某地区一株猪伪狂犬病毒的分离与鉴定
某地区一株猪伪狂犬病毒的分离与鉴定[20200507185842]
摘要：伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种重要传染病。伪狂犬病毒的分类学命名为猪疱疹病毒 I 型，它是猪的疱疹病毒，属于疱疹病毒甲亚科水痘疱疹病毒属。该病分布广泛，危害严重，能引起多种家畜和野生动物感染的高度接触性传染病，猪为重要的病毒贮存宿主和疫源动物。该病通常引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖功能障碍以及新生仔猪的神经症状，仔猪感染死亡率高达100%。近年来，我国多个省份猪场发生并报道了该病，给我国养猪业造成巨大经济损失。本研究通过对南京地区一疑似发生猪伪狂犬的猪场病料进行伪狂犬病毒的分离、鉴定，为该病毒的进一步研究提供材料，也为我国猪伪狂犬病的诊断和防治提供参考。
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关键字:伪狂犬病毒；分离；鉴定
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1送检样品的处理 2
1.2.2 病料处理 2
1.2.3 DNA的提取 2
1.2.4 PCR鉴定与测序 2
1.2.5 病毒分离与增殖 3
1.2.6 提取DNA与PCR鉴定 3
1.2.7 病毒滴度测定 3
1.2.8 间接免疫荧光 （IFA 鉴定）3
1.2.9易感动物接种试验 3
1.2.10血清中和指数测定3
2 结果与分析 3
2.1 PCR 扩增结果 3
2.2重组质粒的酶切和 PCR 鉴定结果4
2.3 病毒 TCID50 测定结果 5
2.4病毒的 IFA 鉴定5
2.5易感动物接种试验 5
2.6血清中和指数测定 5
3 讨论 5
致谢6
参考文献7
南京地区一株猪伪狂犬病毒的分离与鉴定
引言
伪狂犬病(Pseudorabies , PR)是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种或多种动物感染的烈性传染病，主要特征为发热、流产、奇痒和脑脊髓炎。伪狂犬病毒的分类学命名为猪疱疹病毒 I 型，是猪的疱疹病毒，属于疱疹病毒亚科水痘疱疹病毒属[8]。猪是PRV主要的天然宿主、贮存宿主和传染源。伪狂犬病是自然疫源性疾病，最早在美国发生，我国在上个世纪 40 年代末首次发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
现了猫伪狂犬病毒，60年代初在猪群中也出现了该病毒[3]，于今伪狂犬病毒在我国广泛的存在，严重影响着养猪业的发展，并造成巨大经济损失。
伪狂犬病的主要症状为发热、奇痒（猪除外）、呼吸系统和神经系统障碍。该病毒可感染各个年龄段的猪，成年猪感染 PRV 后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒[7]。出现过临床症状的耐过猪也能携带病毒，成为传染源。成年母猪感染该病后，可发生流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率等。仔猪感染死亡率高达80%~100%[2]，新生仔猪除了出现神经症状外，还可以侵害免疫系统，使其容易继发其它疾病，如 PRRS。近几年由于强毒株的出现，猪场爆发PR的数量显著增加，症状明显加剧，现在已有 40 多个国家报道 40 多种动物感染该病，在我国已有 24个省市报道发生此病[6]。所以，当新的病毒株出现时，及时从发病猪中分离、鉴定新毒株，并对其生物学特性进行研究记录，在理论上和实践上都具有十分重要的意义。
本实验从南京某疑似伪狂犬的发病猪场采集病料，并对样本进行了猪伪狂犬病毒（PRV）的检测及病毒的分离、鉴定，结果表明该猪场存在伪狂犬病毒感染。并对该分离株的部分生物学特性进行研究，为进一步认清流行病毒特征、控制该病传播和蔓延打下了坚实的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
从猪场采集心、肝、脾、肺、肾、脑、腹股沟淋巴结、小肠及内容物和血液等病料；
1．1．2 实验试剂
LA TaqDNA 聚合酶，dNTP mix，2×GC Buffer I，pMD18-T Vector，DL 2000 DNA Marker 购于TAKARA宝生物工程(大连)有限公司。胎牛血清(fetal bovine se，FBS)和 DMEM 培养基为Invitrogen 公司产品。用于病毒分离的BHK细胞由本实验室保存，以含10% FBS 的 DMEM 培养。PRV阳性豚鼠血清及 PRV-SD株由本实验室保存。其他各种实验试剂均为分析纯试剂。
1．2 方法
1．2．1 送检样品的处理：
对猪场送检的死猪进行流行病学调查和临床，采集其内脏样本。
1．2．2 病料处理
取内脏样本与PBS （0.1M， pH7.2） 以V/V 1： 5 制成匀浆， 反复冻融3 次， 3000 r/min 离心15 min，取上清提取病毒DNA。
1．2．3 DNA的提取
分别取阳性病料和实验室强毒对照PRV-SD株反复冻融 3 次后，进行 DNA 抽提：取内脏上清样本450ul与50μL 10%的SDS和3μL蛋白酶K混合，置于56℃水浴中30min，间隔振荡；然后在样品中加入500μL酚，振荡作用后，12000r/min离心10min；离心后取上清，加入等体积酚：氯仿（1：1），作用5min，抽提1次（以10000~12000r/min离心10min，取上清）；加入等体积的氯仿，抽提1次；加入2倍体积无水乙醇及1/10体积的3M 醋酸钠，置于-20℃沉淀30min以上；10000r/min离心10min，弃上清；加入1ml 75%酒精洗涤核酸沉淀，6500r/min离心5min，弃上清；倒扣eppendorf管待乙醇干燥，用3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0μL双蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。
1．2．4 PCR鉴定与测序
引物为实验室保存，上游引物(P1)：5’- CCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3’下游引物(P2)：5’- CGGGGCGGGACATCAACAGGC-3’扩增片段大小1737bp，引物由上海英骏生物工程有限公司合成。分别以伪狂犬阳性病料和 PRV SD株作为模板进行 PCR 扩增。
PCR反应体系为50μL，含有5μL 的DNA模板, 100μm/L dNTP 8μL，PRV-P1 1μL，PRV -P2 1μL，2×GC Buffer I 25μL，2mmol/L MgCl2 6μL及0.5U LA Taq酶，剩余体积用ddH2O补齐。94℃变性5min后进入循环94℃ 1 min，53℃1min，72℃1 min，共35个循环；最后72℃10 min。取少量PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯光下观察扩增结果。
将 PCR 扩增产物经过胶回收纯化后，与 pMD18-T Vector进行连接反应，取 10μL 连接产物转化至制备好的基因工程菌 DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的 LB 平板，37℃培养 12～16h，随机从平板上挑取单菌落接种于 4.5mL含氨苄青霉素的 LB 培养液，37℃振荡培养 10～12h，用碱裂解法抽提质粒，经 Hind III和 EcoRI工具酶双酶切质粒于 1%琼脂糖凝胶电泳，筛选、鉴定阳性重组质粒。
将经过鉴定含阳性重组质粒的 DH5α工程菌菌液送上海英骏生物工程有限公司进行测序。
1．2．5 病毒分离
将PCR 扩增结果为阳性的病料组织研磨液以12000rpm离心15min，上清经 0.22μm 滤器过滤后，取 500μL 接种至长势良好单层BHK-21细胞，37℃孵育1h后加入含 2%胎牛血清的 DMEM 培养液，置37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养并观察细胞病变。待 70%左右的细胞发生病变时收获病毒，冻融三次，取上清，提取 DNA，用 PCR 方法再次鉴定。
摘要：伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种重要传染病。伪狂犬病毒的分类学命名为猪疱疹病毒 I 型，它是猪的疱疹病毒，属于疱疹病毒甲亚科水痘疱疹病毒属。该病分布广泛，危害严重，能引起多种家畜和野生动物感染的高度接触性传染病，猪为重要的病毒贮存宿主和疫源动物。该病通常引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖功能障碍以及新生仔猪的神经症状，仔猪感染死亡率高达100%。近年来，我国多个省份猪场发生并报道了该病，给我国养猪业造成巨大经济损失。本研究通过对南京地区一疑似发生猪伪狂犬的猪场病料进行伪狂犬病毒的分离、鉴定，为该病毒的进一步研究提供材料，也为我国猪伪狂犬病的诊断和防治提供参考。
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关键字:伪狂犬病毒；分离；鉴定
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1送检样品的处理 2
1.2.2 病料处理 2
1.2.3 DNA的提取 2
1.2.4 PCR鉴定与测序 2
1.2.5 病毒分离与增殖 3
1.2.6 提取DNA与PCR鉴定 3
1.2.7 病毒滴度测定 3
1.2.8 间接免疫荧光 （IFA 鉴定）3
1.2.9易感动物接种试验 3
1.2.10血清中和指数测定3
2 结果与分析 3
2.1 PCR 扩增结果 3
2.2重组质粒的酶切和 PCR 鉴定结果4
2.3 病毒 TCID50 测定结果 5
2.4病毒的 IFA 鉴定5
2.5易感动物接种试验 5
2.6血清中和指数测定 5
3 讨论 5
致谢6
参考文献7
南京地区一株猪伪狂犬病毒的分离与鉴定
引言
伪狂犬病(Pseudorabies , PR)是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种或多种动物感染的烈性传染病，主要特征为发热、流产、奇痒和脑脊髓炎。伪狂犬病毒的分类学命名为猪疱疹病毒 I 型，是猪的疱疹病毒，属于疱疹病毒亚科水痘疱疹病毒属[8]。猪是PRV主要的天然宿主、贮存宿主和传染源。伪狂犬病是自然疫源性疾病，最早在美国发生，我国在上个世纪 40 年代末首次发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
现了猫伪狂犬病毒，60年代初在猪群中也出现了该病毒[3]，于今伪狂犬病毒在我国广泛的存在，严重影响着养猪业的发展，并造成巨大经济损失。
伪狂犬病的主要症状为发热、奇痒（猪除外）、呼吸系统和神经系统障碍。该病毒可感染各个年龄段的猪，成年猪感染 PRV 后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒[7]。出现过临床症状的耐过猪也能携带病毒，成为传染源。成年母猪感染该病后，可发生流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率等。仔猪感染死亡率高达80%~100%[2]，新生仔猪除了出现神经症状外，还可以侵害免疫系统，使其容易继发其它疾病，如 PRRS。近几年由于强毒株的出现，猪场爆发PR的数量显著增加，症状明显加剧，现在已有 40 多个国家报道 40 多种动物感染该病，在我国已有 24个省市报道发生此病[6]。所以，当新的病毒株出现时，及时从发病猪中分离、鉴定新毒株，并对其生物学特性进行研究记录，在理论上和实践上都具有十分重要的意义。
本实验从南京某疑似伪狂犬的发病猪场采集病料，并对样本进行了猪伪狂犬病毒（PRV）的检测及病毒的分离、鉴定，结果表明该猪场存在伪狂犬病毒感染。并对该分离株的部分生物学特性进行研究，为进一步认清流行病毒特征、控制该病传播和蔓延打下了坚实的基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验材料
从猪场采集心、肝、脾、肺、肾、脑、腹股沟淋巴结、小肠及内容物和血液等病料；
1．1．2 实验试剂
LA TaqDNA 聚合酶，dNTP mix，2×GC Buffer I，pMD18-T Vector，DL 2000 DNA Marker 购于TAKARA宝生物工程(大连)有限公司。胎牛血清(fetal bovine se，FBS)和 DMEM 培养基为Invitrogen 公司产品。用于病毒分离的BHK细胞由本实验室保存，以含10% FBS 的 DMEM 培养。PRV阳性豚鼠血清及 PRV-SD株由本实验室保存。其他各种实验试剂均为分析纯试剂。
1．2 方法
1．2．1 送检样品的处理：
对猪场送检的死猪进行流行病学调查和临床，采集其内脏样本。
1．2．2 病料处理
取内脏样本与PBS （0.1M， pH7.2） 以V/V 1： 5 制成匀浆， 反复冻融3 次， 3000 r/min 离心15 min，取上清提取病毒DNA。
1．2．3 DNA的提取
分别取阳性病料和实验室强毒对照PRV-SD株反复冻融 3 次后，进行 DNA 抽提：取内脏上清样本450ul与50μL 10%的SDS和3μL蛋白酶K混合，置于56℃水浴中30min，间隔振荡；然后在样品中加入500μL酚，振荡作用后，12000r/min离心10min；离心后取上清，加入等体积酚：氯仿（1：1），作用5min，抽提1次（以10000~12000r/min离心10min，取上清）；加入等体积的氯仿，抽提1次；加入2倍体积无水乙醇及1/10体积的3M 醋酸钠，置于-20℃沉淀30min以上；10000r/min离心10min，弃上清；加入1ml 75%酒精洗涤核酸沉淀，6500r/min离心5min，弃上清；倒扣eppendorf管待乙醇干燥，用3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0μL双蒸馏水溶解沉淀，-20℃贮存备用。
1．2．4 PCR鉴定与测序
引物为实验室保存，上游引物(P1)：5’- CCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3’下游引物(P2)：5’- CGGGGCGGGACATCAACAGGC-3’扩增片段大小1737bp，引物由上海英骏生物工程有限公司合成。分别以伪狂犬阳性病料和 PRV SD株作为模板进行 PCR 扩增。
PCR反应体系为50μL，含有5μL 的DNA模板, 100μm/L dNTP 8μL，PRV-P1 1μL，PRV -P2 1μL，2×GC Buffer I 25μL，2mmol/L MgCl2 6μL及0.5U LA Taq酶，剩余体积用ddH2O补齐。94℃变性5min后进入循环94℃ 1 min，53℃1min，72℃1 min，共35个循环；最后72℃10 min。取少量PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯光下观察扩增结果。
将 PCR 扩增产物经过胶回收纯化后，与 pMD18-T Vector进行连接反应，取 10μL 连接产物转化至制备好的基因工程菌 DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的 LB 平板，37℃培养 12～16h，随机从平板上挑取单菌落接种于 4.5mL含氨苄青霉素的 LB 培养液，37℃振荡培养 10～12h，用碱裂解法抽提质粒，经 Hind III和 EcoRI工具酶双酶切质粒于 1%琼脂糖凝胶电泳，筛选、鉴定阳性重组质粒。
将经过鉴定含阳性重组质粒的 DH5α工程菌菌液送上海英骏生物工程有限公司进行测序。
1．2．5 病毒分离
将PCR 扩增结果为阳性的病料组织研磨液以12000rpm离心15min，上清经 0.22μm 滤器过滤后，取 500μL 接种至长势良好单层BHK-21细胞，37℃孵育1h后加入含 2%胎牛血清的 DMEM 培养液，置37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养并观察细胞病变。待 70%左右的细胞发生病变时收获病毒，冻融三次，取上清，提取 DNA，用 PCR 方法再次鉴定。
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