水稻着丝粒特异组蛋白h3功能弱化突变体的构建
着丝粒特异组蛋白H3(centromere specific histone H3,CENH3）广泛分布于真核生物的功能着丝粒区域。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的研究表明AtCENH3的突变可以产生单倍体诱导系，其在单倍体育种中有巨大的应用前景。本研究旨在获得水稻（Oryza sativa）中CENH3的功能弱化突变体，为研究其是在水稻中是否具有相同的效应提供材料。我们首先根据拟南芥中已知的CENH3和组蛋白H3的变体H3.3的氨基酸序列，利用MSU在线BLAST工具查找到水稻中的同源基因OsCENH3(LOC_Os05g41080)和OsH3.3(LOC_Os06g04030)。借鉴拟南芥中的研究，我们构建了N端替换（Tailswap）和点突变（L118F）两种OsCENH3突变版本，使用自身启动子驱动，并包含终止密码子后1.285kb的3’UTR区域的全长序列融合eGPF蛋白连入表达载体pCAMBIA1300中。另外在OsCENH3序列中设计20nt guide RNA(gRNA)序列，使用CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences-CRISPR Associated Protein 9)基因编辑技术敲除水稻内源CENH3。最后成功获得敲除內源CENH3并同时导入功能弱化版本CENH3的载体，为下一步转化水稻提供了材料。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 实验材料 5
1．1．1 植物材料 5
1．1．2 载体及菌株 5
1．1．3 酶及分子生物学试剂 5
1．1．4 引物信息 5
1．2 实验方法 6
1．2．1 水稻同源基因比对 6
1．2．2基因组DNA提取 6
1．2．3 PCR反应 6
1．2．4冻融法回收PCR产物 6
1．2．5酶切反应 6
1．2．6 T4 DNA连接酶
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
反应体系 6
1．2．7 Gibson连接[17] 6
1．2．8转化大肠杆菌 7
1．2．9 提取大肠杆菌质粒 9
1．2．10 测序 9
2 结果与分析 10
2．1 OsCENH3和OsH3.3同源基因比对结果 10
2．2 CENH3氨基酸序列在不同物种之间的相似性比对 10
2．3 野生型OsCENH3载体构建 10
2．4 OsCENH3Tailswap CRISPR载体构建 11
2．5 OsCENH3点突变CRISPR载体构建 13
3 讨论 16
3．1 CENH3功能弱化突变体诱导单倍体产生的机理 16
3．2利用原生质体转化系统检测OsCENH3突变版本的功能 16
3．3 OsCENH3突变体在水稻单倍体育种中的应用前景 16
致谢 18
参考文献： 19
水稻着丝粒特异组蛋白H3功能弱化突变体的构建
引言
真核生物核小体是由核心组蛋白H2AH2B二聚体、(H3H4)2四聚体，和缠绕在其上的DNA，以及连接组蛋白H1共同构成的八聚体结构。除常规的组蛋白外，处于不同状态的染色质需要相应的组蛋白变体维持结构，以完成其生物学功能[1]。如组蛋白H3就存在变体：CENH3和H3.3。CENH3是特异定位于着丝粒区域的组蛋白H3的变体，被看作是着丝粒的表观遗传学标记[2]。H3.3是不依赖于复制的组蛋白H3的变体，仅在转录活跃的核小体内替换H3[3]。
着丝粒是真核生物染色体的重要组成部分，位于染色体的主缢痕处，是一个富含重复序列的异染色质区域。着丝粒对于遗传信息的准确传递起到重要的作用[4]。着丝粒包括内层动粒、外层动粒和两侧的异染色质区域[5]。在细胞有丝分裂和减数分裂的过程中，纺锤体微管通过与外层动粒结合将染色体精确地分配给子代细胞。与常规核小体不同的是，组成着丝粒核小体的组蛋白H3被其变体着丝粒特异组蛋白H3CENH3(centromerespecific histone H3,在人类中称为CENPA)所替代[6]。CENH3是一个着丝粒特异的组蛋白H3变体，只存在于真核生物的功能着丝粒中[7]。自从在人类的活性着丝粒中鉴定了第一个CENH3(CENPA)以来[8]，相继在芽殖酵母、秀丽杆线虫、鼠、果蝇、裂殖酵母以及高等植物中获得了CENPA的同源物[9]。
CENH3包含氨基端和羧基端(组蛋白质折叠域,Histone fold domain, HFD)两个结构域。N端是生物体生存所必需的，但是其长度和序列却高度可变，可能与其他着丝粒组蛋白相互作用有关[10]。相比之下，组蛋白质折叠域(HFD)相对保守，在HFD结构域内还存在一个序列更为保守的结构域CATD(CENPA Targeting Domain)，该结构域可能与CENH3特异定位于着丝粒区域有关[11]。Junnan Fang等[12]发现CENPA的RG loop(CENPA特有的Arg80/Gly81两个氨基酸)对CENPA染色质形成“双排结构”非常关键，同时也是CENPA招募CENPN的关键性位点。着丝粒区染色质结构周期性的变化可以调节RG loop在CENPA染色质上的“暴露”或“隐藏”，从而调节CENPN周期性地装配至着丝粒区域，进一步招募其他蛋白最终介导动粒的形成。
Ravi[13]等在拟南芥中获得了cenh3突变体，并通过转基因的方法用传统H3(H3.3)的N端替换掉CENH3的Tail结构域进行互补(Tailswap)，再用突变体与野生型Col杂交，发现后代中会出现比例约为25%50%的单倍体植株。采用同样的方法，与四倍体拟南芥杂交，也成功获得了倍性减半的二倍体植株。Raheleh[14]等通过EMS(Ethylmethylsulfone)诱变方法在大麦（Hordeum vulgare）中筛选到一个βCENH3(大麦中有两种具有CENH3功能的变体：αCENH3和βCENH3)的CATD结构域产生点突变L92F的突变体，人类CENPA与其相对应的位点L91是和分子伴侣HJURP结合并定位于着丝粒的重要位点[15]。在接下来的试验中Raheleh等通过细胞学的手段观察到大麦βCENH3在着丝粒区域装载的减少。
水稻是我国第一大粮食作物，全国约有2/3的人口以水稻为主粮。我国水稻品种中约有40%为常规品种，尤其在以我国东北为主的粳稻区90%以上的主栽品种均为常规品种[16]。常规水稻的米质总体上略优于杂交稻，然而常规品种选育时间周期长一直是制约常规水稻发展的最大问题。但是通过单倍体育种的方法可以达到快速纯合的目的，极大地缩短育种年限。我们希望借鉴拟南芥中的研究，通过改造水稻CENH3获得水稻单倍体诱导系，加快育种进度，降低单倍体育种的成本。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本实验所用植物材料为已经完成全基因组测序的水稻品种日本晴。在光照培养箱中（光照14 h：28 ℃/黑暗10 h：24 ℃）生长两周，剪取幼嫩叶片0.1 g，提取基因组DNA。
1．1．2 载体及菌株
本实验所用的表达载体骨架pCAMBIA1300为本实验室保存；大肠杆菌感受态菌株DH5α为本实验室自制并保存；用于扩增Cas9基因的CRISPR载体来自于高彩霞实验室；用于扩增eGFP的NTF载体来自于Roger Deal实验室。
1．1．3 酶及分子生物学试剂
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 实验材料 5
1．1．1 植物材料 5
1．1．2 载体及菌株 5
1．1．3 酶及分子生物学试剂 5
1．1．4 引物信息 5
1．2 实验方法 6
1．2．1 水稻同源基因比对 6
1．2．2基因组DNA提取 6
1．2．3 PCR反应 6
1．2．4冻融法回收PCR产物 6
1．2．5酶切反应 6
1．2．6 T4 DNA连接酶
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
反应体系 6
1．2．7 Gibson连接[17] 6
1．2．8转化大肠杆菌 7
1．2．9 提取大肠杆菌质粒 9
1．2．10 测序 9
2 结果与分析 10
2．1 OsCENH3和OsH3.3同源基因比对结果 10
2．2 CENH3氨基酸序列在不同物种之间的相似性比对 10
2．3 野生型OsCENH3载体构建 10
2．4 OsCENH3Tailswap CRISPR载体构建 11
2．5 OsCENH3点突变CRISPR载体构建 13
3 讨论 16
3．1 CENH3功能弱化突变体诱导单倍体产生的机理 16
3．2利用原生质体转化系统检测OsCENH3突变版本的功能 16
3．3 OsCENH3突变体在水稻单倍体育种中的应用前景 16
致谢 18
参考文献： 19
水稻着丝粒特异组蛋白H3功能弱化突变体的构建
引言
真核生物核小体是由核心组蛋白H2AH2B二聚体、(H3H4)2四聚体，和缠绕在其上的DNA，以及连接组蛋白H1共同构成的八聚体结构。除常规的组蛋白外，处于不同状态的染色质需要相应的组蛋白变体维持结构，以完成其生物学功能[1]。如组蛋白H3就存在变体：CENH3和H3.3。CENH3是特异定位于着丝粒区域的组蛋白H3的变体，被看作是着丝粒的表观遗传学标记[2]。H3.3是不依赖于复制的组蛋白H3的变体，仅在转录活跃的核小体内替换H3[3]。
着丝粒是真核生物染色体的重要组成部分，位于染色体的主缢痕处，是一个富含重复序列的异染色质区域。着丝粒对于遗传信息的准确传递起到重要的作用[4]。着丝粒包括内层动粒、外层动粒和两侧的异染色质区域[5]。在细胞有丝分裂和减数分裂的过程中，纺锤体微管通过与外层动粒结合将染色体精确地分配给子代细胞。与常规核小体不同的是，组成着丝粒核小体的组蛋白H3被其变体着丝粒特异组蛋白H3CENH3(centromerespecific histone H3,在人类中称为CENPA)所替代[6]。CENH3是一个着丝粒特异的组蛋白H3变体，只存在于真核生物的功能着丝粒中[7]。自从在人类的活性着丝粒中鉴定了第一个CENH3(CENPA)以来[8]，相继在芽殖酵母、秀丽杆线虫、鼠、果蝇、裂殖酵母以及高等植物中获得了CENPA的同源物[9]。
CENH3包含氨基端和羧基端(组蛋白质折叠域,Histone fold domain, HFD)两个结构域。N端是生物体生存所必需的，但是其长度和序列却高度可变，可能与其他着丝粒组蛋白相互作用有关[10]。相比之下，组蛋白质折叠域(HFD)相对保守，在HFD结构域内还存在一个序列更为保守的结构域CATD(CENPA Targeting Domain)，该结构域可能与CENH3特异定位于着丝粒区域有关[11]。Junnan Fang等[12]发现CENPA的RG loop(CENPA特有的Arg80/Gly81两个氨基酸)对CENPA染色质形成“双排结构”非常关键，同时也是CENPA招募CENPN的关键性位点。着丝粒区染色质结构周期性的变化可以调节RG loop在CENPA染色质上的“暴露”或“隐藏”，从而调节CENPN周期性地装配至着丝粒区域，进一步招募其他蛋白最终介导动粒的形成。
Ravi[13]等在拟南芥中获得了cenh3突变体，并通过转基因的方法用传统H3(H3.3)的N端替换掉CENH3的Tail结构域进行互补(Tailswap)，再用突变体与野生型Col杂交，发现后代中会出现比例约为25%50%的单倍体植株。采用同样的方法，与四倍体拟南芥杂交，也成功获得了倍性减半的二倍体植株。Raheleh[14]等通过EMS(Ethylmethylsulfone)诱变方法在大麦（Hordeum vulgare）中筛选到一个βCENH3(大麦中有两种具有CENH3功能的变体：αCENH3和βCENH3)的CATD结构域产生点突变L92F的突变体，人类CENPA与其相对应的位点L91是和分子伴侣HJURP结合并定位于着丝粒的重要位点[15]。在接下来的试验中Raheleh等通过细胞学的手段观察到大麦βCENH3在着丝粒区域装载的减少。
水稻是我国第一大粮食作物，全国约有2/3的人口以水稻为主粮。我国水稻品种中约有40%为常规品种，尤其在以我国东北为主的粳稻区90%以上的主栽品种均为常规品种[16]。常规水稻的米质总体上略优于杂交稻，然而常规品种选育时间周期长一直是制约常规水稻发展的最大问题。但是通过单倍体育种的方法可以达到快速纯合的目的，极大地缩短育种年限。我们希望借鉴拟南芥中的研究，通过改造水稻CENH3获得水稻单倍体诱导系，加快育种进度，降低单倍体育种的成本。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本实验所用植物材料为已经完成全基因组测序的水稻品种日本晴。在光照培养箱中（光照14 h：28 ℃/黑暗10 h：24 ℃）生长两周，剪取幼嫩叶片0.1 g，提取基因组DNA。
1．1．2 载体及菌株
本实验所用的表达载体骨架pCAMBIA1300为本实验室保存；大肠杆菌感受态菌株DH5α为本实验室自制并保存；用于扩增Cas9基因的CRISPR载体来自于高彩霞实验室；用于扩增eGFP的NTF载体来自于Roger Deal实验室。
1．1．3 酶及分子生物学试剂
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