产酶溶杆菌oh11莽草酸合成途径关键基因aroa的克隆与功能分析
产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）属于黄单胞科（Xanthomonadaceae）、溶杆菌属（Lysobacter），是一种重要的生防细菌。莽草酸途径广泛存在于植物、细菌和真菌中。该途径由七种酶(AroABCDEFG)催化，其终产物为分支酸。分支酸是合成一系列芳香族化合物重要前体。在野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）中黄色素和辅酶Q8的生物合成受DF信号分子调控，而DF的生物合成受莽草酸途径调控。本文通过同源比对，采用PCR的方法从产酶溶杆菌OH11中克隆了aroA基因。采用同源重组手段，构建了aroA的定向缺失突变株。在此基础上，结合表型分析，明确莽草酸途径在产酶溶杆菌中确实参与调控了黄色素、DF信号分子和抗菌小分子化合物（HSAF、WAP-8294A2）的生物合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法 2
1．1 菌种和质粒的来源2
1．2 培养基和抗生素3
1．2．1 培养基 3
1．2．2 抗生素及其使用浓度 3
1．3 培养条件4
1．3．1 产酶溶杆菌OH11的培养与保存 4
1．3．2 大肠杆菌TOP10的培养与保存4
1．4 主要试剂4
1．5 实验器材4
1．6 实验原理4
1．6．1 敲除载体构建策略4
1．6．2 同源重组原理5
1．7 实验方法6
1．7．1 aroA基因敲除载体的构建6
1．7．2 一次交换子的获得及验证9
1．7．3 二次交换及缺陷株筛选9
1．7．4 缺失突变体功能互补菌株的构建9
1．7．5 aroA功能分析9
2 结果与分析11
2．1 敲除载体构建及验证11
2．1．1 扩增获得上游片段aroAF和下游片段aroAR12
2．1．2 构建获得重组质 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
粒12
2．1．3 一次交换子的获得以及验证13
2．2 二次交换结果分析13
2．3 互补菌株的构建及验证13
2．4 aroA功能验证14
2．4．1 DF的测定结果14
2．4．2 HSAF的测定结果15
2. 4. 3 WAP8294A2的测定结果15
2. 4. 4 真菌与卵菌拮抗结果16
2．4．5 黄色素的测定结果16
3 讨论17
致谢17
参考文献18
产酶溶杆菌OH11莽草酸合成途径关键基因aroA的
克隆与功能分析
引言
产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes) 属于黄单胞科（Xanthomonadaceae)、溶杆菌属（Lysobacter)，是一种重要的生防细菌（Christensen & Cook, 1978)。该菌GC含量较高，有滑行现象；能产生多种胞外酶，包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β1,3葡聚糖酶，能降解不同植物病原菌的细胞壁组分（Kobayashi et al., 2005）。该菌对许多植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌以及线虫均具有显著的拮抗作用（Palumbo et al., 2003; Li et al., 2006; Qian et al., 2009）。该菌易于培养、发酵和保存，防效稳定，对环境友好，是一种具有明确应用前景的生防细（Zhang et al., 2000; Folman et al., 2003）。
除产生丰富的胞外水解酶外，产酶溶杆菌还能合成多种小分子抗菌物质（Xie et al., 2012）。HSAF（Heat Stable Antifungal Factor）是产酶溶杆菌中新报道的一种结构全新的广谱型抗真菌物质（Yu et al., 2007）。同时，该物质对丝状真菌的作用方式也是独特的，即通过抑制真菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长（Li et al., 2006）。由于哺乳动物和植物中鞘脂类化合物的组成与丝状真菌差异较大，因此HSAF对人类和植物无害，是一种环境友好的新型抗菌物质。WAP8294A2是产酶溶杆菌合成的一种抗革兰氏阳性细菌的环十二肽类抗生素。该抗生素对人体病原细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有高效抗菌活性，已在日本进而临床二期，有望近期投入市场，是一种重要的新型医用抗生素。前期工作中，本实验室已经明确了HSAF和WAP8294A2在产酶溶杆菌OH11中的生物合成机制，但其生物合成的调控机制知之甚少。
莽草酸途径广泛存在于植物、细菌、真菌中。该途径由七种酶(AroABCDEFG)催化，将底物4磷酸盐赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸合成终产物分支酸。分支酸是合成一系列芳香族化合物重要前体，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、叶酸辅助因子、吩嗪、铁载体和水杨酸等（Floss, 1997; Herrmann and Weaver, 1999; Dosselaere and Vanderleyden, 2001; Van Lanen et al., 2008)。
DF（Diffusible Factor）是植物病原菌野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）中新鉴定的一种细菌间交流的信号分子。DF被鉴定为3羟基苯甲酸（3HBA）和4羟基苯甲酸（4HBA）的混合物，其中3HBA负责黄色素的合成，而4HBA负责辅酶Q8的生物合成。在该菌中，DF的生物合成受莽草酸途径调控，分支酸是DF合成的前提物质。本实验室前期结果显示，产酶溶杆菌也合成DF信号，该信号正向调控HSAF的生物合成，但对WAP8294A2的调控作用未知。
以产酶溶杆菌OH11为研究对象，从已有的全基因组中鉴定了莽草酸合成的基因簇。本研究拟通过对基因簇中莽草酸合成途径中的关键基因aroA进行突变，结合表型分析，明确莽草酸途径是否调控DF、HSAF和WAP8294A2的生物合成。在此基础上，进一步阐明该途径是否通过DF信号来调控HSAF和WAP8294A2的生物合成。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法 2
1．1 菌种和质粒的来源2
1．2 培养基和抗生素3
1．2．1 培养基 3
1．2．2 抗生素及其使用浓度 3
1．3 培养条件4
1．3．1 产酶溶杆菌OH11的培养与保存 4
1．3．2 大肠杆菌TOP10的培养与保存4
1．4 主要试剂4
1．5 实验器材4
1．6 实验原理4
1．6．1 敲除载体构建策略4
1．6．2 同源重组原理5
1．7 实验方法6
1．7．1 aroA基因敲除载体的构建6
1．7．2 一次交换子的获得及验证9
1．7．3 二次交换及缺陷株筛选9
1．7．4 缺失突变体功能互补菌株的构建9
1．7．5 aroA功能分析9
2 结果与分析11
2．1 敲除载体构建及验证11
2．1．1 扩增获得上游片段aroAF和下游片段aroAR12
2．1．2 构建获得重组质 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
粒12
2．1．3 一次交换子的获得以及验证13
2．2 二次交换结果分析13
2．3 互补菌株的构建及验证13
2．4 aroA功能验证14
2．4．1 DF的测定结果14
2．4．2 HSAF的测定结果15
2. 4. 3 WAP8294A2的测定结果15
2. 4. 4 真菌与卵菌拮抗结果16
2．4．5 黄色素的测定结果16
3 讨论17
致谢17
参考文献18
产酶溶杆菌OH11莽草酸合成途径关键基因aroA的
克隆与功能分析
引言
产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes) 属于黄单胞科（Xanthomonadaceae)、溶杆菌属（Lysobacter)，是一种重要的生防细菌（Christensen & Cook, 1978)。该菌GC含量较高，有滑行现象；能产生多种胞外酶，包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β1,3葡聚糖酶，能降解不同植物病原菌的细胞壁组分（Kobayashi et al., 2005）。该菌对许多植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌以及线虫均具有显著的拮抗作用（Palumbo et al., 2003; Li et al., 2006; Qian et al., 2009）。该菌易于培养、发酵和保存，防效稳定，对环境友好，是一种具有明确应用前景的生防细（Zhang et al., 2000; Folman et al., 2003）。
除产生丰富的胞外水解酶外，产酶溶杆菌还能合成多种小分子抗菌物质（Xie et al., 2012）。HSAF（Heat Stable Antifungal Factor）是产酶溶杆菌中新报道的一种结构全新的广谱型抗真菌物质（Yu et al., 2007）。同时，该物质对丝状真菌的作用方式也是独特的，即通过抑制真菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长（Li et al., 2006）。由于哺乳动物和植物中鞘脂类化合物的组成与丝状真菌差异较大，因此HSAF对人类和植物无害，是一种环境友好的新型抗菌物质。WAP8294A2是产酶溶杆菌合成的一种抗革兰氏阳性细菌的环十二肽类抗生素。该抗生素对人体病原细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有高效抗菌活性，已在日本进而临床二期，有望近期投入市场，是一种重要的新型医用抗生素。前期工作中，本实验室已经明确了HSAF和WAP8294A2在产酶溶杆菌OH11中的生物合成机制，但其生物合成的调控机制知之甚少。
莽草酸途径广泛存在于植物、细菌、真菌中。该途径由七种酶(AroABCDEFG)催化，将底物4磷酸盐赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸合成终产物分支酸。分支酸是合成一系列芳香族化合物重要前体，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、叶酸辅助因子、吩嗪、铁载体和水杨酸等（Floss, 1997; Herrmann and Weaver, 1999; Dosselaere and Vanderleyden, 2001; Van Lanen et al., 2008)。
DF（Diffusible Factor）是植物病原菌野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）中新鉴定的一种细菌间交流的信号分子。DF被鉴定为3羟基苯甲酸（3HBA）和4羟基苯甲酸（4HBA）的混合物，其中3HBA负责黄色素的合成，而4HBA负责辅酶Q8的生物合成。在该菌中，DF的生物合成受莽草酸途径调控，分支酸是DF合成的前提物质。本实验室前期结果显示，产酶溶杆菌也合成DF信号，该信号正向调控HSAF的生物合成，但对WAP8294A2的调控作用未知。
以产酶溶杆菌OH11为研究对象，从已有的全基因组中鉴定了莽草酸合成的基因簇。本研究拟通过对基因簇中莽草酸合成途径中的关键基因aroA进行突变，结合表型分析，明确莽草酸途径是否调控DF、HSAF和WAP8294A2的生物合成。在此基础上，进一步阐明该途径是否通过DF信号来调控HSAF和WAP8294A2的生物合成。
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