水稻osago18蛋白复合体的组成解析
AGO蛋白家族在已知的小RNA沉默通路中发挥关键作用，它是形成沉默复合物（RISC）的重要组成部分。本实验即以OsAGO18为研究对象，构建水稻日本晴cDNA文库，并以OsAGO18为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统筛选其互作蛋白，目前实验筛选出了与OsAGO18存在互作的十多种蛋白。本实验通过研究水稻OsAGO18蛋白复合体的组成以及对其生物学意义的探讨，以期为进一步研究OsAGO18及其互作蛋白在植物抗病中的作用机制奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与仪器2
1.1 实验材料2
1.1.1植物 2
1.1.2 菌株2
1.1.3 载体2
1.1.4 试剂2
1.1.5 培养基2
1.2 实验仪器3
2 实验方法3
2.1 基本实验操作3
2.1.1 酵母质粒提取3
2.1.2 酵母感受态制备4
2.1.3 质粒转化酵母4
2.1.4 大肠杆菌质粒提取4
2.1.5 大肠杆菌感受态制备4
2.1.6 质粒转化大肠杆菌5
2.1.7 DNA的回收5
2.2 BD:OsAGO18融合载体的构建5
2.2.1 OsAGO18的克隆5
2.2.2 OsAGO18与pGBKT7相连6
2.2.3 菌落PCR验证6
2.2.4 BD:OsAGO18在Y2HGold中的毒性及自激活检测6
2.2.5 对照实验7
2.2.6 BD:OsAGO18在Y2HGold表达情况的检测7
2.2.7 转化效率的计算7
2.3 cDNA文库的构建7
2.3.1 提取植物RNA7
2.3.2 ds cDNA的合成8
2.3.3 cDNA文库覆盖率检测9
2.4 利用酵母双杂系统筛选OsAGO18的互作蛋白9
2.4.1 酵母融合筛选9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
2.4.2 验证筛选结果10
2.4.3 提取阳性克隆10
3 结果与分析10
3.1 BD:OsAGO18融合载体构建结果分析10
3.2 cDNA文库构建结果与分析13
3.3 酵母双杂交筛库结果与分析14
4 讨论16
致谢16
参考文献16
水稻OsAGO18蛋白复合体的组成解析
引言
AGO蛋白是一类序列保守的蛋白家族，广泛存在于动植物、真菌、原生动物等生物中[1]。不同AGO蛋白可在不同的生物体内发挥重要的作用[2]，如调节生物体的生长发育、参与调控生物体的生理活动、与小RNA结合参与由小RNA介导的基因沉默，对靶mRNA进行转录后及翻译水平上的调控[35,13]。而水稻是最重要的粮食作物之一，世界上有近一半的人口以水稻为主食。不过，真菌、细菌及病毒的侵染会导致水稻发生病变，从而降低水稻产量。因此，为了寻求提高水稻产量和质量、保证水稻正常生长的途径，已有实验探讨了AGO蛋白在水稻抗病中的作用，并发现AGO蛋白可参与不同的RNA沉默通路从而使植株达到抗病的作用[6,7]。目前，有研究表明OsAGO18可在被病毒诱导的条件下与植物体内的miR168结合并抑制其功能[8]，进而保护了可与miR168结合产生负反馈调节的AGO1，使其与病毒RNA结合产生基因沉默，从而达到抗病毒侵染的目的。因此，本实验以水稻中的AGO18蛋白为切入点，着重研究AGO18蛋白与其复合蛋白的组成，希望通过解析水稻AGO18蛋白复合体的组成，为以后探究水稻AGO18蛋白及其互作蛋白在植物抗病中的生物学功能提供理论依据。
本实验利用以GAL4（酵母转录激活蛋白）为基础的酵母双杂交方法[911]筛选与OsAGO18存在互作的蛋白复合体（图1）。在酵母双杂交系统中，GAL4 DNABD可特异的结合UAS（上游激活序列）上的结合位点，当诱饵质粒与文库质粒存在相互作用时，DNABD和AD会接近并结合，从而激活下游报告基因的表达[12]。因此，构建BD:OsAGO18和AD:cDNA载体，分别将这两种载体转化至酵母菌株Y2HGold和Y187中。当这两种菌株融合时，诱饵质粒和文库质粒表达的蛋白如果存在互作，将分别启动下游报告基因的表达，从而能使菌株在营养缺陷培养基上生长，由此可筛选出OsAGO18的互作蛋白。本实验通过解析OsAGO18蛋白复合体的组成，为进一步研究OsAGO18及其互作蛋白在植物抗病中的作用机制奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
1.1.1 植物
水稻日本晴由江苏省农业科学院馈赠，在大学植物保护学院植物微生物互作分子生物学实验室保存。
1.1.2 菌株
（1）酵母菌株Y2HGold和Y187均由BD MatchmakerTM Library Construction & Screening试剂盒提供；
（2）大肠杆菌感受态JM109由大学植物保护学院植物微生物互作分子生物学实验室保存。
1.1.3 载体
克隆载体pGBKT7，克隆载体pGADT7Rec，对照载体pGBKT753，对照载体pGADT7RecT，对照载体pGBKT7Lam，以上载体由BD MatchmakerTM Library Construction & Screening试剂盒提供。
1.1.4 试剂
（1）抗生素：抗生素ampicillin(50 ug/ml)，kanamycin(50 ug/ml)。
（2）质粒DNA小量制备试剂盒（离心柱型），PCR清洁回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自AXYGEN公司；酵母双杂试剂盒购自TaKaRa公司，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；限制性内切酶，rTaq酶和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司(Dalian, China)。
LB培养基（1L）
胰蛋白胨
10g
酵母提取物
5g
NaCl
10g
琼脂粉（固）
15g
1.1.5 培养基
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与仪器2
1.1 实验材料2
1.1.1植物 2
1.1.2 菌株2
1.1.3 载体2
1.1.4 试剂2
1.1.5 培养基2
1.2 实验仪器3
2 实验方法3
2.1 基本实验操作3
2.1.1 酵母质粒提取3
2.1.2 酵母感受态制备4
2.1.3 质粒转化酵母4
2.1.4 大肠杆菌质粒提取4
2.1.5 大肠杆菌感受态制备4
2.1.6 质粒转化大肠杆菌5
2.1.7 DNA的回收5
2.2 BD:OsAGO18融合载体的构建5
2.2.1 OsAGO18的克隆5
2.2.2 OsAGO18与pGBKT7相连6
2.2.3 菌落PCR验证6
2.2.4 BD:OsAGO18在Y2HGold中的毒性及自激活检测6
2.2.5 对照实验7
2.2.6 BD:OsAGO18在Y2HGold表达情况的检测7
2.2.7 转化效率的计算7
2.3 cDNA文库的构建7
2.3.1 提取植物RNA7
2.3.2 ds cDNA的合成8
2.3.3 cDNA文库覆盖率检测9
2.4 利用酵母双杂系统筛选OsAGO18的互作蛋白9
2.4.1 酵母融合筛选9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
2.4.2 验证筛选结果10
2.4.3 提取阳性克隆10
3 结果与分析10
3.1 BD:OsAGO18融合载体构建结果分析10
3.2 cDNA文库构建结果与分析13
3.3 酵母双杂交筛库结果与分析14
4 讨论16
致谢16
参考文献16
水稻OsAGO18蛋白复合体的组成解析
引言
AGO蛋白是一类序列保守的蛋白家族，广泛存在于动植物、真菌、原生动物等生物中[1]。不同AGO蛋白可在不同的生物体内发挥重要的作用[2]，如调节生物体的生长发育、参与调控生物体的生理活动、与小RNA结合参与由小RNA介导的基因沉默，对靶mRNA进行转录后及翻译水平上的调控[35,13]。而水稻是最重要的粮食作物之一，世界上有近一半的人口以水稻为主食。不过，真菌、细菌及病毒的侵染会导致水稻发生病变，从而降低水稻产量。因此，为了寻求提高水稻产量和质量、保证水稻正常生长的途径，已有实验探讨了AGO蛋白在水稻抗病中的作用，并发现AGO蛋白可参与不同的RNA沉默通路从而使植株达到抗病的作用[6,7]。目前，有研究表明OsAGO18可在被病毒诱导的条件下与植物体内的miR168结合并抑制其功能[8]，进而保护了可与miR168结合产生负反馈调节的AGO1，使其与病毒RNA结合产生基因沉默，从而达到抗病毒侵染的目的。因此，本实验以水稻中的AGO18蛋白为切入点，着重研究AGO18蛋白与其复合蛋白的组成，希望通过解析水稻AGO18蛋白复合体的组成，为以后探究水稻AGO18蛋白及其互作蛋白在植物抗病中的生物学功能提供理论依据。
本实验利用以GAL4（酵母转录激活蛋白）为基础的酵母双杂交方法[911]筛选与OsAGO18存在互作的蛋白复合体（图1）。在酵母双杂交系统中，GAL4 DNABD可特异的结合UAS（上游激活序列）上的结合位点，当诱饵质粒与文库质粒存在相互作用时，DNABD和AD会接近并结合，从而激活下游报告基因的表达[12]。因此，构建BD:OsAGO18和AD:cDNA载体，分别将这两种载体转化至酵母菌株Y2HGold和Y187中。当这两种菌株融合时，诱饵质粒和文库质粒表达的蛋白如果存在互作，将分别启动下游报告基因的表达，从而能使菌株在营养缺陷培养基上生长，由此可筛选出OsAGO18的互作蛋白。本实验通过解析OsAGO18蛋白复合体的组成，为进一步研究OsAGO18及其互作蛋白在植物抗病中的作用机制奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
1.1.1 植物
水稻日本晴由江苏省农业科学院馈赠，在大学植物保护学院植物微生物互作分子生物学实验室保存。
1.1.2 菌株
（1）酵母菌株Y2HGold和Y187均由BD MatchmakerTM Library Construction & Screening试剂盒提供；
（2）大肠杆菌感受态JM109由大学植物保护学院植物微生物互作分子生物学实验室保存。
1.1.3 载体
克隆载体pGBKT7，克隆载体pGADT7Rec，对照载体pGBKT753，对照载体pGADT7RecT，对照载体pGBKT7Lam，以上载体由BD MatchmakerTM Library Construction & Screening试剂盒提供。
1.1.4 试剂
（1）抗生素：抗生素ampicillin(50 ug/ml)，kanamycin(50 ug/ml)。
（2）质粒DNA小量制备试剂盒（离心柱型），PCR清洁回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自AXYGEN公司；酵母双杂试剂盒购自TaKaRa公司，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；限制性内切酶，rTaq酶和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司(Dalian, China)。
LB培养基（1L）
胰蛋白胨
10g
酵母提取物
5g
NaCl
10g
琼脂粉（固）
15g
1.1.5 培养基
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