灰飞虱atp结合盒转运蛋白abcb7基因克隆与序列分析
灰飞虱是多种植物病毒病的传毒介体,会给水稻生产造成严重的损失。长期使用化学农药防治，使灰飞虱的抗药性问题愈发突出，因此必须加强对灰飞虱的抗性治理。而研究抗性相关基因，明确杀虫剂抗性机制是抗性治理的前提。本研究依据其它动物的相关报道，对灰飞虱的ATP结合盒转运蛋白基因进行克隆，以便进一步确定其与抗药性的关系。试验利用灰飞虱转录组数据，搜索获得ABC基因片段，PCR验证后依据该系列设计引物，通过RACE技术获得末端序列，最后通过End to End 扩增出2409bp的全长基因系列。该基因含有一个开放阅读框（2265bp）共编码754个氨基酸预测蛋白分子质量为83.78KD，等电点为9.32，无信号肽序列。序列中含有一个核苷酸结合结构域和一个由4个α螺旋构成的跨膜结构域，还具有ABC转运蛋白的保守区域Walke rA 、WalkerB、Signature C 和Q-loop。利用进化树进行同源性分析显示，该基因与昆虫的ABC转运蛋白相似性最高，达80%以上,证实该基因属于ATP结合盒转运蛋白超家族。依据该基因具有的典型ABC基因家族特征，命名为灰飞虱ABCB7基因。研究结果为更好地了解ABC转运蛋白在抗药性中的作用奠定基础。关键词；灰飞虱；ATP结合盒；抗药性；PCRCloning and sequence analysis of an ATP-binding cassette transporter gene from small brown plant hopper, Laodelphax striatellusStudent majoring in plant protection Wang Meng-meng Tutor Han Zhao-junAbstractSmall brown plant hopper, Laodelphax striatellus, is a vector insect transmitting many kinds of plant virus and usually causes serious damage to rice production. Due to long-term use of chemical pesticides to control, this hopp *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
er has developed serious insecticide resistance. For efficient and sustainable control, resistance management must be strengthened. Identification of resistance genes and declaring insecticide resistance mechanism is the precondition for resistance management. Thus, based on the reports on the other animals this work try to clone ATP-binding cassette transporter(ABC) genes, the possible resistance related gene, to founding the base for declaring the possible contribution of ABC to insecticide resistance in this plant hopper. After search the transcript data, a ABC like sequence fragment was selected and verified by PCR. Then the full length gene of 2409bp was cloned by RACE amplification and end to end PCR. This gene showed a ORF of 2265bp encoding a protein of 754 amino acid residues with a molecule of 83.78KD, with pl9.32.No signal peptide was found. Sequence analysis showed that this gene consists of a trans-membrane domain of 4α and a nucleotide binding domain. It also possesses the typical conserved domains of Walker A, Walker B, Signature C and Q-loop. Homologue analysis showed that this gene shears high similarity (more than 80%) with those ABC proteins from various insects. Thus, this gene was identified as ABC transporter gene from small brown plant hopper, and was designed as ABCB7 according to its molecular characteristics. This result paves the way for better understanding the function of the ABC transporter in the drug resistance. 灰飞虱(Laodelphax striatellus)属半翅目，飞虱科。是稻飞虱的一种，是我国粮食作物上的一种重要害虫。它不仅吸取被害作物的浆汁造成直接危害，还给被害作物传染病毒，致使其发生病毒病，如水稻条纹叶枯病、水稻矮缩病、小麦丛矮病、玉米粗缩病等。[1]灰飞虱自上世纪60年代大发生之后，经过30年左右的潜伏，于90年代后期又一次暴发，并持续至今。近年来，灰飞虱在江苏、浙江、安徽及山东等地区频繁暴发，给水稻稳产、高产造成了巨大影响。灰飞虱国内分布遍及全国各地，以长江流域和华北稻区发生较为严重。灰飞虱同样广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北非等地，也是世界范围内水稻产生的主要害虫之一。[2]目前对灰飞虱的防治主要以化学药剂防治为主。[3]同时，由于化学药剂的大量以及不合理施用，已使灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗性。抗性机理的研究是抗性治理的基础，也是害虫防治的关键环节。尽管不同昆虫的遗传背景有所不同，但对杀虫剂的抗性机理却相对保守。ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族是最大的转运蛋白基因家族，其由于含有一个三磷酸腺苷( ATP) 的结合盒而得名，ABC 转运蛋白通过利用结合并水解ATP 释放的能量对溶质中多种生物分子进行跨膜转运。它在生物体中以半分子转运子或全分子转运子的形式存在，每个半分子转运子包括1 个跨膜结构域和1个核苷酸结合结构域，每个跨膜结构域一般由6 个α螺旋构成，形成一个跨膜通道以实现底物分子的跨膜运输，并参与底物的识别过程。[4]这些蛋白转运各种各样的物质，包括糖，氨基酸，金属离子，肽，蛋白质，和大量的疏水性化合物以及跨细胞内外膜的代谢物。ABC基因参与细胞内的许多活动，一些人类的遗传疾病也是由于其基因突变导致或促成的。[7]在昆虫中，ABC转运蛋白不仅在分子运输中具有重要功能，在其代谢、发展以及杀虫剂抗性中扮演一定角色。ABC 转运蛋白的NBD 位于细胞质内，每个核苷酸结合结构域有一个长约200 个氨基酸的非常保守的序列，包含了3 个保守区域，分别为WalkerA( P-loop) 、Walker B 和特征基序C ( 也称Signature基序或特征基序S) 。[5]根据ABC 转运蛋白结构域构成和氨基酸序列的同源性，ABC 转运子被分成了几个亚家族。哺乳动物中已发现7 个ABC 亚族( ABCA—ABCG) ，而在果蝇( Drosophila melanogaster)、斑马鱼( Danio rerio)等多种生物体基因组序列中已发现了ABC 转运子的第8 个亚族———ABCH。[10]目前已有研究在蚕的ABC转运子进行了全基因组分析。图1为ABC转运蛋白的结构图。[8]图1. ABC转运子的组织结构由于灰飞虱对杀虫剂的抗性受多种因子影响，因而其抗性机制较为复杂，对其抗性的研究具有重大深远的意义。该研究以本实验室灰飞虱转录组数据库为基础，利用生物信息学技术，搜索预测ATP结合盒蛋白基因的EST序列，应用PCR、琼脂糖凝胶电泳等技术，通过测序比对来分析鉴定灰飞虱ATP结合盒转运蛋白B家族的ABCB7基因序列，并进一步对其进行全长克隆。通过这些研究，可望为进一步分析ABC转运蛋白在灰飞虱抗药性中的重要性奠定工作基础。1 材料与方法1．1 试验材料1．1．1 供试昆虫 试验所需初始虫源由大学植物保护学院昆虫生理与生化实验室提供，虫种手为2010年10月采自江苏建湖水稻田的灰飞虱若虫，并在室内长期连续饲养获得。1．1．2 试虫饲养采用水稻幼苗法进行室内人工饲养。饲养条件为温度25±1°C，光暗期时间比为16h8h水稻幼苗采用无土栽培法选用粳稻种子，进行充分的泡种和催芽，然后将催好芽的种子均铺在塑料盒中的海绵上，盖上棉纱布，用橡皮筋扎紧置于养虫架上，光照、温度同灰飞虱饲养条件。48h左右增加水量（以充分湿润海绵为宜，禁止过量），待水稻芽大于3cm时即可接种灰飞虱若虫或供成虫产卵用。此法培育的水稻苗最佳使用周期是2个周，以水稻叶片失绿变黄为标志，需要及时更换新鲜稻苗。1．1．3 主要试剂 TRIzol总RNA提取试剂盒，美国Invitrogen 公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTP 、Marker、M-MLV为宝生物工程（大连）有限公司（ TakaRa）产品； PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；1.5mlPCR管，美国AXYGEN公司；其它常规试剂为国产 AR级或进口分装 AR级产品，购自南京基天生物技术有限公司和南京生兴生物技术有限公司。1．1．4 主要仪器 PCR扩增仪为Takara公司； 高压灭菌锅SS-325，日本TOMY公司；超纯水器E1IX10，美国millipore公司；凝胶成像系统Gel Doc2000，美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机Biofoge stratos，德国Heraeus公司；离心机Centrifuge 5424，德国Eppendorf公司；烘箱MC000712，美国MMM公司；制冰机SIM-F124，日本SANYO公司；超低温冰箱906，美国FORMA公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；恒温水浴锅，宁波江南仪器公司；小型水平电泳槽，北京六一仪器；1．2 试验方法1.2.1 总RNA的提取 用TRIzol试剂提取总RNA（1）将 25～30 mg左右灰飞虱组织放入匀浆器内，加 1 ml Trizol 试剂匀浆，转入 1.5ml的eppendorf 管中；（2）2~8 ℃，12，000 g离心15 min后，将上清液转入另一个新的1.5ml eppendorf管中；（3）上清液在 15~30 ℃下温育 5 min后，然后以每 1 ml Trizol试剂加入 0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用力摇匀，15~30 ℃下温育2~3min；（4）2~8 ℃条件下，12，000 g离心20 min。混合物分层，上层为无色的水相（RNA在水相中）；（5）用枪头将上层水相转移到另一个洁净的eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇沉淀RNA，15~30 ℃下温育10 min；2~8 ℃条件下，12，000 g离心10 min；（6）弃上清，用1ml75%乙醇洗一次，涡旋振荡样品，2~8 ℃条件下，7，500 g离心5 min；（7）小心弃去上清液，然后空气或真空干燥 5~10 min，加 30μl无RNA酶的（RNase-free）水，用枪头吸几次后，于60 ℃下温育10 min，溶解RNA，-70 ℃贮存备用。1.2.2 总RNA质量检测 利用琼脂糖电泳监测总RNA质量的完整性将制胶器、梳子、电泳槽和其他器具在双氧水中浸泡30min以上，取出后用DEPC处理水冲洗干净，晾干备用；将制胶器，梳子以及托盘组装好，配制浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，待凝胶冷却后，用处理过的RNAse free的器具进行上样操作，110V，电泳时间为20min，在凝胶成像系统中检测电泳条带；利用eppendorf AQ-07核酸蛋白定量仪对RNA的浓度以及吸光度值进行检测，看总RNA的浓度以及其他指标是否达到要求；1.2.3 cDNA第一链的合成 cDNA第一链的合成采用Ivitrogen MLV Reverse trascriptase进行，详细步骤见试剂盒说明书，简要步骤如下 在0.2mlRNAse-free的微量离心管中配制下列成分总RNA 1μg，OligdT（18）2μL，ddH2O添加至7μL将上述（1）混合液轻轻混匀，65°C孵育5min，取出并加入 4μL 5*first strand buffer 2μL DDT 1μL RNase inhibitor37°C孵育2min，取出，加入1μLMLV-Reverse transcriptase；以下步骤在PCR扩增仪中进行37°C，50min；0°C，15min，结束反应后使用持家基因阳性验证成功所得的cDNA模板原液及用ddH2O稀释5倍后的使用液置于-20°C存放至用于PCR扩增。1.2.4 第一条RACE模板合成 5′RACE和3′RACE模板的合成参考照BD公司ClontechTMSMARTer试剂盒说明书，简要步骤如下准备足够的Buffer Mix，每10μL体系加入 5*First-strand Buffer 2μL DDT（20mM） 1μL dNTP Mix（10mM） 1μL 总体积 4μL 混合均匀，离心，在室温下放置；在离心管中混合以下试剂（Mix1） For5′RACE For3′RACE TotalRNA 1.00μg TotalRNA 1.00μg 5′-CDS Primer A 1.00μL 3′-CDS Primer 1.00μL DEPC水 加至3.75μL DEPC水 加至4.75μL混合均匀，简短离心，72°C3min，42°C2min，14,000g，离心10sec；做5′RACEcDNA模板时，加入1μLSMARter ⅡA oligo，充分混合，离心，准备以下的Marster Mix 第一步中的Buffer Mix 4.00μL RNase Inhibitor（40U/μL） 0.25μL SMART Scripe RTase（100U） 1.00μL 总体积 5.25μL将5.25μL的Marster Mix加入变性的RNA（3′或5′）Mix1中，总体积10μL，温和吸打混匀，简短离心，42°C气浴90min，70°C，10min终止反应；用Tricine-EDTA Buffer 稀释（加入35μL），验证后放入-20°C冰箱保存，每次PCR时使用0.5μL/25μL体系。1.2.5 引物设计采用primer premier 5.0软件，利用验证测序出来的序列设计灰飞虱ABCB7的RACE引物:5’GSP: GCACAAGAATCTCATCAGCGTCCATC 5’NGSP: CCATCACTGCCGCATTATACACTTCC3’GSP: CTGGAGAACGGCAAACTTCGGGAGA 3’NGSP: CTGGAGAACGGCAAACTTCGGGAGA1.2.6 RACE-PCR反应体系及条件反应体系 10*LA Buffer 2.50μL Mg2+（25mol/L） 2.00μL dNTP Mixture(2.5mmol/L/each) 2.00μL UPM(Universal Primer A Mix) 3.00μL GSP(10mmol/L) (Gene-specific primer) 1.00μL RACE cDNA模板（10*稀释） 1.00μL LA Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25μL ddH2O 13.75μL 总体积 25.00μLRACE巢式PCR反应体系如RACE PCR反应体系，其中UPM为nupm，GSP为ngsp，模板为RACE PCR反应产物10倍或100倍稀释（第一轮反应有带时稀释100倍，无带则稀释10倍）。反应条件第一轮PCR反应条件为94 ℃-30sec, 72 ℃-3min, 5个循环；94 ℃-30sec，72 ℃-3min，5个循环； 94 ℃-30sec，68 ℃-30sec，72℃-3min，25个循环；72 ℃延伸10min，12℃保存。取20μL电泳，视第一轮PCR产物的电泳结果，若有将其稀释10-100倍做为模板进行第二轮巢式PCR。第二轮PCR反应条件为94℃预变性，94 ℃-30sec，68 ℃-30sec，72 ℃-3min，25个循环；72 ℃延伸10min，12℃保存。1.2.7 PCR产物的回收、纯化、连接、转化和测序 将得到的PCR产物电泳跑胶，若得到单一的没有单引物扩增的特意条带，视为目标带，切胶回收至测序。1.2.7.1 PCR产物的回收纯化步骤如下PCR产物经琼脂糖电泳分离后确定产物大小即可进行凝胶纯化回收，回收采用Axygen DNA Gel Extraction Kit进行，参考试剂盒说明书，简要操作步骤如下从电泳板上切割下含目的DNA片段的凝胶块，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎后放入1.5mlEP管；称重（提前记录1.5mlEP管重）后并将其放入其中，将其适当切小，加速溶解。每100mg凝胶加入300μL Buffer DE-A；凝胶溶解70℃，保温5-10min，每2min混匀一下，至凝胶溶解，胶完全融化后加入0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B（1mg=1μL的体积），混匀（当目标DNA片段小于400bp时，需加入一个凝胶体积的异丙醇）；Miniprep column 柱装入2ml洗管，将上述混合液转移至Miniprep column柱，室温放置2min。室温离心1min；取下Miniprep column柱，倒掉收集管中的废液，将Miniprep column柱放入同一收集管中，加入500mlBufferW1，室温12,000g离心1min；取下Miniprep column柱，倒掉收集管中的废液，将Miniprep column柱放入同一收集管中，加入700mlBufferW2，室温12,000g离心1min；重复步骤6一次；取下Miniprep column柱，倒掉收集管中废液，将Miniprep column柱放入同一收集管中，室温12,000g离心2min；将Miniprep column柱放入新的1.5ml离心管中，在Miniprep column柱子膜中央加30μLddH2O（ddH2O加热到60℃能提高洗脱效率），不加盖室温放置2min；盖上离心管，室温12,000g离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段，4℃保存备用。1.2.7.2 质粒载体的连接反应连接反应采用Promega公司的PGEM-Teasy连接载体进行，参照说明书，按下列反应体系配制混合液 2*Rapid ligation buffer 5.0μL pGEM T-easy vector 0.5μL Target DNA（>5ng） 3.0μL T4DNA ligase （3U/μL） 0.5μL Sterile deionizedH2O 1.0μL Final volume 10μL1000rpm转速1min短暂离心后将反应液置于4℃冰箱过夜（>12h）以达到最佳连接效率。1.2.7.3 转化反应和细菌培养转化反应步骤如下从-70℃冰箱中取出300mL感受态细胞悬液DH5α，冰上化冻；加入T-easy质粒连接反应液（含量不超过50ng，体积不超过10ml），轻轻摇匀，冰上放置30min；42℃水浴热激90sec，热激后迅速放置于冰上冷却2min；向管中加入1mlLB液体培养基（不含Amp抗生素），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；将上述菌液摇匀后取150ml涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养及吸收后，37℃倒置培养，10-16h间观察直至长成为连成片的大小均匀的蓝白菌落。培养平板可置4℃短暂保存。1.2.7.4 单克隆的挑取和菌株扩大培养（1）取灭菌处理过的干净螺口刻度试管，加入4ml的含Amp抗生素的LB液体培养基；（2）用高温灭菌处理过的牙签挑取单克隆的白斑，置于刻度试管中，盖上盖，不能旋紧以备氧气稍许流通；（3）刻度试管于37℃摇床中250转/分振荡培养，12至16h后取出提取质粒。1.2.7.5 质粒的提取和酶切检测质粒提取采用Omega公司的质粒小提试剂盒，提取转化菌株中的质粒的操作步骤如下取1.5mL的细菌发酵液置于1.5mL的灭菌离心管中，10,000g，离心1min。去除上清，在离心沉淀中加入250μL的SolutionⅠ（加入前确保已加入了RnaseA），涡旋，或使用移液枪吸打沉淀，使沉淀充分混匀；再加入250μL的SolutionⅡ，将离心管中轻轻上下颠倒4-6次，得到澄清的混合物，之后在室温下孵育2min至5min（此步不能剧烈震荡）；再加入350μL的SolutionⅢ，离心管轻轻颠倒数次，充分混匀，最后管中出现白色絮状沉淀，16,000g，离心10min；小心地将上清液从管中吸出，收集在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中，将HiBind Miniprep Column（Ⅰ）安置在试剂盒中提供的2ml collection tube上，10,000g，离心1min；倒去离心滤液，再在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中加入500μL的Buffer HB，10,000g，离心1min；倒去离心滤液，再在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中加入700μL的DNA Wash Buffer，10,000g，离心1min（DNA Wash Buffer在使用前必须确保加入了指定量的无水乙醇）；重复步骤（8）一次；13,000g，空柱离心2min，使柱子干燥；HiBind Miniprep Column（Ⅰ）安置到一个干净的1.5ml离心管上，在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中加入30-50μL的灭菌去离子水或Elution Buffer，室温放置2至3min后14,000g离心1min，收集管中的液体为所获得质粒，-20℃冰箱保存。利用pGEM T-easy载体中外源片段插入点的两端各含一个EcoR Ⅰ酶切位点的特性，用EcoR Ⅰ酶对提取质粒进行酶切，以检测载体质粒是否插入了外源目标片段。EcoRⅠ酶切体系如下10*H Buffer 2μLPlasmid DNA 7μLEcoRⅠ 1μLSterile deionized H2O 10μLFinal volume 20μL酶切产物在37℃水浴中保温2h左右，之后取10μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。若观察有两条核氨酸条带，上面一条为载体，下面一条为目标条带，大小为所克隆片段的大小，则证明克隆的为阳性菌液。1.2.7.6 测序分析 经质粒酶切检测后的细菌发酵液，取适量送至上海Invitrogen公司进行测序，使用的仪器为ABI3730测序仪。测序引物为M13或T7或SP6。测序结果序列分析通过GeneDoc、ClustalW（2.0）等软件完成，通过BLAST与GenBank中的序列进行同源性比对，同时利用GeneDoc软件进行序列同源性比较分析。1.2.8 End-End验证将5′RACE片段、3′RACE片段和验证的片段拼接而来的全长序列，预测出CDS区域，在5′UTR和3′UTR区各设计上下游引物，为End-End引物（见表1）。用合成的3′RACE模板为模板，PCR验证End-End的RACE全长。PCR体系如下 10*LA Buffer 2.50μL Mg2+（25mol/L） 2.00μL dNTP Mixture(2.5mmol/L/each) 2.00μL Primer1 1.00μL Primer2 1.00μL RACE cDNA模板（10*稀释） 1.00μL LA Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25μL ddH2O 15.25μLTotal volume 25.00μL PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30sec，退火温度Tm上退火1min，72℃延伸2min（按预测片段长短控制时间，LA-Taq酶为1min=800bp）；退火温度由Tm值的温度降至（Tm-5）℃，每一个循环下降0.5℃；然后在（Tm-5）℃下循环30次，最后72℃延伸10min便于加A尾；12℃保持，取出后4℃冰箱保存。PCR产物接着用1.5%琼脂电泳检测，步骤参见1.2.7.1-1.2.7.6，回收、连接、转化、测序和序列分析。表1 灰飞虱ABCB7基因End-End PCR引物End to End 上游引物Lao-F GTTCGTGAGTTGCCGTATEnd to End 下游引物Lao-R TACATCTCATAACCCACGC2 结果与分析2．1 灰飞虱ABCB7基因的克隆及序列测定由灰飞虱转录组搜索获得一ABC基因片段，PCR验证后依据该序列设计引物，通过RACE技术获得末端序列后，拼接成了一个含有开放阅读框为2265bp，共编码754个氨基酸的全长序列。使用Lao-F /Lao-R 为引物进行End to End PCR-扩增，产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，在2.4kb 左右出现1 条特异条带，与预期的片段大小相符( 图1) 。用凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后与T3-easy载体连接，通过蓝白斑筛选出阳性克隆，并进行菌液PCR 验证，对鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序得到的片段与RACE克隆获得的基因序列进行比较，结果表明两者几乎完全一致，由此克隆得到ABCB7基因完整的ORF序列。 M l图1 灰飞虱Abcb7基因的end to end扩增产物的电泳图谱M．Takara DL 5000 MarkerFig.1 end to end pcr 产物ProtParam预测蛋白分子质量为83.78kD，等电点为9.32，总正电荷残基(Arg + Lys) 93个，负电荷残基(Asp + Glu) 74个。N端预测无氨基酸信号肽。用SMART 程序和TMHMM预测结果表明与已知其他物种的Abcb7蛋白存在差异，该蛋白具有一个核苷酸结合结构域和 一个由4个α螺旋构成的跨膜结构域，而其他已知昆虫大多数具有一个核苷酸结合结构域和一个由6个α螺旋构成的跨膜结构域，但是多数哺乳动物则具有一个由5个α螺旋构成的跨膜结构域。如图2，经过保守结构域搜索分析 ABCB7具有ABC 转运蛋白保守区域WalkerA 、WalkerB、Signature C 和Q-loop，证实该基因属于ATP结合盒转运蛋白超家族。图2 灰飞虱Abcb7蛋白保守结构域Fig.2 Proteins conserved structure of LasAbcb7 gene2.2 ABCB7基因的序列同源性分析 通过Blastp ( http: ∥blast.ncbi.nlm.Nih.gov /Blast.cgi) 程序进行在线蛋白质序列比对，结果表明ABCB7基因与蜜蜂(Apis mellifera) 、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae) 、赤拟谷盗( Tribolium castaneum)、果蝇( Drosophila melanogaster)、家蚕（Bombyx B.mori）、丽蝇蛹集金小蜂( Nasonia vitripennis)、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、埃及伊蚊（Aedes A.aegypti）中相应的ABC转运蛋白序列的相似性较高，分别为85%、87%、86%、81%、83%、84% 、84%、83%、和86%，由此可以看出BmAbcb6 与其它昆虫的ABC 转运蛋白序列相似性较高，其序列相当保守(图3)。用ABCB7基因编码的氨基酸序列与人、蜜蜂、冈比亚按蚊、埃及伊蚊、丽蝇蛹集金小蜂、赤拟谷盗、致倦库蚊、果蝇、豌豆蚜( Acyrthosiphon pisum) 、非洲爪蟾( Xenopus tropicalis) 、小鼠( Mus musculus) 、大鼠( Rattus norvegicus ) 、线虫( Caenorhabditis elegans ) 、牛( Bos taurus) 、青鱂鱼( Oryzias latipes) 中可能的ABCB亚族成员进行聚类分析，结果发现ABCB7与蜜蜂、埃及伊蚊、赤拟谷盗、致倦库蚊、冈比亚按蚊、丽蝇蛹集金小蜂、果蝇和豌豆蚜的可能的ABCB 亚族成员聚在一起，亲缘关系较近，而与哺乳动物的ABCB 亚族成员亲缘关系相对较远(图4)。丽蝇蛹集金小蜂N.vitripennis (gi?:345480022);蜜蜂A.mellifera (gi:110765304)?;赤拟古盗T.castaneum(gi?:189238013)?;埃及伊蚊A.aegypti(gi?:157114115)?;果蝇D.melanogaster(gi?:45551501)?;家蚕B.mori(gi?:512905319)黑色阴影表示完全保守氨基酸，灰色阴影表示强保守性氨基酸。The black shadow represents full conserved amino acids,and the grey shadow represents strong conserved amino acids.图3 灰飞虱与其他昆虫ABCB亚族成员同源蛋白的氨基酸保守序列比较Fig.3 A comparison on conserved amino acids of homologous protein sequences from ABCB subfamily members in Laodelphax striatellus and other insect species图4 灰飞虱ABCB7蛋白与其他物种同源蛋白序列的系统发生树Figure.4 Phylogenetic tree of ABCB7 with its homologous proteins from other insect species 3 讨论 本研究以本实验室灰飞虱转录组数据库为基础，利用生物信息学技术，成功克隆了灰飞虱ABCB7基因。和哺乳动物不一样的是，ABCB7具有1 个核苷酸结合结构域和4个α 螺旋构成的跨膜结构域。系统发育分析表明，ABCB7基因与蜜蜂、埃及伊蚊、赤拟谷盗、致倦库蚊、冈比亚按蚊、丽蝇蛹集金小蜂、果蝇和豌豆蚜中可能的ABCB 亚族成员聚在一簇，亲缘关系相对较近，而与哺乳动物的ABCB 亚族成员亲缘关系相对较远。 ABC 蛋白家族的成员数目众多, 广泛存在于植物和动物界, 是进行基因功能进化研究的重要对象。此外, ABC 转运蛋白参与多种有毒物质的吸收、积累和排泄, 并在机体组织防御过程中起重要作用。ABCB亚家族仅存在于脊椎动物中。目前国内外关于灰飞虱ABCB7基因的功能没有找到相关报道。由于ABC转运蛋白超家族群体的庞大和功能的复杂, 许多问题尚待进一步深入研究。ABCB7基因是否是与灰飞虱抗性有关的基因仍需要进一步对其进行组织表达鉴定等一系列后续研究。致谢参考文献[1] 施慎年，左端荣，陈月昌. 灰飞虱对农业生产的危害及其防治策略[J]. 现代农业科技，2009，（6）118-119.[2] 洪晓月，丁锦华.农业昆虫学［M］.2版.北京中国农业出版社，2006:98-101.[3] 韩正光，陈新红,朱祥林,等.灰飞虱发生特点及防控对策［J］．北方水稻，2012，（6）50-52.[4] 孙宏迪，曹晓梅，杨振洲. 特异性等位基因PCR 技术在昆虫抗药性研究中的应用［J］．中华卫生杀虫药械，2011，17（2）141-143.[5] 王华丙，张振义，包锐． ABC 转运蛋白的结构与转运机制［J］． 生命的化学， 2007，27( 3) : 208 -210.[6] 栗凤鹏，吴金美. 家蚕三磷酸腺苷结合盒转运子B亚族基因Abcb6的克隆与序列分析及组织表达［J］.蚕业科学，2011,37（4）0614-0622.[7] 吴转斌，吴金美．ABC 转运子G 亚族与人类疾病［J］．江苏大学学报: 医学版， 2008， 18( 3) : 861-866.[8]Kenneth J.Linton.Structure and Function of ABC Transporters［J］．PHYSIOLOGY,2007,22:122-129.[9] Lynch J，Fukuda Y，Krishnamurthy P，et al．Cell survival under stress is enhanced by a mitochondrial ATP-binding cassette transporter that regulates hemoproteins［J］． Cancer Res，2009，69( 13) :5560-5567[10]Dean M，Annilo T． Evolution of the ATP-binding cassette ( ABC)transporter superfamily in vertebrates［J］．Annu Rev Genomics Hum Genet，2005，6: 123 -142
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法...............................................................2
1．1 试验材料 3
1．1．1 供试昆虫及饲养条件 3
1．1．2 主要试剂 3
1．1．3 主要仪器 3
1．2 试验方法 3
1．2．1 总RNA提取 3
1．2．2 总RNA质量检测 4
1．2．3 cDNA第一条链的合成............................................... 4
1．2．4 第一条RACE模板合成 4
1．2．5 引物设计..........................................................5
1．2．6 RACEPCR反应体系及条件.......................................... 5
1． 2． 7 PCR产物的回收、纯化、连接、转化和测序..............................6
1．2．8 EndEnd验证..................................................... .8
2 结果与分析 5
2．1 灰飞虱ABCB7基因的克隆及序列测定
5
2．2 ABCB7基因的序列同源性分析 5
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
灰飞虱ATP结合盒转运蛋白ABCB7基因的克隆与序列分析
引言
引言
er has developed serious insecticide resistance. For efficient and sustainable control, resistance management must be strengthened. Identification of resistance genes and declaring insecticide resistance mechanism is the precondition for resistance management. Thus, based on the reports on the other animals this work try to clone ATP-binding cassette transporter(ABC) genes, the possible resistance related gene, to founding the base for declaring the possible contribution of ABC to insecticide resistance in this plant hopper. After search the transcript data, a ABC like sequence fragment was selected and verified by PCR. Then the full length gene of 2409bp was cloned by RACE amplification and end to end PCR. This gene showed a ORF of 2265bp encoding a protein of 754 amino acid residues with a molecule of 83.78KD, with pl9.32.No signal peptide was found. Sequence analysis showed that this gene consists of a trans-membrane domain of 4α and a nucleotide binding domain. It also possesses the typical conserved domains of Walker A, Walker B, Signature C and Q-loop. Homologue analysis showed that this gene shears high similarity (more than 80%) with those ABC proteins from various insects. Thus, this gene was identified as ABC transporter gene from small brown plant hopper, and was designed as ABCB7 according to its molecular characteristics. This result paves the way for better understanding the function of the ABC transporter in the drug resistance. 灰飞虱(Laodelphax striatellus)属半翅目，飞虱科。是稻飞虱的一种，是我国粮食作物上的一种重要害虫。它不仅吸取被害作物的浆汁造成直接危害，还给被害作物传染病毒，致使其发生病毒病，如水稻条纹叶枯病、水稻矮缩病、小麦丛矮病、玉米粗缩病等。[1]灰飞虱自上世纪60年代大发生之后，经过30年左右的潜伏，于90年代后期又一次暴发，并持续至今。近年来，灰飞虱在江苏、浙江、安徽及山东等地区频繁暴发，给水稻稳产、高产造成了巨大影响。灰飞虱国内分布遍及全国各地，以长江流域和华北稻区发生较为严重。灰飞虱同样广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北非等地，也是世界范围内水稻产生的主要害虫之一。[2]目前对灰飞虱的防治主要以化学药剂防治为主。[3]同时，由于化学药剂的大量以及不合理施用，已使灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗性。抗性机理的研究是抗性治理的基础，也是害虫防治的关键环节。尽管不同昆虫的遗传背景有所不同，但对杀虫剂的抗性机理却相对保守。ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族是最大的转运蛋白基因家族，其由于含有一个三磷酸腺苷( ATP) 的结合盒而得名，ABC 转运蛋白通过利用结合并水解ATP 释放的能量对溶质中多种生物分子进行跨膜转运。它在生物体中以半分子转运子或全分子转运子的形式存在，每个半分子转运子包括1 个跨膜结构域和1个核苷酸结合结构域，每个跨膜结构域一般由6 个α螺旋构成，形成一个跨膜通道以实现底物分子的跨膜运输，并参与底物的识别过程。[4]这些蛋白转运各种各样的物质，包括糖，氨基酸，金属离子，肽，蛋白质，和大量的疏水性化合物以及跨细胞内外膜的代谢物。ABC基因参与细胞内的许多活动，一些人类的遗传疾病也是由于其基因突变导致或促成的。[7]在昆虫中，ABC转运蛋白不仅在分子运输中具有重要功能，在其代谢、发展以及杀虫剂抗性中扮演一定角色。ABC 转运蛋白的NBD 位于细胞质内，每个核苷酸结合结构域有一个长约200 个氨基酸的非常保守的序列，包含了3 个保守区域，分别为WalkerA( P-loop) 、Walker B 和特征基序C ( 也称Signature基序或特征基序S) 。[5]根据ABC 转运蛋白结构域构成和氨基酸序列的同源性，ABC 转运子被分成了几个亚家族。哺乳动物中已发现7 个ABC 亚族( ABCA—ABCG) ，而在果蝇( Drosophila melanogaster)、斑马鱼( Danio rerio)等多种生物体基因组序列中已发现了ABC 转运子的第8 个亚族———ABCH。[10]目前已有研究在蚕的ABC转运子进行了全基因组分析。图1为ABC转运蛋白的结构图。[8]图1. ABC转运子的组织结构由于灰飞虱对杀虫剂的抗性受多种因子影响，因而其抗性机制较为复杂，对其抗性的研究具有重大深远的意义。该研究以本实验室灰飞虱转录组数据库为基础，利用生物信息学技术，搜索预测ATP结合盒蛋白基因的EST序列，应用PCR、琼脂糖凝胶电泳等技术，通过测序比对来分析鉴定灰飞虱ATP结合盒转运蛋白B家族的ABCB7基因序列，并进一步对其进行全长克隆。通过这些研究，可望为进一步分析ABC转运蛋白在灰飞虱抗药性中的重要性奠定工作基础。1 材料与方法1．1 试验材料1．1．1 供试昆虫 试验所需初始虫源由大学植物保护学院昆虫生理与生化实验室提供，虫种手为2010年10月采自江苏建湖水稻田的灰飞虱若虫，并在室内长期连续饲养获得。1．1．2 试虫饲养采用水稻幼苗法进行室内人工饲养。饲养条件为温度25±1°C，光暗期时间比为16h8h水稻幼苗采用无土栽培法选用粳稻种子，进行充分的泡种和催芽，然后将催好芽的种子均铺在塑料盒中的海绵上，盖上棉纱布，用橡皮筋扎紧置于养虫架上，光照、温度同灰飞虱饲养条件。48h左右增加水量（以充分湿润海绵为宜，禁止过量），待水稻芽大于3cm时即可接种灰飞虱若虫或供成虫产卵用。此法培育的水稻苗最佳使用周期是2个周，以水稻叶片失绿变黄为标志，需要及时更换新鲜稻苗。1．1．3 主要试剂 TRIzol总RNA提取试剂盒，美国Invitrogen 公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTP 、Marker、M-MLV为宝生物工程（大连）有限公司（ TakaRa）产品； PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；1.5mlPCR管，美国AXYGEN公司；其它常规试剂为国产 AR级或进口分装 AR级产品，购自南京基天生物技术有限公司和南京生兴生物技术有限公司。1．1．4 主要仪器 PCR扩增仪为Takara公司； 高压灭菌锅SS-325，日本TOMY公司；超纯水器E1IX10，美国millipore公司；凝胶成像系统Gel Doc2000，美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机Biofoge stratos，德国Heraeus公司；离心机Centrifuge 5424，德国Eppendorf公司；烘箱MC000712，美国MMM公司；制冰机SIM-F124，日本SANYO公司；超低温冰箱906，美国FORMA公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；恒温水浴锅，宁波江南仪器公司；小型水平电泳槽，北京六一仪器；1．2 试验方法1.2.1 总RNA的提取 用TRIzol试剂提取总RNA（1）将 25～30 mg左右灰飞虱组织放入匀浆器内，加 1 ml Trizol 试剂匀浆，转入 1.5ml的eppendorf 管中；（2）2~8 ℃，12，000 g离心15 min后，将上清液转入另一个新的1.5ml eppendorf管中；（3）上清液在 15~30 ℃下温育 5 min后，然后以每 1 ml Trizol试剂加入 0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用力摇匀，15~30 ℃下温育2~3min；（4）2~8 ℃条件下，12，000 g离心20 min。混合物分层，上层为无色的水相（RNA在水相中）；（5）用枪头将上层水相转移到另一个洁净的eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇沉淀RNA，15~30 ℃下温育10 min；2~8 ℃条件下，12，000 g离心10 min；（6）弃上清，用1ml75%乙醇洗一次，涡旋振荡样品，2~8 ℃条件下，7，500 g离心5 min；（7）小心弃去上清液，然后空气或真空干燥 5~10 min，加 30μl无RNA酶的（RNase-free）水，用枪头吸几次后，于60 ℃下温育10 min，溶解RNA，-70 ℃贮存备用。1.2.2 总RNA质量检测 利用琼脂糖电泳监测总RNA质量的完整性将制胶器、梳子、电泳槽和其他器具在双氧水中浸泡30min以上，取出后用DEPC处理水冲洗干净，晾干备用；将制胶器，梳子以及托盘组装好，配制浓度为1.5%的琼脂糖凝胶，待凝胶冷却后，用处理过的RNAse free的器具进行上样操作，110V，电泳时间为20min，在凝胶成像系统中检测电泳条带；利用eppendorf AQ-07核酸蛋白定量仪对RNA的浓度以及吸光度值进行检测，看总RNA的浓度以及其他指标是否达到要求；1.2.3 cDNA第一链的合成 cDNA第一链的合成采用Ivitrogen MLV Reverse trascriptase进行，详细步骤见试剂盒说明书，简要步骤如下 在0.2mlRNAse-free的微量离心管中配制下列成分总RNA 1μg，OligdT（18）2μL，ddH2O添加至7μL将上述（1）混合液轻轻混匀，65°C孵育5min，取出并加入 4μL 5*first strand buffer 2μL DDT 1μL RNase inhibitor37°C孵育2min，取出，加入1μLMLV-Reverse transcriptase；以下步骤在PCR扩增仪中进行37°C，50min；0°C，15min，结束反应后使用持家基因阳性验证成功所得的cDNA模板原液及用ddH2O稀释5倍后的使用液置于-20°C存放至用于PCR扩增。1.2.4 第一条RACE模板合成 5′RACE和3′RACE模板的合成参考照BD公司ClontechTMSMARTer试剂盒说明书，简要步骤如下准备足够的Buffer Mix，每10μL体系加入 5*First-strand Buffer 2μL DDT（20mM） 1μL dNTP Mix（10mM） 1μL 总体积 4μL 混合均匀，离心，在室温下放置；在离心管中混合以下试剂（Mix1） For5′RACE For3′RACE TotalRNA 1.00μg TotalRNA 1.00μg 5′-CDS Primer A 1.00μL 3′-CDS Primer 1.00μL DEPC水 加至3.75μL DEPC水 加至4.75μL混合均匀，简短离心，72°C3min，42°C2min，14,000g，离心10sec；做5′RACEcDNA模板时，加入1μLSMARter ⅡA oligo，充分混合，离心，准备以下的Marster Mix 第一步中的Buffer Mix 4.00μL RNase Inhibitor（40U/μL） 0.25μL SMART Scripe RTase（100U） 1.00μL 总体积 5.25μL将5.25μL的Marster Mix加入变性的RNA（3′或5′）Mix1中，总体积10μL，温和吸打混匀，简短离心，42°C气浴90min，70°C，10min终止反应；用Tricine-EDTA Buffer 稀释（加入35μL），验证后放入-20°C冰箱保存，每次PCR时使用0.5μL/25μL体系。1.2.5 引物设计采用primer premier 5.0软件，利用验证测序出来的序列设计灰飞虱ABCB7的RACE引物:5’GSP: GCACAAGAATCTCATCAGCGTCCATC 5’NGSP: CCATCACTGCCGCATTATACACTTCC3’GSP: CTGGAGAACGGCAAACTTCGGGAGA 3’NGSP: CTGGAGAACGGCAAACTTCGGGAGA1.2.6 RACE-PCR反应体系及条件反应体系 10*LA Buffer 2.50μL Mg2+（25mol/L） 2.00μL dNTP Mixture(2.5mmol/L/each) 2.00μL UPM(Universal Primer A Mix) 3.00μL GSP(10mmol/L) (Gene-specific primer) 1.00μL RACE cDNA模板（10*稀释） 1.00μL LA Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25μL ddH2O 13.75μL 总体积 25.00μLRACE巢式PCR反应体系如RACE PCR反应体系，其中UPM为nupm，GSP为ngsp，模板为RACE PCR反应产物10倍或100倍稀释（第一轮反应有带时稀释100倍，无带则稀释10倍）。反应条件第一轮PCR反应条件为94 ℃-30sec, 72 ℃-3min, 5个循环；94 ℃-30sec，72 ℃-3min，5个循环； 94 ℃-30sec，68 ℃-30sec，72℃-3min，25个循环；72 ℃延伸10min，12℃保存。取20μL电泳，视第一轮PCR产物的电泳结果，若有将其稀释10-100倍做为模板进行第二轮巢式PCR。第二轮PCR反应条件为94℃预变性，94 ℃-30sec，68 ℃-30sec，72 ℃-3min，25个循环；72 ℃延伸10min，12℃保存。1.2.7 PCR产物的回收、纯化、连接、转化和测序 将得到的PCR产物电泳跑胶，若得到单一的没有单引物扩增的特意条带，视为目标带，切胶回收至测序。1.2.7.1 PCR产物的回收纯化步骤如下PCR产物经琼脂糖电泳分离后确定产物大小即可进行凝胶纯化回收，回收采用Axygen DNA Gel Extraction Kit进行，参考试剂盒说明书，简要操作步骤如下从电泳板上切割下含目的DNA片段的凝胶块，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎后放入1.5mlEP管；称重（提前记录1.5mlEP管重）后并将其放入其中，将其适当切小，加速溶解。每100mg凝胶加入300μL Buffer DE-A；凝胶溶解70℃，保温5-10min，每2min混匀一下，至凝胶溶解，胶完全融化后加入0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B（1mg=1μL的体积），混匀（当目标DNA片段小于400bp时，需加入一个凝胶体积的异丙醇）；Miniprep column 柱装入2ml洗管，将上述混合液转移至Miniprep column柱，室温放置2min。室温离心1min；取下Miniprep column柱，倒掉收集管中的废液，将Miniprep column柱放入同一收集管中，加入500mlBufferW1，室温12,000g离心1min；取下Miniprep column柱，倒掉收集管中的废液，将Miniprep column柱放入同一收集管中，加入700mlBufferW2，室温12,000g离心1min；重复步骤6一次；取下Miniprep column柱，倒掉收集管中废液，将Miniprep column柱放入同一收集管中，室温12,000g离心2min；将Miniprep column柱放入新的1.5ml离心管中，在Miniprep column柱子膜中央加30μLddH2O（ddH2O加热到60℃能提高洗脱效率），不加盖室温放置2min；盖上离心管，室温12,000g离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段，4℃保存备用。1.2.7.2 质粒载体的连接反应连接反应采用Promega公司的PGEM-Teasy连接载体进行，参照说明书，按下列反应体系配制混合液 2*Rapid ligation buffer 5.0μL pGEM T-easy vector 0.5μL Target DNA（>5ng） 3.0μL T4DNA ligase （3U/μL） 0.5μL Sterile deionizedH2O 1.0μL Final volume 10μL1000rpm转速1min短暂离心后将反应液置于4℃冰箱过夜（>12h）以达到最佳连接效率。1.2.7.3 转化反应和细菌培养转化反应步骤如下从-70℃冰箱中取出300mL感受态细胞悬液DH5α，冰上化冻；加入T-easy质粒连接反应液（含量不超过50ng，体积不超过10ml），轻轻摇匀，冰上放置30min；42℃水浴热激90sec，热激后迅速放置于冰上冷却2min；向管中加入1mlLB液体培养基（不含Amp抗生素），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；将上述菌液摇匀后取150ml涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养及吸收后，37℃倒置培养，10-16h间观察直至长成为连成片的大小均匀的蓝白菌落。培养平板可置4℃短暂保存。1.2.7.4 单克隆的挑取和菌株扩大培养（1）取灭菌处理过的干净螺口刻度试管，加入4ml的含Amp抗生素的LB液体培养基；（2）用高温灭菌处理过的牙签挑取单克隆的白斑，置于刻度试管中，盖上盖，不能旋紧以备氧气稍许流通；（3）刻度试管于37℃摇床中250转/分振荡培养，12至16h后取出提取质粒。1.2.7.5 质粒的提取和酶切检测质粒提取采用Omega公司的质粒小提试剂盒，提取转化菌株中的质粒的操作步骤如下取1.5mL的细菌发酵液置于1.5mL的灭菌离心管中，10,000g，离心1min。去除上清，在离心沉淀中加入250μL的SolutionⅠ（加入前确保已加入了RnaseA），涡旋，或使用移液枪吸打沉淀，使沉淀充分混匀；再加入250μL的SolutionⅡ，将离心管中轻轻上下颠倒4-6次，得到澄清的混合物，之后在室温下孵育2min至5min（此步不能剧烈震荡）；再加入350μL的SolutionⅢ，离心管轻轻颠倒数次，充分混匀，最后管中出现白色絮状沉淀，16,000g，离心10min；小心地将上清液从管中吸出，收集在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中，将HiBind Miniprep Column（Ⅰ）安置在试剂盒中提供的2ml collection tube上，10,000g，离心1min；倒去离心滤液，再在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中加入500μL的Buffer HB，10,000g，离心1min；倒去离心滤液，再在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中加入700μL的DNA Wash Buffer，10,000g，离心1min（DNA Wash Buffer在使用前必须确保加入了指定量的无水乙醇）；重复步骤（8）一次；13,000g，空柱离心2min，使柱子干燥；HiBind Miniprep Column（Ⅰ）安置到一个干净的1.5ml离心管上，在HiBind Miniprep Column（Ⅰ）中加入30-50μL的灭菌去离子水或Elution Buffer，室温放置2至3min后14,000g离心1min，收集管中的液体为所获得质粒，-20℃冰箱保存。利用pGEM T-easy载体中外源片段插入点的两端各含一个EcoR Ⅰ酶切位点的特性，用EcoR Ⅰ酶对提取质粒进行酶切，以检测载体质粒是否插入了外源目标片段。EcoRⅠ酶切体系如下10*H Buffer 2μLPlasmid DNA 7μLEcoRⅠ 1μLSterile deionized H2O 10μLFinal volume 20μL酶切产物在37℃水浴中保温2h左右，之后取10μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。若观察有两条核氨酸条带，上面一条为载体，下面一条为目标条带，大小为所克隆片段的大小，则证明克隆的为阳性菌液。1.2.7.6 测序分析 经质粒酶切检测后的细菌发酵液，取适量送至上海Invitrogen公司进行测序，使用的仪器为ABI3730测序仪。测序引物为M13或T7或SP6。测序结果序列分析通过GeneDoc、ClustalW（2.0）等软件完成，通过BLAST与GenBank中的序列进行同源性比对，同时利用GeneDoc软件进行序列同源性比较分析。1.2.8 End-End验证将5′RACE片段、3′RACE片段和验证的片段拼接而来的全长序列，预测出CDS区域，在5′UTR和3′UTR区各设计上下游引物，为End-End引物（见表1）。用合成的3′RACE模板为模板，PCR验证End-End的RACE全长。PCR体系如下 10*LA Buffer 2.50μL Mg2+（25mol/L） 2.00μL dNTP Mixture(2.5mmol/L/each) 2.00μL Primer1 1.00μL Primer2 1.00μL RACE cDNA模板（10*稀释） 1.00μL LA Taq DNA聚合酶（5U/μL） 0.25μL ddH2O 15.25μLTotal volume 25.00μL PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30sec，退火温度Tm上退火1min，72℃延伸2min（按预测片段长短控制时间，LA-Taq酶为1min=800bp）；退火温度由Tm值的温度降至（Tm-5）℃，每一个循环下降0.5℃；然后在（Tm-5）℃下循环30次，最后72℃延伸10min便于加A尾；12℃保持，取出后4℃冰箱保存。PCR产物接着用1.5%琼脂电泳检测，步骤参见1.2.7.1-1.2.7.6，回收、连接、转化、测序和序列分析。表1 灰飞虱ABCB7基因End-End PCR引物End to End 上游引物Lao-F GTTCGTGAGTTGCCGTATEnd to End 下游引物Lao-R TACATCTCATAACCCACGC2 结果与分析2．1 灰飞虱ABCB7基因的克隆及序列测定由灰飞虱转录组搜索获得一ABC基因片段，PCR验证后依据该序列设计引物，通过RACE技术获得末端序列后，拼接成了一个含有开放阅读框为2265bp，共编码754个氨基酸的全长序列。使用Lao-F /Lao-R 为引物进行End to End PCR-扩增，产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，在2.4kb 左右出现1 条特异条带，与预期的片段大小相符( 图1) 。用凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后与T3-easy载体连接，通过蓝白斑筛选出阳性克隆，并进行菌液PCR 验证，对鉴定正确的阳性克隆进行测序，将测序得到的片段与RACE克隆获得的基因序列进行比较，结果表明两者几乎完全一致，由此克隆得到ABCB7基因完整的ORF序列。 M l图1 灰飞虱Abcb7基因的end to end扩增产物的电泳图谱M．Takara DL 5000 MarkerFig.1 end to end pcr 产物ProtParam预测蛋白分子质量为83.78kD，等电点为9.32，总正电荷残基(Arg + Lys) 93个，负电荷残基(Asp + Glu) 74个。N端预测无氨基酸信号肽。用SMART 程序和TMHMM预测结果表明与已知其他物种的Abcb7蛋白存在差异，该蛋白具有一个核苷酸结合结构域和 一个由4个α螺旋构成的跨膜结构域，而其他已知昆虫大多数具有一个核苷酸结合结构域和一个由6个α螺旋构成的跨膜结构域，但是多数哺乳动物则具有一个由5个α螺旋构成的跨膜结构域。如图2，经过保守结构域搜索分析 ABCB7具有ABC 转运蛋白保守区域WalkerA 、WalkerB、Signature C 和Q-loop，证实该基因属于ATP结合盒转运蛋白超家族。图2 灰飞虱Abcb7蛋白保守结构域Fig.2 Proteins conserved structure of LasAbcb7 gene2.2 ABCB7基因的序列同源性分析 通过Blastp ( http: ∥blast.ncbi.nlm.Nih.gov /Blast.cgi) 程序进行在线蛋白质序列比对，结果表明ABCB7基因与蜜蜂(Apis mellifera) 、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae) 、赤拟谷盗( Tribolium castaneum)、果蝇( Drosophila melanogaster)、家蚕（Bombyx B.mori）、丽蝇蛹集金小蜂( Nasonia vitripennis)、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、埃及伊蚊（Aedes A.aegypti）中相应的ABC转运蛋白序列的相似性较高，分别为85%、87%、86%、81%、83%、84% 、84%、83%、和86%，由此可以看出BmAbcb6 与其它昆虫的ABC 转运蛋白序列相似性较高，其序列相当保守(图3)。用ABCB7基因编码的氨基酸序列与人、蜜蜂、冈比亚按蚊、埃及伊蚊、丽蝇蛹集金小蜂、赤拟谷盗、致倦库蚊、果蝇、豌豆蚜( Acyrthosiphon pisum) 、非洲爪蟾( Xenopus tropicalis) 、小鼠( Mus musculus) 、大鼠( Rattus norvegicus ) 、线虫( Caenorhabditis elegans ) 、牛( Bos taurus) 、青鱂鱼( Oryzias latipes) 中可能的ABCB亚族成员进行聚类分析，结果发现ABCB7与蜜蜂、埃及伊蚊、赤拟谷盗、致倦库蚊、冈比亚按蚊、丽蝇蛹集金小蜂、果蝇和豌豆蚜的可能的ABCB 亚族成员聚在一起，亲缘关系较近，而与哺乳动物的ABCB 亚族成员亲缘关系相对较远(图4)。丽蝇蛹集金小蜂N.vitripennis (gi?:345480022);蜜蜂A.mellifera (gi:110765304)?;赤拟古盗T.castaneum(gi?:189238013)?;埃及伊蚊A.aegypti(gi?:157114115)?;果蝇D.melanogaster(gi?:45551501)?;家蚕B.mori(gi?:512905319)黑色阴影表示完全保守氨基酸，灰色阴影表示强保守性氨基酸。The black shadow represents full conserved amino acids,and the grey shadow represents strong conserved amino acids.图3 灰飞虱与其他昆虫ABCB亚族成员同源蛋白的氨基酸保守序列比较Fig.3 A comparison on conserved amino acids of homologous protein sequences from ABCB subfamily members in Laodelphax striatellus and other insect species图4 灰飞虱ABCB7蛋白与其他物种同源蛋白序列的系统发生树Figure.4 Phylogenetic tree of ABCB7 with its homologous proteins from other insect species 3 讨论 本研究以本实验室灰飞虱转录组数据库为基础，利用生物信息学技术，成功克隆了灰飞虱ABCB7基因。和哺乳动物不一样的是，ABCB7具有1 个核苷酸结合结构域和4个α 螺旋构成的跨膜结构域。系统发育分析表明，ABCB7基因与蜜蜂、埃及伊蚊、赤拟谷盗、致倦库蚊、冈比亚按蚊、丽蝇蛹集金小蜂、果蝇和豌豆蚜中可能的ABCB 亚族成员聚在一簇，亲缘关系相对较近，而与哺乳动物的ABCB 亚族成员亲缘关系相对较远。 ABC 蛋白家族的成员数目众多, 广泛存在于植物和动物界, 是进行基因功能进化研究的重要对象。此外, ABC 转运蛋白参与多种有毒物质的吸收、积累和排泄, 并在机体组织防御过程中起重要作用。ABCB亚家族仅存在于脊椎动物中。目前国内外关于灰飞虱ABCB7基因的功能没有找到相关报道。由于ABC转运蛋白超家族群体的庞大和功能的复杂, 许多问题尚待进一步深入研究。ABCB7基因是否是与灰飞虱抗性有关的基因仍需要进一步对其进行组织表达鉴定等一系列后续研究。致谢参考文献[1] 施慎年，左端荣，陈月昌. 灰飞虱对农业生产的危害及其防治策略[J]. 现代农业科技，2009，（6）118-119.[2] 洪晓月，丁锦华.农业昆虫学［M］.2版.北京中国农业出版社，2006:98-101.[3] 韩正光，陈新红,朱祥林,等.灰飞虱发生特点及防控对策［J］．北方水稻，2012，（6）50-52.[4] 孙宏迪，曹晓梅，杨振洲. 特异性等位基因PCR 技术在昆虫抗药性研究中的应用［J］．中华卫生杀虫药械，2011，17（2）141-143.[5] 王华丙，张振义，包锐． ABC 转运蛋白的结构与转运机制［J］． 生命的化学， 2007，27( 3) : 208 -210.[6] 栗凤鹏，吴金美. 家蚕三磷酸腺苷结合盒转运子B亚族基因Abcb6的克隆与序列分析及组织表达［J］.蚕业科学，2011,37（4）0614-0622.[7] 吴转斌，吴金美．ABC 转运子G 亚族与人类疾病［J］．江苏大学学报: 医学版， 2008， 18( 3) : 861-866.[8]Kenneth J.Linton.Structure and Function of ABC Transporters［J］．PHYSIOLOGY,2007,22:122-129.[9] Lynch J，Fukuda Y，Krishnamurthy P，et al．Cell survival under stress is enhanced by a mitochondrial ATP-binding cassette transporter that regulates hemoproteins［J］． Cancer Res，2009，69( 13) :5560-5567[10]Dean M，Annilo T． Evolution of the ATP-binding cassette ( ABC)transporter superfamily in vertebrates［J］．Annu Rev Genomics Hum Genet，2005，6: 123 -142
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法...............................................................2
1．1 试验材料 3
1．1．1 供试昆虫及饲养条件 3
1．1．2 主要试剂 3
1．1．3 主要仪器 3
1．2 试验方法 3
1．2．1 总RNA提取 3
1．2．2 总RNA质量检测 4
1．2．3 cDNA第一条链的合成............................................... 4
1．2．4 第一条RACE模板合成 4
1．2．5 引物设计..........................................................5
1．2．6 RACEPCR反应体系及条件.......................................... 5
1． 2． 7 PCR产物的回收、纯化、连接、转化和测序..............................6
1．2．8 EndEnd验证..................................................... .8
2 结果与分析 5
2．1 灰飞虱ABCB7基因的克隆及序列测定
5
2．2 ABCB7基因的序列同源性分析 5
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
灰飞虱ATP结合盒转运蛋白ABCB7基因的克隆与序列分析
引言
引言
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