胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种carr基因决定碳青霉烯的合成不影响致病力
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum，以下简称Pcc）是引起细菌性软腐病的重要病原菌。其寄主广泛，可侵染多种作物及观赏性植物，是一种世界性具有重要经济意义的作物病原菌。该病原菌主要通过分泌多种胞外水解酶类以抵御寄主的防御反应和瓦解寄主组织；此外，Pcc还能分泌碳青霉烯类抗生素，以增强与环境中其它微生物的竞争力。CarR是一种重要的调控蛋白，其与信号分子OHHL结合后，激活car基因簇的转录。carR基因位于car基因簇的上游，能够调控Pcc的多种通路。以编码CarR的carR为研究对象，本研究利用基因敲除，获得Pcc中carR基因缺失突变株，同时构建了该突变菌株的互补菌株，通过与原始野生菌株的比较发现（1）carR突变对Pcc沉降性、胞外酶活力以及致病性没有明显影响；（2）carR基因影响碳青霉烯的合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1 供试菌株和质粒2
1.2主要试剂和仪器 2
1.3培养基2
1.4抗生素3
1.5引物3
2试验方法3
2.1细菌基因组DNA提取3
2.2质粒的提取4
2.3 DNA酶切、纯化、反应产物回收和连接4
2．3.1片段DNA和质粒的酶切4
2.3.2反应产物的回收5
2.3.3片段DNA和质粒的连接5
2.4质粒DNA的转化5
2.4.1热转感受态的制备5
2.4.2化学转化6
2.5两亲6
2.6突变体的构建和验证6
2.6.1上下游片段的PCR扩增6
2.6.2重组自杀载体的构建7
2.6.3两亲交配得到缺失突变体7
2.7互补菌株和过表达菌株的构建及验证方法7
2.8致病性的测定7
2.9沉降性的测定7
2.10致病因子的测定7
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
10.1细胞壁降解酶活性检测7
2.10.1.1蛋白酶活性检测8
2.10.1.2胞外纤维素酶活性检测8
2.10.1.3果胶酶活性检测8
2.10.2碳青霉烯抗生素活性检测8
3结果与分析8
3.1重组载体的验证8
3.2突变株的验证8
3.3互补菌株和过表达菌株的验证9
3.4carR对PccS1致病性的影响9
3.5生物学特性沉降性测定结果9
3.6相关致病因子的测定结果10
3.6.1carR基因对蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的影响10
3.6.2carR突变株丧失了产生碳青霉烯抗生素的能力11
4讨论与结果12
致谢13
参考文献13
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种carR基因决定碳青霉烯的合成，不影响致病力
引言
引言
细菌性软腐病的主要病原物为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium
carotovorum subsp. carotovorum，以下简称 Pcc）。可侵染多种农作物及观赏植物，并造成严重的经济损失，已成为一种备受关注的世界性病害[12]。该病原菌的主要致病因子为多种细胞壁降解酶（纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等），其作用是抵御寄主的防御反应并对寄主组织进行瓦解，此外还分泌碳青霉烯类抗生素来增强Pcc和其他病原菌间的竞争优势，以利于Pcc成功致病[35]。carR基因位于car基因簇的上游，在群体感应中与信号分子OHHL结合后激活car基因簇的转录。CarR是一种重要的调控蛋白，能够调控Pcc致病过程中产生的包括碳青霉烯的多种化学物质。为了分析carR与Pcc致病性之间的关系[67]。本实验利用同源重组的方法构建了Pcc的缺失突变株△carR，并进行了与致病相关的表型测定，为进一步探讨carR在Pcc致病过程中的作用提供了帮助。
1 材料与方法
供试菌株和质粒
本研究所使用的菌株和质粒见表11。胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种菌株PccS1于LB 培养基中28℃培养，大肠杆菌(Escherichia coli)于LB/2YT培养基中37℃培养。
表11 本实验所用菌株和质粒
菌株或质粒
相关特性
来源
Escherichia coli
DH5α
Φ80 lacZ△M15, (lacZYAargF)U169.recA1,endA1.thi1
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
PccS1
Wild type RifR
Lab collection
△carR
RifR,KanR,The carR gene knockout mutant of strain PccS1
This study
△carR(carR)
RifR,GmR, KanR,△carR complemented with pBBRP
This study
PccS1(carR)
RifR,GmR, carR overexpressed with pBBRP
This study
Plasmid
pEX18Gm
GmR, Allelic exchange suicide vector, sacB oriT(RP4) LacZ
Lab collection
pEXcarR
GmR , carR gene ligated in pEX18Gm
This study
pET30a
KanR,expression vector
Lab collection
pBBR1MCS5
GmR, Broadhostrange cosmid vector
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1 供试菌株和质粒2
1.2主要试剂和仪器 2
1.3培养基2
1.4抗生素3
1.5引物3
2试验方法3
2.1细菌基因组DNA提取3
2.2质粒的提取4
2.3 DNA酶切、纯化、反应产物回收和连接4
2．3.1片段DNA和质粒的酶切4
2.3.2反应产物的回收5
2.3.3片段DNA和质粒的连接5
2.4质粒DNA的转化5
2.4.1热转感受态的制备5
2.4.2化学转化6
2.5两亲6
2.6突变体的构建和验证6
2.6.1上下游片段的PCR扩增6
2.6.2重组自杀载体的构建7
2.6.3两亲交配得到缺失突变体7
2.7互补菌株和过表达菌株的构建及验证方法7
2.8致病性的测定7
2.9沉降性的测定7
2.10致病因子的测定7
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
10.1细胞壁降解酶活性检测7
2.10.1.1蛋白酶活性检测8
2.10.1.2胞外纤维素酶活性检测8
2.10.1.3果胶酶活性检测8
2.10.2碳青霉烯抗生素活性检测8
3结果与分析8
3.1重组载体的验证8
3.2突变株的验证8
3.3互补菌株和过表达菌株的验证9
3.4carR对PccS1致病性的影响9
3.5生物学特性沉降性测定结果9
3.6相关致病因子的测定结果10
3.6.1carR基因对蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的影响10
3.6.2carR突变株丧失了产生碳青霉烯抗生素的能力11
4讨论与结果12
致谢13
参考文献13
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种carR基因决定碳青霉烯的合成，不影响致病力
引言
引言
细菌性软腐病的主要病原物为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium
carotovorum subsp. carotovorum，以下简称 Pcc）。可侵染多种农作物及观赏植物，并造成严重的经济损失，已成为一种备受关注的世界性病害[12]。该病原菌的主要致病因子为多种细胞壁降解酶（纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等），其作用是抵御寄主的防御反应并对寄主组织进行瓦解，此外还分泌碳青霉烯类抗生素来增强Pcc和其他病原菌间的竞争优势，以利于Pcc成功致病[35]。carR基因位于car基因簇的上游，在群体感应中与信号分子OHHL结合后激活car基因簇的转录。CarR是一种重要的调控蛋白，能够调控Pcc致病过程中产生的包括碳青霉烯的多种化学物质。为了分析carR与Pcc致病性之间的关系[67]。本实验利用同源重组的方法构建了Pcc的缺失突变株△carR，并进行了与致病相关的表型测定，为进一步探讨carR在Pcc致病过程中的作用提供了帮助。
1 材料与方法
供试菌株和质粒
本研究所使用的菌株和质粒见表11。胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种菌株PccS1于LB 培养基中28℃培养，大肠杆菌(Escherichia coli)于LB/2YT培养基中37℃培养。
表11 本实验所用菌株和质粒
菌株或质粒
相关特性
来源
Escherichia coli
DH5α
Φ80 lacZ△M15, (lacZYAargF)U169.recA1,endA1.thi1
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR, recA
Lab collection
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
PccS1
Wild type RifR
Lab collection
△carR
RifR,KanR,The carR gene knockout mutant of strain PccS1
This study
△carR(carR)
RifR,GmR, KanR,△carR complemented with pBBRP
This study
PccS1(carR)
RifR,GmR, carR overexpressed with pBBRP
This study
Plasmid
pEX18Gm
GmR, Allelic exchange suicide vector, sacB oriT(RP4) LacZ
Lab collection
pEXcarR
GmR , carR gene ligated in pEX18Gm
This study
pET30a
KanR,expression vector
Lab collection
pBBR1MCS5
GmR, Broadhostrange cosmid vector
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