小麦赤霉病菌fgvam7结合蛋白fgvam6的生物学功能分析
摘要：小麦赤霉病是世界性病害，流行频率高，所致损害大。因此开展该病原菌毒素产生机理和致病机制的研究具有重要意义。真核细胞中囊泡运输是一项基本的生命活动。在内涵体到液泡膜间的运输过程中HOPS复合体发挥重要作用。在前期的研究中发现，SNARE蛋白FgVam7在小麦赤霉菌的生长发育及致病过程中具有重要作用。进一步研究发现，通过酵母双杂交显示FgVam6与FgVam7相互作用。本文我们对FgVam6的生物学功能进行了分析。通过构建载体及原生质体转化获得了?Fgvam6突变体及互补菌株。与野生型PH-1和互补菌株比较发现，?Fgvam6突变体孢子产量下降，生长减慢，对外界环境变得更敏感，且致病能力丧失。表明FgVAM6参与调控小麦赤霉病菌的生长发育及致病过程。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1．1．1 供试菌株及培养条件...............................................2
1．1．2 实验用培养基..................................................2
1.2方法 2
1.2.1酵母双杂交实验..................................................
1.2.2 敲除载体的构建2
1.2.3原生质体转化2
1.2.4赤霉菌转化子验证3
1.2.5 赤霉病菌FgVam6敲除突变体的互补转化及验证3
1.2.6 酵母转化..........................................................3
1.2.7 菌丝生长测定.......................................................4
1.2.8 孢子产量测定........................................................
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
4
1.2.9 致病性测定..........................................................4
1.2.10细胞壁胁迫测定......................................................4
2结果与分析4
2.1FgVam6敲除突变体的获得4
2.2 FgVam6影响小麦赤霉病菌的产孢量........................................4
2.3 FgVam6影响小麦赤霉病菌对细胞壁胁迫的敏感性............................4
2.4 FgVam6影响小麦赤霉病菌的生长速率.....................................5
2.5 FgVam6影响小麦赤霉病菌的致病性......................................5
2.6 酵母双杂交显示FgVam6与FgVam7互作....................................6
3讨论 6
致谢7
参考文献7
小麦赤霉病菌FgVam7结合蛋白FgVam6生物学功能分析
引言
引言 小麦是我国的主要麦类作物，种植面积和产量仅次于水稻。为我国第二大粮食作物。病害的危害一直严重影响着麦类作物生产。小麦赤霉病的流行频率高、所致损失大。该病从幼苗至抽穗皆可发生，引起苗枯、茎腐和穗腐，尤以穗腐发生普遍和严重。病原物无性态为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）[1]，病麦粒中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等多种对人有害的毒素[2]。因此开展该病原菌毒素产生机理和致病机制的研究具有重要意义。
真核细胞内许多蛋白质需靠膜泡从一种细胞器运输到另一种细胞器,它的基本过程包括:膜泡在供膜处“芽生”形成,将被运输蛋白包在其中,定向地运输到受膜以后,与受膜相互融合将被运输蛋白释放,从而完成膜泡运输过程[3]。真核细胞中蛋白质和脂类在包括细胞膜在内的多种细胞器间的定向转运是维持细胞正常生命活动所必需的过程。这种定向转运不仅保证物质运输的方向性, 并且限定了蛋白质通过分泌途径中各细胞器的顺序。运输囊泡与受体膜之间的最初接触是由拴系因子和Rab GTPase介导的,拴系因子促使囊泡与受体膜靠近,使囊泡上的vSNARE与靶膜上的tSNARE形成四螺旋束的SNARE复合体,从而促进磷脂双分子层的融合[4]。
前期研究中发现SNARE蛋白VAM7具有维持液泡形态和功能，调控胞吞作用，在细胞的生长发育[5]，然而其作用机制尚不明确。进一步研究发现VAM7的结合蛋白是VAM6。VAM6/Vps39为拴系因子，主要功能是促进Ypt7的核苷酸交换以及作为HOPS复合体的一部分来引导SNARE与液泡膜的融合。虽然VAM6/Vps39的研究在酵母中已趋于成熟，但在赤霉病菌中的生物学特性尚不明确。本研究拟采用PEG介导的方法敲除赤霉病菌中的VAM6基因，通过对比突变体和野生型的不同来阐明其在赤霉病菌生长发育中所起到的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株及培养条件
F. graminearum 野生型菌株PH1由本实验室保存，突变体和功能互补菌株均由本研究获得。所有菌株生物学性状测定前，均在PDA培养基上于28℃、黑暗培养23 d。菌株长期保存采用滤纸片发，置于20℃保存。
1．1．2 实验用培养基
RM再生培养基（每升含酵母提取物1 g，酪水解蛋白素1 g，蔗糖342 g，琼脂粉或琼脂糖15%）用于培养转化子，LB培养基（每升含酵母提取物1 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂粉1.5%）用于培养大肠杆菌。
1．2 方法
1.2.1酵母双杂交实验
酵母双杂交是检测蛋白之间相互作用的经典方法，经过多年的发展和完善，现在的双杂交系统已可以很好的避免假阳性，有效鉴定蛋白之间的互作。酵母转录因子GAL4包括两个分离但必须的结构域：位于N端的DNA结合域（DNABD）和位于C端的转录激活域（DNAAD）。当DNABD和AD在空间上充分靠近时可启动下游基因的表达。将两个目标蛋白分别与DNABD和AD融合表达，若这两个蛋白互作，则会启动下游报告基因的表达。将FgVam6作为激活蛋白，FgVam7作为诱饵蛋白分别构建到双杂交载体pGADT7和pGBKT7中，共转化酵母菌株AH109，同时设置阴性和阳性对照，3 d后观察。
1.2.2敲除载体的构建
同源重组是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换目的基因片段，从而产生突变体。敲除载体构建以FgVAM6为例，具体方法如下：将F. graminearum基因组数据库中FgVAM6基因上、下游各1 kb左右的DNA序列作为同源重组的上、下两臂，构建基因敲除载体。以野生型PH1基因组DNA为模板，分别用引物VAM61F / VAM62R和VAM63F / VAM64R 进行PCR扩增上、下臂片段，电泳、切胶回收将PCR产物纯化。以潮霉素磷酸转移酶基因（HPH）为模板，用引物YG/F、HY/R和HYG/F、HYG/R进行PCR扩增上下两半部分。再用引物VAM61F 、HY/R和HYG/F、VAM64R进行overlap PCR扩增得到敲除载体的上下两半部分，之后将这两个片段导入到赤霉病菌的原生质体中进行同源重组，达到突变的目的。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1．1．1 供试菌株及培养条件...............................................2
1．1．2 实验用培养基..................................................2
1.2方法 2
1.2.1酵母双杂交实验..................................................
1.2.2 敲除载体的构建2
1.2.3原生质体转化2
1.2.4赤霉菌转化子验证3
1.2.5 赤霉病菌FgVam6敲除突变体的互补转化及验证3
1.2.6 酵母转化..........................................................3
1.2.7 菌丝生长测定.......................................................4
1.2.8 孢子产量测定........................................................
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4
1.2.9 致病性测定..........................................................4
1.2.10细胞壁胁迫测定......................................................4
2结果与分析4
2.1FgVam6敲除突变体的获得4
2.2 FgVam6影响小麦赤霉病菌的产孢量........................................4
2.3 FgVam6影响小麦赤霉病菌对细胞壁胁迫的敏感性............................4
2.4 FgVam6影响小麦赤霉病菌的生长速率.....................................5
2.5 FgVam6影响小麦赤霉病菌的致病性......................................5
2.6 酵母双杂交显示FgVam6与FgVam7互作....................................6
3讨论 6
致谢7
参考文献7
小麦赤霉病菌FgVam7结合蛋白FgVam6生物学功能分析
引言
引言 小麦是我国的主要麦类作物，种植面积和产量仅次于水稻。为我国第二大粮食作物。病害的危害一直严重影响着麦类作物生产。小麦赤霉病的流行频率高、所致损失大。该病从幼苗至抽穗皆可发生，引起苗枯、茎腐和穗腐，尤以穗腐发生普遍和严重。病原物无性态为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）[1]，病麦粒中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等多种对人有害的毒素[2]。因此开展该病原菌毒素产生机理和致病机制的研究具有重要意义。
真核细胞内许多蛋白质需靠膜泡从一种细胞器运输到另一种细胞器,它的基本过程包括:膜泡在供膜处“芽生”形成,将被运输蛋白包在其中,定向地运输到受膜以后,与受膜相互融合将被运输蛋白释放,从而完成膜泡运输过程[3]。真核细胞中蛋白质和脂类在包括细胞膜在内的多种细胞器间的定向转运是维持细胞正常生命活动所必需的过程。这种定向转运不仅保证物质运输的方向性, 并且限定了蛋白质通过分泌途径中各细胞器的顺序。运输囊泡与受体膜之间的最初接触是由拴系因子和Rab GTPase介导的,拴系因子促使囊泡与受体膜靠近,使囊泡上的vSNARE与靶膜上的tSNARE形成四螺旋束的SNARE复合体,从而促进磷脂双分子层的融合[4]。
前期研究中发现SNARE蛋白VAM7具有维持液泡形态和功能，调控胞吞作用，在细胞的生长发育[5]，然而其作用机制尚不明确。进一步研究发现VAM7的结合蛋白是VAM6。VAM6/Vps39为拴系因子，主要功能是促进Ypt7的核苷酸交换以及作为HOPS复合体的一部分来引导SNARE与液泡膜的融合。虽然VAM6/Vps39的研究在酵母中已趋于成熟，但在赤霉病菌中的生物学特性尚不明确。本研究拟采用PEG介导的方法敲除赤霉病菌中的VAM6基因，通过对比突变体和野生型的不同来阐明其在赤霉病菌生长发育中所起到的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株及培养条件
F. graminearum 野生型菌株PH1由本实验室保存，突变体和功能互补菌株均由本研究获得。所有菌株生物学性状测定前，均在PDA培养基上于28℃、黑暗培养23 d。菌株长期保存采用滤纸片发，置于20℃保存。
1．1．2 实验用培养基
RM再生培养基（每升含酵母提取物1 g，酪水解蛋白素1 g，蔗糖342 g，琼脂粉或琼脂糖15%）用于培养转化子，LB培养基（每升含酵母提取物1 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂粉1.5%）用于培养大肠杆菌。
1．2 方法
1.2.1酵母双杂交实验
酵母双杂交是检测蛋白之间相互作用的经典方法，经过多年的发展和完善，现在的双杂交系统已可以很好的避免假阳性，有效鉴定蛋白之间的互作。酵母转录因子GAL4包括两个分离但必须的结构域：位于N端的DNA结合域（DNABD）和位于C端的转录激活域（DNAAD）。当DNABD和AD在空间上充分靠近时可启动下游基因的表达。将两个目标蛋白分别与DNABD和AD融合表达，若这两个蛋白互作，则会启动下游报告基因的表达。将FgVam6作为激活蛋白，FgVam7作为诱饵蛋白分别构建到双杂交载体pGADT7和pGBKT7中，共转化酵母菌株AH109，同时设置阴性和阳性对照，3 d后观察。
1.2.2敲除载体的构建
同源重组是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换目的基因片段，从而产生突变体。敲除载体构建以FgVAM6为例，具体方法如下：将F. graminearum基因组数据库中FgVAM6基因上、下游各1 kb左右的DNA序列作为同源重组的上、下两臂，构建基因敲除载体。以野生型PH1基因组DNA为模板，分别用引物VAM61F / VAM62R和VAM63F / VAM64R 进行PCR扩增上、下臂片段，电泳、切胶回收将PCR产物纯化。以潮霉素磷酸转移酶基因（HPH）为模板，用引物YG/F、HY/R和HYG/F、HYG/R进行PCR扩增上下两半部分。再用引物VAM61F 、HY/R和HYG/F、VAM64R进行overlap PCR扩增得到敲除载体的上下两半部分，之后将这两个片段导入到赤霉病菌的原生质体中进行同源重组，达到突变的目的。
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