wingless基因在灰飞虱翅发育中的作用
摘要：灰飞虱的翅发育受遗传因子的影响，但至今还不太清楚导致灰飞虱翅型分化的相关基因及其作用。本试验通过注射不同浓度的wingless基因双链RNA（dswg），以研究wingless基因在灰飞虱翅发育中对的作用。结果表明，灰飞虱在注射不同浓度dswg之后，其体重和翅长并没有随着浓度梯度的变化而发生明显有规律的变化。长、短翅型灰飞虱的雌、雄成虫的体重在注射dswg之后都没有发生显著变化，仅短翅型灰飞虱的5龄若虫体重减轻。在注射一定浓度的dswg之后，短翅型灰飞虱的雄成虫前翅的平均长度以及长翅型灰飞虱成虫个体的前、后翅长度都发生了显著缩短，由此可说明wingless基因参与了灰飞虱翅长的调控。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 灰飞虱来源及翅型筛选2
1.1.1 供试飞虱的饲养2
1.2 灰飞虱wingless基因的干扰方法2
1.2.1供试虫源2
1.2.2灰飞虱dsRNA的注射2
1.3数据分析方法2
2 结果与分析3
2.1注射不同浓度dswg和dsGFP对长翅型灰飞虱发育的影响3
2.1.1 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱5龄若虫和成虫体重的影响3
2.1.2 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱雄成虫前、后翅长度的影响4
2.1.3 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱雌成虫前、后翅长度的影响5
2.2注射不同浓度dswg和dsGFP对短翅型灰飞虱发育的影响7
2.2.1 注射不同浓度dswg对短翅型灰飞虱5龄若虫和成虫体重的影响7
2.2.2 注射不同浓度dswg对短翅型灰飞虱雄成虫前、后翅长度的影响8
2.2.3 注射不同浓度dswg对短翅型灰飞虱雌成虫前、后翅长度的影响9
3 讨论10
致谢10
参考文献11
wingless基因在灰飞虱翅发育中的作用
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
灰飞虱Laodelphax striatellus是亚洲水稻田上的重要害虫。它通过刺伤稻株、稻叶、叶鞘吸取汁液，从而影响水稻正常生长发育，致使水稻叶片发黄、干尖、功能叶早衰，严重时稻株干枯死亡、茎秆腐烂、空秕率增多、千粒重下降、造成水稻减产或绝收。此外，在吸食稻株汁液时从唾液腺汾泌有毒物质引起稻株中毒从而影响水稻养分、水分的传导，造成水稻生长不良，降低水稻的抗病性、抗倒性和结实率，最终导致水稻轻者减产100～200kg/亩左右，严重者叶片干枯死亡而倒伏基本绝收（徐显忠，2012）。
灰飞虱存在翅型分化现象，并受遗传基因的影响，但目前对于稻飞虱翅型分化的研究主要集中在外界因素对其的影响。相比之下，有关稻飞虱翅型相关基因的研究比较薄弱（娄永根和程家安，2011），获得一定成果的是对褐飞虱的卵黄原蛋白基因（vitellogenin，vg）和flightin基因的研究（Xue et al., 2013；Tufail et al., 2010），而与灰飞虱翅型分化有关的基因及其作用至今还不太清楚。
wingless信号通路是昆虫组织的生长过程中一条重要通路，对于成虫盘组织的形成、发育、分化都有影响。近期，在白背飞虱的wingless基因对翅型调控作用上已取得了一定的结果(于居龙，2014)。白背飞虱wingless基因在若虫3龄、4龄、5龄阶段的相对表达量表现为长翅品系显著高于短翅品系，且在长翅成虫的翅中表达量最高，而头、胸和腹部体节中表达量较低。此外，通过给低龄若虫注射不同浓度的dswg，引起了白背飞虱长翅纯系中出现了短翅雌虫，从而确定wingless对白背飞虱的翅型分化有一定调控作用（Yu et al.，2014）。不仅如此，Yu et al.(2014) 还克隆了灰飞虱中的wingless基因，获得了其全长。但是，灰飞虱的翅型分化现象与白背飞虱存在一定差异，灰飞虱有短翅型雄虫的存在，而白背飞虱很少有短翅雄虫，所以wingless基因在灰飞虱翅型分化中有何作用值得研究。
本文以灰飞虱长短型品系和短翅型品系为材料，研究wingless基因在灰飞虱翅发育中的作用，以期为今后对灰飞虱翅型分化的研究提供参考。
1 材料与方法
1．1 灰飞虱来源及翅形筛选
1．1．1 供试飞虱的饲养
试验所使用的灰飞虱原始虫源采集自江苏南京稻田并在养虫室（温度25℃，湿度80﹪，L:D=14:10）内单株单管饲养。饲养稻苗选用武运粳7号，每710天更换一次，若虫羽化时需添加新的稻苗。在室内采用照彭娟等（2012）方法进行灰飞虱的翅形筛选，并获得了长翅型品系（M♀×M♂）和短翅型品系（B♀×M♂），而用于实验。
1．2 灰飞虱wingless基因的干扰方法
1．2．1 供试虫源
所有试虫都是灰飞虱经过筛选得到的稳定翅型后代。其中，显微注射干扰的试虫为二龄末若虫；进行体重测定的试虫为五龄若虫及成虫；进行翅长测定的试虫为成虫。
1．2．2 灰飞虱dsRNA的注射
（1） 将合成的dswg和dsEGFP分别稀释为100ng/μl、400ng/μl、800ng/μl、1500ng/μl、2000ng/μl 、3000ng/μl等浓度；
（2） 利用培养皿自制1%琼脂糖板；利用Sutter P97拉针仪拉针，拉针参数为：Heat?560，Pull?0，Vel?30,?Time?250，若针被堵则用Microgrinder EG400磨针仪磨针；
（3）将吸取的2龄末的若虫分别单头放于EP管中，在冰上放置50s，待若虫处于昏迷状态时放于平台上（1%琼脂糖板上）利用显微注射仪Eppendorf?Inject?NI?12在飞虱前足与中足凹陷处进行注射，显微注射参数：Pi=1250，Ti=0.2，Pc=150hp；
（4） 将注射后的飞虱小心放置于盛有水稻苗的指形管中单头单管饲养，同时将未注射的2龄末正常飞虱也用相同的方法进行饲养；
（5） 每天观察存活情况，当若虫至5龄时收集不同浓度注射的灰飞虱1215头，利用梅特勒电子天平XP6（十万分之一）进行称重；
（6） 当若虫羽化后利用梅特勒电子天平XP6称重，利用体视显微镜CellSens?V1.5?system（Olympus）进行翅长的测定。
1．3 数据分析方法
本试验采用Tukey氏HSD法分析注射不同浓度的dsRNA的若虫及成虫在体重和翅长上的差异显著性；用t试验的方法对比注射相同浓度dswg与dsGFP间的试虫。各统计分析均在SAS 8.0中进行。
2 结果与分析
2．1注射不同浓度dswg和dsGFP对长翅型灰飞虱发育的影响
2．1．1 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱5龄若虫和成虫体重的影响
在注射了不同浓度的dswg和dsGFP之后，长翅型灰飞虱的5龄若虫在不同浓度间不存在显著差异（dswg: df=4.65, F=0.61, p=0.6586; dsGFP: df=5.81, F=1.78, p=0.1265）。但当注射浓度为2000ng/μl时，注射dswg若虫的体重与注射dsGFP的若虫相比明显增加（df=28, t=2.17, P=0.0384）。而在其它注射浓度中则不存在显著差异（100 ng/μl: t=0.11, p=0.9102; 400 ng/μl: t=0.65, p=0.5234; 800 ng/μl: t=0.65, p=0.5234; 1500 ng/μl: t=0.76, p=0.4600，图1）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 灰飞虱来源及翅型筛选2
1.1.1 供试飞虱的饲养2
1.2 灰飞虱wingless基因的干扰方法2
1.2.1供试虫源2
1.2.2灰飞虱dsRNA的注射2
1.3数据分析方法2
2 结果与分析3
2.1注射不同浓度dswg和dsGFP对长翅型灰飞虱发育的影响3
2.1.1 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱5龄若虫和成虫体重的影响3
2.1.2 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱雄成虫前、后翅长度的影响4
2.1.3 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱雌成虫前、后翅长度的影响5
2.2注射不同浓度dswg和dsGFP对短翅型灰飞虱发育的影响7
2.2.1 注射不同浓度dswg对短翅型灰飞虱5龄若虫和成虫体重的影响7
2.2.2 注射不同浓度dswg对短翅型灰飞虱雄成虫前、后翅长度的影响8
2.2.3 注射不同浓度dswg对短翅型灰飞虱雌成虫前、后翅长度的影响9
3 讨论10
致谢10
参考文献11
wingless基因在灰飞虱翅发育中的作用
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
灰飞虱Laodelphax striatellus是亚洲水稻田上的重要害虫。它通过刺伤稻株、稻叶、叶鞘吸取汁液，从而影响水稻正常生长发育，致使水稻叶片发黄、干尖、功能叶早衰，严重时稻株干枯死亡、茎秆腐烂、空秕率增多、千粒重下降、造成水稻减产或绝收。此外，在吸食稻株汁液时从唾液腺汾泌有毒物质引起稻株中毒从而影响水稻养分、水分的传导，造成水稻生长不良，降低水稻的抗病性、抗倒性和结实率，最终导致水稻轻者减产100～200kg/亩左右，严重者叶片干枯死亡而倒伏基本绝收（徐显忠，2012）。
灰飞虱存在翅型分化现象，并受遗传基因的影响，但目前对于稻飞虱翅型分化的研究主要集中在外界因素对其的影响。相比之下，有关稻飞虱翅型相关基因的研究比较薄弱（娄永根和程家安，2011），获得一定成果的是对褐飞虱的卵黄原蛋白基因（vitellogenin，vg）和flightin基因的研究（Xue et al., 2013；Tufail et al., 2010），而与灰飞虱翅型分化有关的基因及其作用至今还不太清楚。
wingless信号通路是昆虫组织的生长过程中一条重要通路，对于成虫盘组织的形成、发育、分化都有影响。近期，在白背飞虱的wingless基因对翅型调控作用上已取得了一定的结果(于居龙，2014)。白背飞虱wingless基因在若虫3龄、4龄、5龄阶段的相对表达量表现为长翅品系显著高于短翅品系，且在长翅成虫的翅中表达量最高，而头、胸和腹部体节中表达量较低。此外，通过给低龄若虫注射不同浓度的dswg，引起了白背飞虱长翅纯系中出现了短翅雌虫，从而确定wingless对白背飞虱的翅型分化有一定调控作用（Yu et al.，2014）。不仅如此，Yu et al.(2014) 还克隆了灰飞虱中的wingless基因，获得了其全长。但是，灰飞虱的翅型分化现象与白背飞虱存在一定差异，灰飞虱有短翅型雄虫的存在，而白背飞虱很少有短翅雄虫，所以wingless基因在灰飞虱翅型分化中有何作用值得研究。
本文以灰飞虱长短型品系和短翅型品系为材料，研究wingless基因在灰飞虱翅发育中的作用，以期为今后对灰飞虱翅型分化的研究提供参考。
1 材料与方法
1．1 灰飞虱来源及翅形筛选
1．1．1 供试飞虱的饲养
试验所使用的灰飞虱原始虫源采集自江苏南京稻田并在养虫室（温度25℃，湿度80﹪，L:D=14:10）内单株单管饲养。饲养稻苗选用武运粳7号，每710天更换一次，若虫羽化时需添加新的稻苗。在室内采用照彭娟等（2012）方法进行灰飞虱的翅形筛选，并获得了长翅型品系（M♀×M♂）和短翅型品系（B♀×M♂），而用于实验。
1．2 灰飞虱wingless基因的干扰方法
1．2．1 供试虫源
所有试虫都是灰飞虱经过筛选得到的稳定翅型后代。其中，显微注射干扰的试虫为二龄末若虫；进行体重测定的试虫为五龄若虫及成虫；进行翅长测定的试虫为成虫。
1．2．2 灰飞虱dsRNA的注射
（1） 将合成的dswg和dsEGFP分别稀释为100ng/μl、400ng/μl、800ng/μl、1500ng/μl、2000ng/μl 、3000ng/μl等浓度；
（2） 利用培养皿自制1%琼脂糖板；利用Sutter P97拉针仪拉针，拉针参数为：Heat?560，Pull?0，Vel?30,?Time?250，若针被堵则用Microgrinder EG400磨针仪磨针；
（3）将吸取的2龄末的若虫分别单头放于EP管中，在冰上放置50s，待若虫处于昏迷状态时放于平台上（1%琼脂糖板上）利用显微注射仪Eppendorf?Inject?NI?12在飞虱前足与中足凹陷处进行注射，显微注射参数：Pi=1250，Ti=0.2，Pc=150hp；
（4） 将注射后的飞虱小心放置于盛有水稻苗的指形管中单头单管饲养，同时将未注射的2龄末正常飞虱也用相同的方法进行饲养；
（5） 每天观察存活情况，当若虫至5龄时收集不同浓度注射的灰飞虱1215头，利用梅特勒电子天平XP6（十万分之一）进行称重；
（6） 当若虫羽化后利用梅特勒电子天平XP6称重，利用体视显微镜CellSens?V1.5?system（Olympus）进行翅长的测定。
1．3 数据分析方法
本试验采用Tukey氏HSD法分析注射不同浓度的dsRNA的若虫及成虫在体重和翅长上的差异显著性；用t试验的方法对比注射相同浓度dswg与dsGFP间的试虫。各统计分析均在SAS 8.0中进行。
2 结果与分析
2．1注射不同浓度dswg和dsGFP对长翅型灰飞虱发育的影响
2．1．1 注射不同浓度dswg对长翅型灰飞虱5龄若虫和成虫体重的影响
在注射了不同浓度的dswg和dsGFP之后，长翅型灰飞虱的5龄若虫在不同浓度间不存在显著差异（dswg: df=4.65, F=0.61, p=0.6586; dsGFP: df=5.81, F=1.78, p=0.1265）。但当注射浓度为2000ng/μl时，注射dswg若虫的体重与注射dsGFP的若虫相比明显增加（df=28, t=2.17, P=0.0384）。而在其它注射浓度中则不存在显著差异（100 ng/μl: t=0.11, p=0.9102; 400 ng/μl: t=0.65, p=0.5234; 800 ng/μl: t=0.65, p=0.5234; 1500 ng/μl: t=0.76, p=0.4600，图1）。
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