南方根结线虫分支酸变位酶基因离体rna干扰研究
本文以南方根结线虫分支酸变位酶基因为模板，体外转录合成dsRNA，结合优化的刺激条件进行了离体RNA干涉诱导南方根结线虫分支酸变位酶基因Mi-cm-1的沉默研究，RT-PCR检测显示，dsRNA的浸泡处理引起了南方根结线虫侵染性二龄幼虫体内Mi-cm-1转录水平的下降，接种实验证实处理后的线虫在感病番茄上的繁殖力下降，表明离体RNA干涉Mi-cm-1在南方根结线虫中的表达取得了成功，同时实验结果表明Mi-cm-1对南方根结线虫寄生寄主植物可能有重要作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1南方根结线虫二龄幼虫的采集2
1.2.2总RNA的提取2
1.2.3 cDNA的合成3
1.2.4体外转录模板的制备3
1.2.5体外转录4
1.2.6 dsRNA的浸泡 4
1.2.7RTPCR检测Micm1转录水平 5
1.2.8体外RNA干涉处理后线虫的接种实验 5
2结果与分析 5
2.1 Micm1离体RNAi 6
2.2离体RNA干涉后Micm1转录水平的检测6
2..3接种实验 7
3讨论7
致谢7
参考文献8
南方根结线虫分支酸变位酶基因离体RNA干扰研究
引言
引言
植物寄生线虫是世界农作物的重要病原物之一,每年造成全世界农作物受损高达1250亿美元[1]。根结线虫（Meloidogyne）是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，主要包括南方根结线虫（M.incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla)等4大优势种群[2]。目前已知为害蔬菜的线虫主要有、花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫等。根结线虫主要为害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
小不等的白色根瘤，有的呈念珠状。被害株地上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。在我国,以南方根结线虫分布最广,危害最大。近年来,随着农业种植结构的调整,保护地作物栽培面积迅速发展,同时也为南方根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境,使得土壤中的根结线虫得以积聚增殖,发病田的寄主常年减产15%～20%,严重时达到70%以上[3]。
尽管如此，对于这类病害目前仍然缺乏有效的防治策略，因此寻找控制根结线虫危害有效的防治手段和药物靶标已成为保障我国农业生产的重要任务之一。目前，一般采用农业措施、应用抗性品种和化学防治的方式来防治植物寄生线虫[46]。但是化学防治方法存在污染大、毒性强、残留长等多种严重问题，且防治成本高，不适用于提倡科学、环保、可循环、无公害平衡发展的当代要求；单独使用农业防治则不能完全清除，效果不理想。通过抗性植物抑制植物线虫繁殖，是最有效的防治植物线虫方法[78]。但毒力强的线虫会对抗性基因产生抗性，使得抗性基因发挥作用不够理想。近年来许多研究者潜心研究，并不断发掘出诸多新的防治方法和途径，其中利用生物技术改良作物或通过基因沉默手段抑制线虫生长已成为一种重要的研究和防治手段[913]。
本课题组在此前的研究中，成功的从南方根结线虫中克隆了一下线虫寄生相关基因分支酸变位酶基因（Chorismate mutase gene，CM）,该基因在线虫亚腹食道腺细胞中所表达，且在2龄幼虫侵染前与侵染早期阶段的表达水平较高[14]，表明其与根结线虫侵染有关。为进一步明确其功能，本研究采用离体条件dsRNA浸泡线虫二龄幼虫，测试了南方根结线虫CM基因的沉默对线虫寄生能力的影响，研究结果同时为基于RNAi技术的线虫防治策略开发新的靶标。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1.1 供试线虫
供试南方根结线虫由大学线虫实验室提供。经过单卵块扩繁纯化和鉴定以后，线虫群体活体于番茄植株上保种，卵块成熟后，挑取大小一致的新鲜卵块，清洗干净后放置在孵化皿中25℃中，孵化3天。培养和接种南方根结线虫的番茄品种均为苏粉2008。
1．1.2主要试剂和酶类
间苯二酚（resorcinol）、章鱼胺（octopamine）、明胶（gelatin）和亚精胺（spermidine）均购自sigma公司；异硫氰酸荧光素（FITC）和考马斯蓝G250购自南京赛吉生物科技有限公司。
1．2 方法
1．2．1 南方根结线虫二龄幼虫的采集
从接种过南方根结线虫的番茄根部挑取白色卵块，用无菌水清洗干净后，放在干净的培养皿中，在25℃条件下进行孵化。
吸取孵化好的J2溶液至1.5ml离心管中，6000r/min离心3min，弃掉上清液，加入1.5ml无菌水（RNasefree），混匀后再次离心，重复3次，将线虫体表的杂质清洗干净。
1．2．2总RNA的提取
用RNAgents Total RNA Isolation System（Promega）提取线虫样本总RNA。
分别将保存的寄生早期二龄幼虫和寄生期幼虫样本在液氮中迅速用碾棒充分碾磨；
补充Denaturing solution到300μl，加入1/10体积的2M醋酸钠（pH = 4.0），颠倒混匀4到5次；
加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（pH = 7.0），涡旋震荡10 s，冰上放置15 min；
4 oC，13,000 r/min离心20 min；
转移上层液相到经DEPC处理的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，20 oC放置1h；
4 oC，13,000 r/min离心20 min，弃上清；
加入1ml预冷的75% 乙醇，洗涤RNA沉淀；
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1南方根结线虫二龄幼虫的采集2
1.2.2总RNA的提取2
1.2.3 cDNA的合成3
1.2.4体外转录模板的制备3
1.2.5体外转录4
1.2.6 dsRNA的浸泡 4
1.2.7RTPCR检测Micm1转录水平 5
1.2.8体外RNA干涉处理后线虫的接种实验 5
2结果与分析 5
2.1 Micm1离体RNAi 6
2.2离体RNA干涉后Micm1转录水平的检测6
2..3接种实验 7
3讨论7
致谢7
参考文献8
南方根结线虫分支酸变位酶基因离体RNA干扰研究
引言
引言
植物寄生线虫是世界农作物的重要病原物之一,每年造成全世界农作物受损高达1250亿美元[1]。根结线虫（Meloidogyne）是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，主要包括南方根结线虫（M.incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla)等4大优势种群[2]。目前已知为害蔬菜的线虫主要有、花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫等。根结线虫主要为害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
小不等的白色根瘤，有的呈念珠状。被害株地上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。在我国,以南方根结线虫分布最广,危害最大。近年来,随着农业种植结构的调整,保护地作物栽培面积迅速发展,同时也为南方根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境,使得土壤中的根结线虫得以积聚增殖,发病田的寄主常年减产15%～20%,严重时达到70%以上[3]。
尽管如此，对于这类病害目前仍然缺乏有效的防治策略，因此寻找控制根结线虫危害有效的防治手段和药物靶标已成为保障我国农业生产的重要任务之一。目前，一般采用农业措施、应用抗性品种和化学防治的方式来防治植物寄生线虫[46]。但是化学防治方法存在污染大、毒性强、残留长等多种严重问题，且防治成本高，不适用于提倡科学、环保、可循环、无公害平衡发展的当代要求；单独使用农业防治则不能完全清除，效果不理想。通过抗性植物抑制植物线虫繁殖，是最有效的防治植物线虫方法[78]。但毒力强的线虫会对抗性基因产生抗性，使得抗性基因发挥作用不够理想。近年来许多研究者潜心研究，并不断发掘出诸多新的防治方法和途径，其中利用生物技术改良作物或通过基因沉默手段抑制线虫生长已成为一种重要的研究和防治手段[913]。
本课题组在此前的研究中，成功的从南方根结线虫中克隆了一下线虫寄生相关基因分支酸变位酶基因（Chorismate mutase gene，CM）,该基因在线虫亚腹食道腺细胞中所表达，且在2龄幼虫侵染前与侵染早期阶段的表达水平较高[14]，表明其与根结线虫侵染有关。为进一步明确其功能，本研究采用离体条件dsRNA浸泡线虫二龄幼虫，测试了南方根结线虫CM基因的沉默对线虫寄生能力的影响，研究结果同时为基于RNAi技术的线虫防治策略开发新的靶标。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1.1 供试线虫
供试南方根结线虫由大学线虫实验室提供。经过单卵块扩繁纯化和鉴定以后，线虫群体活体于番茄植株上保种，卵块成熟后，挑取大小一致的新鲜卵块，清洗干净后放置在孵化皿中25℃中，孵化3天。培养和接种南方根结线虫的番茄品种均为苏粉2008。
1．1.2主要试剂和酶类
间苯二酚（resorcinol）、章鱼胺（octopamine）、明胶（gelatin）和亚精胺（spermidine）均购自sigma公司；异硫氰酸荧光素（FITC）和考马斯蓝G250购自南京赛吉生物科技有限公司。
1．2 方法
1．2．1 南方根结线虫二龄幼虫的采集
从接种过南方根结线虫的番茄根部挑取白色卵块，用无菌水清洗干净后，放在干净的培养皿中，在25℃条件下进行孵化。
吸取孵化好的J2溶液至1.5ml离心管中，6000r/min离心3min，弃掉上清液，加入1.5ml无菌水（RNasefree），混匀后再次离心，重复3次，将线虫体表的杂质清洗干净。
1．2．2总RNA的提取
用RNAgents Total RNA Isolation System（Promega）提取线虫样本总RNA。
分别将保存的寄生早期二龄幼虫和寄生期幼虫样本在液氮中迅速用碾棒充分碾磨；
补充Denaturing solution到300μl，加入1/10体积的2M醋酸钠（pH = 4.0），颠倒混匀4到5次；
加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（pH = 7.0），涡旋震荡10 s，冰上放置15 min；
4 oC，13,000 r/min离心20 min；
转移上层液相到经DEPC处理的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，20 oC放置1h；
4 oC，13,000 r/min离心20 min，弃上清；
加入1ml预冷的75% 乙醇，洗涤RNA沉淀；
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