稻基因组中DNARNA杂合体位点的验证 8
3.2 水稻基因组中杂合体位点基因的选择性剪切验证 9
致谢 9
参考文献 9
附录A 水稻基因组DNARNA杂合体验证结果及合成的特异引物 11
附录B 水稻基因组中DNARNA杂合体位点基因的选择性剪切验证合成引物及测序结果 14
水稻基因组中DR位点的RTPCR验证
引言
引言 模式真核生物基因组的最新研究结果表明，除基因组较小的酿酒酵母外，与编码蛋白质基因相比，非编码RNAs（noncoding RNAs, ncRNAs）基因在人和动植物基因组中占了绝大部分比例。例如，人和拟南芥基因组中非编码RNAs基因分别大约占了98%和71%。越来越多的研究结果证实，在转录和转录后水平，作为功能性RNAs分子的非编码RNAs可通过调节相关基因表达来介导动植物胚胎发育、细胞分化、组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
织器官发生、信号转导和衰老等正常生长发育过程。另外，非编码RNAs在逆境应答、重大疾病的发生和发展等过程也同样有着十分重要的调节功能。
目前，植物的研究结果表明，植物ncRNAs在植物正常生长发育及逆境胁迫应答等过程同样发挥了重要调节作用，如植物开花、生物和非生物胁迫应答反应等。并且部分小RNAs的产生及调节机制研究相对比较清楚，但相比之下，植物lncRNAs的研究仍处于起步阶段，其作用机制还有待于进一步深入研究。真核生物基因组的转录过程中，一些位点新生RNA链与其DNA模版链结合形成DNARNA两链体结构，这种结构也称为Rloops（如图1）。最近越来越多的研究结果表明，在人和酵母基因组中，lncRNAs可通过形成Rloop结构（DNARNA杂合体）来发挥重要的生物学功能。目前已运用DRIPseq或DRIPchip方法在全基因组水平鉴定了人和酵母DNARNA杂合体位点。Rloops的形成是基因组转录过程的自然产物，它在基因表达、染色质结构调整以及基因组动态变化过程中扮演了重要的角色[1]。但在植物基因组中，lncRNAs是否能通过与相关DNA形成DNARNA杂合体来介导其功能的报道还不多见。
图1.DNARNA杂合体示意图
特别是，与酵母和人相比，植物DNARNA杂合体（DR）的鉴定及功能研究远远滞后。因此，在植物中开展DNARNA杂合体的鉴定以及分析DNARNA杂合体调控基因表达、选择性剪切等生物学过程的表观遗传学机理分析，一方面有利于鉴定新的ncRNAs，特别是lncRNAs，从而大大丰富植物ncRNAs的数量和类型。另一方面有利于明确植物基因组中DNARNA杂合体（Rloops）调控基因表达和选择性剪切等生物事件的表观遗传学机理，从而为植物ncRNA的研究提供新的思路。目前我们已初步建立了水稻幼苗组织的DNARNA杂合体富集方法（DRIPseq）。该方法的建立将有利于物种特异（如单子叶与双子叶植物和C3和C4植物等）、组织特异（如根、叶及花等组织）及生物与非生物胁迫相关的ncRNA的大规模鉴定与功能分析，从而丰富和推动植物RNA组学研究进程。
同一mRNA前体（premRNA）在产生成熟mRNA的过程中剪除内含子的方式可能不同，这种机制最早在1978年由Walter Gilbert首先描述，并称之为可变剪接（Alternative splicing, AS）。可变剪接被认为是导致蛋白功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物[2]。研究Rloops的存在和可变剪切发生的相关性有助于进一步了解Rloops的表观调节机制。通过DRIPseq我们初步鉴定了水稻基因组的DNARNA杂合体位点（如图2），初步统计了其数量以及在全基因组的分布情况。相关性分析的初步结果表明，含有Rloops的基因发生选择性剪切的机率要明显高于不含有Rloops的基因，从而暗示Rloops可能参与了基因选择性剪切事件。
图2.生物信息学方法对LOC_Os04g01230基因的分析结果
但是目前我们还不清楚通过DRIPseq方法鉴定的DNARNA杂合体位点的准确程度如何，因此本研究主要通过连特异RTPCR对DRIPseq方法鉴定的水稻基因组DR位点的可靠性进行验证。同时验证了DR的存在影响基因选择性剪切的真实性。该研究可初步证明DRIPSeq所鉴定的DR位点的可靠性，从而证实了DRIPseq技术在水稻体系中已初步建立。为进一步在水稻全基因组水平分析DR位点的表观遗传学结构特征以及对基因表达的调节作用奠定了初步基础，并为下一步在植物体系中广泛运用该方法奠定了必要的前期基础
材料与方法
水稻材料
水稻粳亚种日本晴，国际水稻基因组计划中作为典型粳稻基因组供体，已经完成基因组测序，序列信息以及后基因组研究信息已比较全面，相关数据可在NCBI等国际公用数据库查询。试验材料为水培（国际水稻所水稻专用营养液配方）2周的日本晴水稻幼苗，种子来自扬州大学农学院于恒秀课题组，种植于大学理科楼的植物培养室。
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