甜菜夜蛾黄素单加氧酶的rna干扰研究
摘要：甜菜夜蛾Spodoptera exigua为广泛性分布的多食性重要农业害虫，主要为害蔬菜、棉花和观赏性植物等。前期研究显示，黄素单加氧酶可能参与了甜菜夜蛾对氰氟虫腙的抗药性。通过RNA干扰技术对甜菜夜蛾的FMO基因进行功能研究，结果显示注射FMO基因dsRNA双链后甜菜夜蛾出现一定程度的死亡，推测FMO是昆虫的重要功能基因；未死亡试虫的体重日增加率与对照相比无显著性差异，但由于对照昆虫本身生长差异较大，实验结果还需进一步确定。FMO基因与甜菜夜蛾的生长发育、能量代谢的关系仍需进一步研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试昆虫 2
1.2 主要试剂和仪器2
1.2.1 主要试剂..........2
1.2.2 主要实验设备2
1.3 总RNA提取和cDNA合成3
1.3.1 总RNA提取3
1.3.2 cDNA合成3
1.4 qPCR引物设计3
1.5 dsRNA合成 3
1.5.1 引物的设计.......3
1.5.2 合成dsRNA模板..4
1.5.3 dsRNA的体外合成...4
1.5.4 dsRNA注射..5
1.6 甜菜夜蛾FMO基因的qPCR分析...5
1.6.1 qPCR.....5
1.6.2 甜菜夜蛾FMO基因mRNA表达量比较...5
2 结果与分析...............5
2.1 qPCR有效性分析5
2.1.1 线性关系以及扩增效率确认5
2.1.2 特异性确认...........6
2.2 dsRNA合成结果................................................................................. 7
2.2.1双链合成模板的扩增产物..........7
2.2.2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
dsRNA浓度...........8
2.3 注射dsRNA后FMO基因转录水平...........8
2.4 注射dsRNA后甜菜夜蛾死亡率................8
2.5 注射dsRNA后非死亡甜菜夜蛾体重变化情况9
3 讨论................ ......9
3.1 FMO基因是甜菜夜蛾重要功能基因........9
3.2 FMO基因与生长发育的关系需要进一步研究10
3.3 FMO基因参与害虫抗药性的可能..............................................................10
致谢10
参考文献10
甜菜夜蛾黄素单加氧酶的RNA干扰研究
引言
甜菜夜蛾Spodoptera exigua属于鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性分布、多食性和间歇性暴发的重要农业害虫。长期以来化学药剂的不合理使用，已产生了广泛的抗药性，严重影响化学防治工作，对经济作物产量造成了极大损失。在山东[1]、湖北[2]等地的一些田间种群已对氯氰菊酯、毒死蜱产生了极高水平的抗药性，对灭多威也产生了中等水平的抗性；近年来在我国陆续报道了甜菜夜蛾对茚虫威[3]、氯虫苯甲酰胺[4]等作用机制新颖的杀虫剂也产生了不同程度的抗药性。本实验室前期研究发现，2009年才在中国获得登记的新型钠离子通道阻断剂氰氟虫腙，在广东惠州（2011—2012年）也已经产生了高水平抗药性[5]。对于氰氟虫腙的抗药性生化机制，增效剂试验和解毒酶活性检测显示：酯酶的作用最大，多功能氧化酶系中的黄素单加氧酶家族也在氰氟虫腙抗药性中发挥着一定作用[6]。
黄素单加氧酶（flavindependent monooxygenase, FMO, E.C. 1. 14. 13. 8）是一组依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）和分子氧的微粒体酶。在哺乳动物中，FMO是重要的肝内药物和外源物代谢酶，广泛发挥着解毒代谢作用，可催化含氮、硫、磷、硒和其他亲核杂原子的化合物和药物的氧化[7]。哺乳动物的FMO基因一共有5种，FMO15，鳞翅目昆虫FMO基因一共有3种，FMO13，果蝇的FMO基因有两种FMO12。由于其基因家族的成员数远远小于另一种典型的多功能氧化酶—细胞色素P450超基因家族，在催化机制和底物范围上又与P450极为相似，故FMO基因的功能研究存在很大的滞后性，大多数时候被混淆或者忽略[8]。
相对于FMO在哺乳动物中相对广泛的研究，在昆虫中FMO的特性和功能还不明确。除了对灯蛾和蝗虫的FMO1进化复制后作为氮氧化吡咯生物碱酶（PNO），以代谢寄主食物体内的毒物有系统研究之外[9]，其他针对昆虫FMO功能特性的研究也仅有对果蝇FMO基因克隆与表达的报道[10]，SCI论文数据库收录的昆虫FMO研究论文仅有5篇。在本实验室首次发现FMO可能参与氰氟虫腙的抗药性后，分子克隆和表达规律研究等有关甜菜夜蛾FMO的功能特性研究相继开展，而探寻FMO的功能是明确FMO在抗药性中所起作用的基础。
1 材料与方法
1.1供试昆虫
甜菜夜蛾敏感品系（Labsus）：2001年5月由武汉科诺生物技术有限公司提供，在室内未接触任何药剂饲养至今。幼虫取食人工饲料，成虫吸食糖水，饲养期间不接触任何化学药剂。饲养条件：温度27℃±1℃，湿度70%—80%，光周期为14h(L):10h(D)的光照培养箱内。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
SV Total RNA Isolation System，RNA提取试剂盒，Promaga公司；
PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time），反转录试剂盒，Takara公司；
Premix Taq?（TaKaRa Taq? Version 2.0 plus dye），PCR试剂，Takara公司；
SYBR? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus），荧光定量PCR试剂盒，Takara公司；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 供试昆虫 2
1.2 主要试剂和仪器2
1.2.1 主要试剂..........2
1.2.2 主要实验设备2
1.3 总RNA提取和cDNA合成3
1.3.1 总RNA提取3
1.3.2 cDNA合成3
1.4 qPCR引物设计3
1.5 dsRNA合成 3
1.5.1 引物的设计.......3
1.5.2 合成dsRNA模板..4
1.5.3 dsRNA的体外合成...4
1.5.4 dsRNA注射..5
1.6 甜菜夜蛾FMO基因的qPCR分析...5
1.6.1 qPCR.....5
1.6.2 甜菜夜蛾FMO基因mRNA表达量比较...5
2 结果与分析...............5
2.1 qPCR有效性分析5
2.1.1 线性关系以及扩增效率确认5
2.1.2 特异性确认...........6
2.2 dsRNA合成结果................................................................................. 7
2.2.1双链合成模板的扩增产物..........7
2.2.2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
dsRNA浓度...........8
2.3 注射dsRNA后FMO基因转录水平...........8
2.4 注射dsRNA后甜菜夜蛾死亡率................8
2.5 注射dsRNA后非死亡甜菜夜蛾体重变化情况9
3 讨论................ ......9
3.1 FMO基因是甜菜夜蛾重要功能基因........9
3.2 FMO基因与生长发育的关系需要进一步研究10
3.3 FMO基因参与害虫抗药性的可能..............................................................10
致谢10
参考文献10
甜菜夜蛾黄素单加氧酶的RNA干扰研究
引言
甜菜夜蛾Spodoptera exigua属于鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性分布、多食性和间歇性暴发的重要农业害虫。长期以来化学药剂的不合理使用，已产生了广泛的抗药性，严重影响化学防治工作，对经济作物产量造成了极大损失。在山东[1]、湖北[2]等地的一些田间种群已对氯氰菊酯、毒死蜱产生了极高水平的抗药性，对灭多威也产生了中等水平的抗性；近年来在我国陆续报道了甜菜夜蛾对茚虫威[3]、氯虫苯甲酰胺[4]等作用机制新颖的杀虫剂也产生了不同程度的抗药性。本实验室前期研究发现，2009年才在中国获得登记的新型钠离子通道阻断剂氰氟虫腙，在广东惠州（2011—2012年）也已经产生了高水平抗药性[5]。对于氰氟虫腙的抗药性生化机制，增效剂试验和解毒酶活性检测显示：酯酶的作用最大，多功能氧化酶系中的黄素单加氧酶家族也在氰氟虫腙抗药性中发挥着一定作用[6]。
黄素单加氧酶（flavindependent monooxygenase, FMO, E.C. 1. 14. 13. 8）是一组依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）和分子氧的微粒体酶。在哺乳动物中，FMO是重要的肝内药物和外源物代谢酶，广泛发挥着解毒代谢作用，可催化含氮、硫、磷、硒和其他亲核杂原子的化合物和药物的氧化[7]。哺乳动物的FMO基因一共有5种，FMO15，鳞翅目昆虫FMO基因一共有3种，FMO13，果蝇的FMO基因有两种FMO12。由于其基因家族的成员数远远小于另一种典型的多功能氧化酶—细胞色素P450超基因家族，在催化机制和底物范围上又与P450极为相似，故FMO基因的功能研究存在很大的滞后性，大多数时候被混淆或者忽略[8]。
相对于FMO在哺乳动物中相对广泛的研究，在昆虫中FMO的特性和功能还不明确。除了对灯蛾和蝗虫的FMO1进化复制后作为氮氧化吡咯生物碱酶（PNO），以代谢寄主食物体内的毒物有系统研究之外[9]，其他针对昆虫FMO功能特性的研究也仅有对果蝇FMO基因克隆与表达的报道[10]，SCI论文数据库收录的昆虫FMO研究论文仅有5篇。在本实验室首次发现FMO可能参与氰氟虫腙的抗药性后，分子克隆和表达规律研究等有关甜菜夜蛾FMO的功能特性研究相继开展，而探寻FMO的功能是明确FMO在抗药性中所起作用的基础。
1 材料与方法
1.1供试昆虫
甜菜夜蛾敏感品系（Labsus）：2001年5月由武汉科诺生物技术有限公司提供，在室内未接触任何药剂饲养至今。幼虫取食人工饲料，成虫吸食糖水，饲养期间不接触任何化学药剂。饲养条件：温度27℃±1℃，湿度70%—80%，光周期为14h(L):10h(D)的光照培养箱内。
1.2主要试剂和仪器
1.2.1主要试剂
SV Total RNA Isolation System，RNA提取试剂盒，Promaga公司；
PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time），反转录试剂盒，Takara公司；
Premix Taq?（TaKaRa Taq? Version 2.0 plus dye），PCR试剂，Takara公司；
SYBR? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus），荧光定量PCR试剂盒，Takara公司；
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