苯噻菌酯非竞争免疫分析方法研究
摘要：本实验利用筛选抗免疫复合体噬菌体展示多肽建立苯噻菌酯的非竞争免疫分析方法，通过扩增噬菌体展示八肽，从包被抗体浓度、噬菌体投入量、缓冲液配比等方面优化检测条件。运用噬菌体非竞争检测方法测定添加不同浓度农药的样品的残留量，计算该方法的添加回收率、变异系数，在最佳条件下，苯噻菌酯的结合中浓度（SC50）和最低检测限（LOD）为2.29 ng/mL和1.43 ng/mL。建立的ELISA与其他类似化合物基本无交叉反应。在梨、黄瓜、大米和西红柿样品中，苯噻菌酯的平均回收率为70.43 %-128.57 %，相对标准偏差为1.79%-11.53%。实际样品的研究结果表明，ELISA与高效液相色谱分析方法（HPLC）具有高度的相关性。与竞争ELISA相比，显示出具有更好的敏感性和特异性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料与仪器 2
1.1.1 实验材料与试剂 2
1.1.2 实验仪器2
1.2 实验方法 3
1.2.1 抗苯噻菌酯免疫复合体噬菌体展示多肽的扩增与滴度测定3
1.2.2 非竞争免疫分析方法的建立3
1.2.3 交叉反应率的测定4
1.2.4 基质效应与添加回收率的测定4
1.2.5 实际样品检测4
2 结果与分析4
2.1 非竞争免疫分析方法条件优化4
2.1.1 噬菌体投入量和抗体浓度优化5
2.1.2 缓冲溶液条件优化6
2.2 标准曲线8
2.3 特异性分析8
2.4 基质效应与添加回收9
2.4.1 基质效应的影响9
2.4.2 添加回收率与精密度10
2.5 相关性验证11
3 讨论 11
3.1 缓冲液中的有机溶剂11
3.2 非竞争ELISA的敏感性和特异性 12
3.3 非竞争ELISA的准确性12
致谢1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
2
参考文献12
苯噻菌酯非竞争免疫分析方法研究
引言
引言
苯噻菌酯是由华中师范大学研发的一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有广谱、高效、用量低、持效期长等优点[]。具有保护及治疗作用，对作物白粉病、霜霉病均表现出较好的防效，具有良好的市场开发前景。随着农药使用品种和使用范围的不断扩大，农药残留造成的环境污染和食品安全问题日益受到各国政府和消费者的广泛关注[]。目前已报道的对苯噻菌酯的检测方法仅包括高效液相色谱法(HPLC)[]和间接竞争免疫分析方法(icELISA)[]两种方法。其中，高效液相色谱法虽然具有精密度和准确度高、线性关系好等优点，但处理过程繁琐,分析速度慢、成本高，对检测人员要求高，难以适应大量复杂样品和现场快速检测的要求[]；间接竞争免疫分析方法具有快速、灵敏、简便等优点，但该方法与吡唑醚菌酯存在交叉反应[4]。
免疫分析技术凭借自身的独有优势和特点，在农药等小分子免疫分析中的前景是不可限量的。利用不同的标记物，已开发了ELISA、FPIA、TRFIA等免疫分析方法[]。根据检测对象的不同，ELISA方法可分为两种不同方式，针对大部分农药等小分子化学品（单价抗原），首选竞争性ELISA法[]；测定与土壤结合态农药形成的大分子，其有两个以上半抗原决定簇，主要用非竞争性ELISA法[]。农药等小分子化合物的免疫分析大多数都使用竞争模式。其原因是非竞争模式一般需要抗原含有两个或两个以上不重叠抗原决定簇，即其中一个抗原决定簇的抗体用于固定在固相载体上用于结合目标抗原，另一个含有信号标记的抗体用于检测被固相载体结合的抗原量。但是绝大多数农药等小分子化合物与抗体结合之后都会被抗体的结合位点被包裹起来，因此不能直接被第二种抗体所识别。有研究者们利用一些新颖的技术手段也建立了小分子化合物的非竞争免疫分析，并且表示非竞争性免疫分析具有更好的敏感性和特异性[]，可以通过非竞争分析模式提高苯噻菌酯残留检测方法的特异性和敏感性。
非竞争性免疫分析所采用的方法有抗体抗免疫复合体分析（antibody antiimmunocomplex assay）、开放夹心分析（open sandwich assay）和噬菌体抗免疫复合体分析（phage antiimmunocomplex assay，PHAIA）[]。噬菌体抗免疫复合体分析是利用噬菌体展现技术建立多肽噬菌体库，运用抗原抗体复合物在噬菌体库中筛选出能够特异性识别抗原抗体复合体的噬菌体，并建立相应的检测方法。
本论文以苯噻菌酯为研究对象，通过扩增已获得的苯噻菌酯免疫复合体的噬菌体展示八肽，利用噬菌体展示技术进行非竞争免疫分析方法的研究，此方法不仅可以改善竞争法与吡唑醚菌酯存在交叉反应这一缺陷，更可丰富小分子化合物的免疫分析模式，对促进非竞争免疫分析这一新颖的分析方法的发展具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验材料与试剂
ER2738大肠杆菌（New England Biolabs公司）；
苯噻菌酯非竞争噬菌体株N117、N24 、N618和抗苯噻菌酯单克隆抗体4E8均为实验室已有；
苯噻菌酯标准样品（质量分数99.02%，华中师范大学）；
交叉反应所用的标准品（德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司）；
牛血清蛋白（BSA，MW：67000）、PEG 8000、tetramethylbenzidine (TMB)（美国sigma公司）；
磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）；
洗涤液PBST（0.05%吐温20的PBS溶液）；
TMBH2O2底物溶液(TMB，0.4 mmol/L和H2O2，3 mmol/L，pH 5.0)
乙腈、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠等其他常规试剂均为分析纯。
1.1.2 实验仪器
96孔酶标板（美国Costar公司）
Wellwash Plus 型洗板机（Thermo公司）；
AllegraTM 64R Centrifuge高速冷冻离心机（美国Beckman公司） ；
DNP9052型新型电热恒温培养箱（宁波江南仪器厂）；
XW80A 漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；
iMark Microplate Reader酶标仪（美国BIORAD公司）；
R3 旋转蒸发仪（BUCHI公司）；
BS110s电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；
Mul9000超纯水系统 （南京总馨有限公司）
1.2 实验方法
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料与仪器 2
1.1.1 实验材料与试剂 2
1.1.2 实验仪器2
1.2 实验方法 3
1.2.1 抗苯噻菌酯免疫复合体噬菌体展示多肽的扩增与滴度测定3
1.2.2 非竞争免疫分析方法的建立3
1.2.3 交叉反应率的测定4
1.2.4 基质效应与添加回收率的测定4
1.2.5 实际样品检测4
2 结果与分析4
2.1 非竞争免疫分析方法条件优化4
2.1.1 噬菌体投入量和抗体浓度优化5
2.1.2 缓冲溶液条件优化6
2.2 标准曲线8
2.3 特异性分析8
2.4 基质效应与添加回收9
2.4.1 基质效应的影响9
2.4.2 添加回收率与精密度10
2.5 相关性验证11
3 讨论 11
3.1 缓冲液中的有机溶剂11
3.2 非竞争ELISA的敏感性和特异性 12
3.3 非竞争ELISA的准确性12
致谢1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
2
参考文献12
苯噻菌酯非竞争免疫分析方法研究
引言
引言
苯噻菌酯是由华中师范大学研发的一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有广谱、高效、用量低、持效期长等优点[]。具有保护及治疗作用，对作物白粉病、霜霉病均表现出较好的防效，具有良好的市场开发前景。随着农药使用品种和使用范围的不断扩大，农药残留造成的环境污染和食品安全问题日益受到各国政府和消费者的广泛关注[]。目前已报道的对苯噻菌酯的检测方法仅包括高效液相色谱法(HPLC)[]和间接竞争免疫分析方法(icELISA)[]两种方法。其中，高效液相色谱法虽然具有精密度和准确度高、线性关系好等优点，但处理过程繁琐,分析速度慢、成本高，对检测人员要求高，难以适应大量复杂样品和现场快速检测的要求[]；间接竞争免疫分析方法具有快速、灵敏、简便等优点，但该方法与吡唑醚菌酯存在交叉反应[4]。
免疫分析技术凭借自身的独有优势和特点，在农药等小分子免疫分析中的前景是不可限量的。利用不同的标记物，已开发了ELISA、FPIA、TRFIA等免疫分析方法[]。根据检测对象的不同，ELISA方法可分为两种不同方式，针对大部分农药等小分子化学品（单价抗原），首选竞争性ELISA法[]；测定与土壤结合态农药形成的大分子，其有两个以上半抗原决定簇，主要用非竞争性ELISA法[]。农药等小分子化合物的免疫分析大多数都使用竞争模式。其原因是非竞争模式一般需要抗原含有两个或两个以上不重叠抗原决定簇，即其中一个抗原决定簇的抗体用于固定在固相载体上用于结合目标抗原，另一个含有信号标记的抗体用于检测被固相载体结合的抗原量。但是绝大多数农药等小分子化合物与抗体结合之后都会被抗体的结合位点被包裹起来，因此不能直接被第二种抗体所识别。有研究者们利用一些新颖的技术手段也建立了小分子化合物的非竞争免疫分析，并且表示非竞争性免疫分析具有更好的敏感性和特异性[]，可以通过非竞争分析模式提高苯噻菌酯残留检测方法的特异性和敏感性。
非竞争性免疫分析所采用的方法有抗体抗免疫复合体分析（antibody antiimmunocomplex assay）、开放夹心分析（open sandwich assay）和噬菌体抗免疫复合体分析（phage antiimmunocomplex assay，PHAIA）[]。噬菌体抗免疫复合体分析是利用噬菌体展现技术建立多肽噬菌体库，运用抗原抗体复合物在噬菌体库中筛选出能够特异性识别抗原抗体复合体的噬菌体，并建立相应的检测方法。
本论文以苯噻菌酯为研究对象，通过扩增已获得的苯噻菌酯免疫复合体的噬菌体展示八肽，利用噬菌体展示技术进行非竞争免疫分析方法的研究，此方法不仅可以改善竞争法与吡唑醚菌酯存在交叉反应这一缺陷，更可丰富小分子化合物的免疫分析模式，对促进非竞争免疫分析这一新颖的分析方法的发展具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验材料与试剂
ER2738大肠杆菌（New England Biolabs公司）；
苯噻菌酯非竞争噬菌体株N117、N24 、N618和抗苯噻菌酯单克隆抗体4E8均为实验室已有；
苯噻菌酯标准样品（质量分数99.02%，华中师范大学）；
交叉反应所用的标准品（德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司）；
牛血清蛋白（BSA，MW：67000）、PEG 8000、tetramethylbenzidine (TMB)（美国sigma公司）；
磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）；
洗涤液PBST（0.05%吐温20的PBS溶液）；
TMBH2O2底物溶液(TMB，0.4 mmol/L和H2O2，3 mmol/L，pH 5.0)
乙腈、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠等其他常规试剂均为分析纯。
1.1.2 实验仪器
96孔酶标板（美国Costar公司）
Wellwash Plus 型洗板机（Thermo公司）；
AllegraTM 64R Centrifuge高速冷冻离心机（美国Beckman公司） ；
DNP9052型新型电热恒温培养箱（宁波江南仪器厂）；
XW80A 漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；
iMark Microplate Reader酶标仪（美国BIORAD公司）；
R3 旋转蒸发仪（BUCHI公司）；
BS110s电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；
Mul9000超纯水系统 （南京总馨有限公司）
1.2 实验方法
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