水稻品种rp5791360抗褐飞虱基因定位
褐飞虱(Nilaparvata lugens St?l)是水稻单食性害虫，不仅能够直接刺吸危害造成“虱烧”，还可以传播水稻病毒病草状丛矮病(Grass Stunt)和齿叶矮缩病(Ragged Stunt)。近年来，其发生呈上升趋势，危害面积不断扩大、爆发频率增加、危害程度也逐年增强。利用品种抗性是防治此类害虫最为经济有效的策略。本研究利用抗褐飞虱水稻品种RP579-1360与感虫品种02428构建F2遗传分析群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2: 3家系。对其中的114个F2:3家系进行褐飞虱抗性鉴定，并利用均匀覆盖水稻12条染色体的SSR及InDel标记构建了该群体的连锁图谱，进行抗褐飞虱基因的定位，结果在水稻第四染色体短臂两InDel标记P58与W90之间，检测到一个LOD值为4.27，贡献率为18.8%的抗褐飞虱位点。上述抗性位点的发掘为水稻抗褐飞虱基因的克隆及育种利用奠定了基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 6
1.1 植物材料和褐飞虱虫源 6
1.2 水稻抗褐飞虱表型的鉴定 6
1.3 植物总DNA 的提取 7
1.4 Indel引物的设计 7
1.5 PCR反应 8
1.6 PCR产物的检测 8
1.7 数据分析 8
2 结果与分析 8
2.1 亲本苗期抗虫性测定 8
2.2 RP5791360/02428 F2群体抗褐飞虱基因定位 8
2.3 RP5791360/02428 F2:3家系褐飞虱群体的QTL分析 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11
附录1 13
附录2 13
附表1 13
水稻品种RP5791360抗褐飞虱基因定位
引言
引言
水稻是世界上重要的粮食作物，世界上近一半人口，包括几乎整个东 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
亚和东南亚的人口，都以稻米为食。但是，水稻也是很多昆虫的寄主，全球每年水稻产量损失的21%是由虫害引起的。在当前100多种水稻害虫中，褐飞虱是对水稻危害最为严重的害虫之一，同时其传播的病毒病也严重威胁着水稻的高产和稳产。
褐飞虱，Brown planthopper（Nilaparvata lugens St?l），简称BPH，属于同翅目飞虱科害虫，又名褐飞虱，是稻飞虱的一种，是一种单食性水稻害虫，只能为害栽培稻和普通野生稻而不能为害其他作物。褐飞虱具有喜温、抗寒能力弱、生长周期短、远距离迁飞、暴发性和猖獗性等特征，是水稻生产区最具有毁灭性的害虫。
褐飞虱是典型的刺吸式害虫。褐飞虱借助其口刺如茎基部叶鞘组织，以取食韧皮部和木质部汁液为主。成虫和若虫主要集中在水稻基部，消耗稻株养分，且褐飞虱取食时形成的口针鞘破坏植物输导组织，光合产物运输受阻，谷粒不饱满，严重影响水稻产量（图11）。当虫量较多、危害严重时可导致稻株基部发黑、腐烂、倒瘫死亡，俗称“虱烧”。其次，褐飞虱雌虫产卵形成大量伤口，导致水分和养分由伤口向外散失，同时还造成植株茎基部极易腐烂，加速稻株倒瘫。再次，褐飞虱取食或产卵时造成的伤口也有利于小球菌核病、纹枯病的侵染；取食为害时排泄的“蜜露”，富含各种糖类、氨基酸，覆盖在稻株上易导致煤烟病菌的孳生[1]。此外，作为水稻病毒病（草状丛矮病和齿叶矮缩病）的虫媒，带毒褐飞虱可诱发水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病的产生，间接影响水稻生长发育。
图11 褐飞虱取食行为
Figure 11 Feeding behaviour of brown planthopper
1966年以来，褐飞虱在我们国家已经多次爆发，其中1966、1969、1973、1977、1983及2003年是全国性大发生；1987、1991、2005及2006年是全国性特大发生；1957、1958、1974、1975、1982、1983、1985及1997年在长江流域大发生。褐飞虱大爆发对我国水稻生产造成极大危害。近年来稻褐飞虱在我国南方流行严重，特别是2005～2007年，稻褐飞虱危害面积达4亿～5亿亩。2005年我国由于褐飞虱取食直接损失稻谷270万吨，仅华东4省就损失稻谷25亿元[2]。目前，防治褐飞虱的主要方式仍然是化学药剂防治，残留在水稻和土壤中的杀虫剂对人畜均有危害，杀虫剂在杀灭褐飞虱的同时也杀灭了稻田中的其他生物，严重破坏了稻田生态系统；另外，近年来褐飞虱的抗药性也显著增强，一系列问题的出现使得褐飞虱防治任务显得愈加艰难。因此，选育抗褐飞虱的水稻品种成为最经济环保同时也是最根本的防治褐飞虱方法。
图12 褐飞虱大发生时造成的典型田间危害
Figure 12 Field damage scene caused by BPH outbreak
自20世纪70年代褐飞虱开始暴发以来，世界各国研究者开始致力于水稻抗褐飞虱基因的发掘和利用。目前，根据不同抗褐飞虱基因对不同褐飞虱生物型的抗性反应，在栽培稻和野生稻中至少已经鉴定抗褐飞虱基因34个，其中12个为隐性基因，包括bph2、bph4、bph5、bph7、bph8、bph11、bph12、bph18、bph19、bph22、bph23和bph24。其余22个均为显性基因。所有这些基因分别对不同的褐飞虱生物型表现抗性（见表13）。
从目前已经鉴定的水稻抗褐飞虱基因中可以看出，研究者已经将越来越多的精力放在野生稻抗褐飞虱基因的发掘和利用。这是因为野生稻长期处于恶劣的野生状态下，具有丰富的遗传多样性，使其形成了比栽培品种更强的抗病虫能力，能够经受多种病虫害的侵袭。因此，野生稻越来越受到研究者的关注，成为寻找和发掘褐飞虱新抗源、发现新抗褐飞虱基因的主要途径。
Athwal等在来源于印度的Mudgo、CO22和MUT15三个品种中首次鉴定出水稻抗褐飞虱基因，命名为Bph1[3]。他们同时在ASD7中鉴定出一个隐性抗褐飞虱基因命名为bph2，并认为二者之间存在等位或者紧密连锁的关系。Ikeda和Kaneda最初利用三体定位法将Bph1和bph2定位在第4染色体上[4]，但是Hirabayashi等则利用RFLP标记将来源于TKM6的Bph1定位在第12染色体上，与标记XNpb248的遗传距离为10.7 cM[5]；Tooyama等将来源于Mudgo的Bph1基因同样定位在第12染色体上[6]；Huang等利用IR64/Azucena的DH群体将Bph1定位在第12染色体标记RG463和Sdh1之间[7]；Jeon等则将Gayabyeo的Bph1定位在RG634和RG457之间，与之分别相距2.9 cM[8]；Sharma等将Bph1定位于12染色体AFLP标记Em5814N和BpE183之间，与之分别相距2.7 cM和3.9 cM[9]；Kim和Sohn将Bph1同样定位于12染色体，与STS标记BpE183相距3.9 cM[10]。Murata等通过研究也证实Bph1和bph2存在等位或紧密连锁关系，并且利用Tsukushibare/PL4和Tsukushibare/PL7两套F2群体，将bph2基因定位在第12染色体长臂上，与标记G2140相距3.5 cM[11]；Murai等通过进一步定位将bph2定位于第12染色体两标记KAM3和KAM5之间约1.0 cM的区间内，与KAM4表现共分离[12]；而Sun则利用ASD7/C418的F2群体将bph2定位在第12染色体长臂SSR标记RM7102和RM463之间，与之分别相距7.6 cM和7.2 cM，并且认为bph2是一个显性基因[13]。Lakshminarayana和Khush首先在斯里兰卡品种Rathu Heenati中发现一个独立于Bph1的显性抗褐飞虱基因，命名为Bph3，并且在Babawee中鉴定出不同于bph2的隐性基因bph4[14]；Sidhu和Khush认为Bph3和bph4是紧密连锁的关系，但由于材料和鉴定方法的不同，不同学者对此尚存在争议[15]。最初Ikeda和Kaneda通过三体分析认为Bph3和bph4位于第10染色体上[16]；黄朝锋等采用分子标记技术和特异定位微卫星分析法（PSM）将Bph3定位在第4染色体上[17]；Jairin等利用Rathu Heenati/KDML105的BC3F2群体和PTB33/RD6的BC1F2群体将其定位于第6染色体SSR标记RM589和RM588之间，与两标记分别相距0.9 cM和1.4 cM[18]；Kawaguchi等将bph4定位于第6染色体短臂C76A附近[19]；Jairin等通过构建TN1/Babawee和Babawee/KDML105的F2群体，将bph4进一步定位于RM589和RM586之间，两套群体分别能够解释表型变异的58.8%和70.1%[20]，并根据前人的研究结果，进一步确认了Bph3和bph4的紧密连锁关系。Khush等在对ARC10550进行抗褐飞虱分析时发现，其对生物型1、2和3均表现为感虫，而对生物型4表现为抗虫[21]。这与以前报道的抗褐飞虱基因有所不同，于是认为它是一个新的抗褐飞虱基因，命名为bph5。与此类似，Kabis和Khush用生物型4褐飞虱分析了17份材料的抗性表现，由此在品种Swamalata中发现了显性抗褐飞虱基因Bph6，在品种T12中发现了隐性抗褐飞虱基因bph7[22]；Qiu等则利用Swarnalata/9311的F2群体将Bph6精细定位于第4染色体长臂STS标记Y19和Y9之间，区间距离25 kb[23]；而对于bph7的进一步精细定位至今尚未报道。Ikeda在泰国品种Col.5、Col.11及缅甸品种Chin saba中发现一个不同于bph2和bph4的新隐性基因，同时在Balamawee、Kaharamana和Pokkali三个品种中发现了不同于Bph1和Bph3的新显性基因[24]。之后Nemoto等通过等位性测验，将Col.5、Col.11和Chin saba中的抗褐飞虱基因命名为bph8，将Balamawee、Kaharamana和Pokkali中的抗褐飞虱基因命名为Bph9[25]。Sun等利用Col.5/02428F2群体检测到三个抗褐飞虱位点均来自抗虫亲本Col.5，其中位于第六染色体标记RM510和RM314之间的QTL，LOD值为18.3，贡献率为46.2%，与以往研究结果比较，推测该位点就是隐性抗褐飞虱基因bph8[13]。Murata等利用Pokkali/NorinPL9的F3群体，首次将Bph9定位在第12染色体标记S2545和G2140之间[26]；苏昌潮等利用Kaharamana/02428的F2分离群体进行连锁，将Bph9连锁到第12染色体两个SSR标记RM463和RM5341之间，与之分别相距6.8 cM和9.7 cM[27]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 6
1.1 植物材料和褐飞虱虫源 6
1.2 水稻抗褐飞虱表型的鉴定 6
1.3 植物总DNA 的提取 7
1.4 Indel引物的设计 7
1.5 PCR反应 8
1.6 PCR产物的检测 8
1.7 数据分析 8
2 结果与分析 8
2.1 亲本苗期抗虫性测定 8
2.2 RP5791360/02428 F2群体抗褐飞虱基因定位 8
2.3 RP5791360/02428 F2:3家系褐飞虱群体的QTL分析 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11
附录1 13
附录2 13
附表1 13
水稻品种RP5791360抗褐飞虱基因定位
引言
引言
水稻是世界上重要的粮食作物，世界上近一半人口，包括几乎整个东 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
亚和东南亚的人口，都以稻米为食。但是，水稻也是很多昆虫的寄主，全球每年水稻产量损失的21%是由虫害引起的。在当前100多种水稻害虫中，褐飞虱是对水稻危害最为严重的害虫之一，同时其传播的病毒病也严重威胁着水稻的高产和稳产。
褐飞虱，Brown planthopper（Nilaparvata lugens St?l），简称BPH，属于同翅目飞虱科害虫，又名褐飞虱，是稻飞虱的一种，是一种单食性水稻害虫，只能为害栽培稻和普通野生稻而不能为害其他作物。褐飞虱具有喜温、抗寒能力弱、生长周期短、远距离迁飞、暴发性和猖獗性等特征，是水稻生产区最具有毁灭性的害虫。
褐飞虱是典型的刺吸式害虫。褐飞虱借助其口刺如茎基部叶鞘组织，以取食韧皮部和木质部汁液为主。成虫和若虫主要集中在水稻基部，消耗稻株养分，且褐飞虱取食时形成的口针鞘破坏植物输导组织，光合产物运输受阻，谷粒不饱满，严重影响水稻产量（图11）。当虫量较多、危害严重时可导致稻株基部发黑、腐烂、倒瘫死亡，俗称“虱烧”。其次，褐飞虱雌虫产卵形成大量伤口，导致水分和养分由伤口向外散失，同时还造成植株茎基部极易腐烂，加速稻株倒瘫。再次，褐飞虱取食或产卵时造成的伤口也有利于小球菌核病、纹枯病的侵染；取食为害时排泄的“蜜露”，富含各种糖类、氨基酸，覆盖在稻株上易导致煤烟病菌的孳生[1]。此外，作为水稻病毒病（草状丛矮病和齿叶矮缩病）的虫媒，带毒褐飞虱可诱发水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病的产生，间接影响水稻生长发育。
图11 褐飞虱取食行为
Figure 11 Feeding behaviour of brown planthopper
1966年以来，褐飞虱在我们国家已经多次爆发，其中1966、1969、1973、1977、1983及2003年是全国性大发生；1987、1991、2005及2006年是全国性特大发生；1957、1958、1974、1975、1982、1983、1985及1997年在长江流域大发生。褐飞虱大爆发对我国水稻生产造成极大危害。近年来稻褐飞虱在我国南方流行严重，特别是2005～2007年，稻褐飞虱危害面积达4亿～5亿亩。2005年我国由于褐飞虱取食直接损失稻谷270万吨，仅华东4省就损失稻谷25亿元[2]。目前，防治褐飞虱的主要方式仍然是化学药剂防治，残留在水稻和土壤中的杀虫剂对人畜均有危害，杀虫剂在杀灭褐飞虱的同时也杀灭了稻田中的其他生物，严重破坏了稻田生态系统；另外，近年来褐飞虱的抗药性也显著增强，一系列问题的出现使得褐飞虱防治任务显得愈加艰难。因此，选育抗褐飞虱的水稻品种成为最经济环保同时也是最根本的防治褐飞虱方法。
图12 褐飞虱大发生时造成的典型田间危害
Figure 12 Field damage scene caused by BPH outbreak
自20世纪70年代褐飞虱开始暴发以来，世界各国研究者开始致力于水稻抗褐飞虱基因的发掘和利用。目前，根据不同抗褐飞虱基因对不同褐飞虱生物型的抗性反应，在栽培稻和野生稻中至少已经鉴定抗褐飞虱基因34个，其中12个为隐性基因，包括bph2、bph4、bph5、bph7、bph8、bph11、bph12、bph18、bph19、bph22、bph23和bph24。其余22个均为显性基因。所有这些基因分别对不同的褐飞虱生物型表现抗性（见表13）。
从目前已经鉴定的水稻抗褐飞虱基因中可以看出，研究者已经将越来越多的精力放在野生稻抗褐飞虱基因的发掘和利用。这是因为野生稻长期处于恶劣的野生状态下，具有丰富的遗传多样性，使其形成了比栽培品种更强的抗病虫能力，能够经受多种病虫害的侵袭。因此，野生稻越来越受到研究者的关注，成为寻找和发掘褐飞虱新抗源、发现新抗褐飞虱基因的主要途径。
Athwal等在来源于印度的Mudgo、CO22和MUT15三个品种中首次鉴定出水稻抗褐飞虱基因，命名为Bph1[3]。他们同时在ASD7中鉴定出一个隐性抗褐飞虱基因命名为bph2，并认为二者之间存在等位或者紧密连锁的关系。Ikeda和Kaneda最初利用三体定位法将Bph1和bph2定位在第4染色体上[4]，但是Hirabayashi等则利用RFLP标记将来源于TKM6的Bph1定位在第12染色体上，与标记XNpb248的遗传距离为10.7 cM[5]；Tooyama等将来源于Mudgo的Bph1基因同样定位在第12染色体上[6]；Huang等利用IR64/Azucena的DH群体将Bph1定位在第12染色体标记RG463和Sdh1之间[7]；Jeon等则将Gayabyeo的Bph1定位在RG634和RG457之间，与之分别相距2.9 cM[8]；Sharma等将Bph1定位于12染色体AFLP标记Em5814N和BpE183之间，与之分别相距2.7 cM和3.9 cM[9]；Kim和Sohn将Bph1同样定位于12染色体，与STS标记BpE183相距3.9 cM[10]。Murata等通过研究也证实Bph1和bph2存在等位或紧密连锁关系，并且利用Tsukushibare/PL4和Tsukushibare/PL7两套F2群体，将bph2基因定位在第12染色体长臂上，与标记G2140相距3.5 cM[11]；Murai等通过进一步定位将bph2定位于第12染色体两标记KAM3和KAM5之间约1.0 cM的区间内，与KAM4表现共分离[12]；而Sun则利用ASD7/C418的F2群体将bph2定位在第12染色体长臂SSR标记RM7102和RM463之间，与之分别相距7.6 cM和7.2 cM，并且认为bph2是一个显性基因[13]。Lakshminarayana和Khush首先在斯里兰卡品种Rathu Heenati中发现一个独立于Bph1的显性抗褐飞虱基因，命名为Bph3，并且在Babawee中鉴定出不同于bph2的隐性基因bph4[14]；Sidhu和Khush认为Bph3和bph4是紧密连锁的关系，但由于材料和鉴定方法的不同，不同学者对此尚存在争议[15]。最初Ikeda和Kaneda通过三体分析认为Bph3和bph4位于第10染色体上[16]；黄朝锋等采用分子标记技术和特异定位微卫星分析法（PSM）将Bph3定位在第4染色体上[17]；Jairin等利用Rathu Heenati/KDML105的BC3F2群体和PTB33/RD6的BC1F2群体将其定位于第6染色体SSR标记RM589和RM588之间，与两标记分别相距0.9 cM和1.4 cM[18]；Kawaguchi等将bph4定位于第6染色体短臂C76A附近[19]；Jairin等通过构建TN1/Babawee和Babawee/KDML105的F2群体，将bph4进一步定位于RM589和RM586之间，两套群体分别能够解释表型变异的58.8%和70.1%[20]，并根据前人的研究结果，进一步确认了Bph3和bph4的紧密连锁关系。Khush等在对ARC10550进行抗褐飞虱分析时发现，其对生物型1、2和3均表现为感虫，而对生物型4表现为抗虫[21]。这与以前报道的抗褐飞虱基因有所不同，于是认为它是一个新的抗褐飞虱基因，命名为bph5。与此类似，Kabis和Khush用生物型4褐飞虱分析了17份材料的抗性表现，由此在品种Swamalata中发现了显性抗褐飞虱基因Bph6，在品种T12中发现了隐性抗褐飞虱基因bph7[22]；Qiu等则利用Swarnalata/9311的F2群体将Bph6精细定位于第4染色体长臂STS标记Y19和Y9之间，区间距离25 kb[23]；而对于bph7的进一步精细定位至今尚未报道。Ikeda在泰国品种Col.5、Col.11及缅甸品种Chin saba中发现一个不同于bph2和bph4的新隐性基因，同时在Balamawee、Kaharamana和Pokkali三个品种中发现了不同于Bph1和Bph3的新显性基因[24]。之后Nemoto等通过等位性测验，将Col.5、Col.11和Chin saba中的抗褐飞虱基因命名为bph8，将Balamawee、Kaharamana和Pokkali中的抗褐飞虱基因命名为Bph9[25]。Sun等利用Col.5/02428F2群体检测到三个抗褐飞虱位点均来自抗虫亲本Col.5，其中位于第六染色体标记RM510和RM314之间的QTL，LOD值为18.3，贡献率为46.2%，与以往研究结果比较，推测该位点就是隐性抗褐飞虱基因bph8[13]。Murata等利用Pokkali/NorinPL9的F3群体，首次将Bph9定位在第12染色体标记S2545和G2140之间[26]；苏昌潮等利用Kaharamana/02428的F2分离群体进行连锁，将Bph9连锁到第12染色体两个SSR标记RM463和RM5341之间，与之分别相距6.8 cM和9.7 cM[27]。
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