某蛋鸡养殖场H5N2亚型高致病性禽流感分析
某蛋鸡养殖场H5N2亚型高致病性禽流感分析[20200507184543]
摘要：2014年1月，通过常规监测发现青岛市红岛经济开发区某蛋鸡场发生疑似H5亚型高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）疫情，该鸡场曾4次接种高致病性禽流感疫苗，我们通过在健康鸡群中采集30份棉拭子，通过RT-PCR实验对H5亚型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因进行检测，发现3例阳性，对其HA基因进行分子进化分析，发现H5亚型HPAIV的HA基因已发生了很大变异。疫苗变异株的出现，养殖场环境不好，都可能是疫情出现的原因。因此，建议养殖场要通过改善养殖环境、加强生物安全和及时更新疫苗品种来防治禽流感的发生。
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关键字:H5N2亚型高致病性禽流感；变异；血凝素基因；分子进化分析
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摘要 1
引言
禽流感是一种由禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）引起的接触性高传染性疾病，不仅感染鸡群还可以感染各种禽类、猪甚至人类。禽流感病毒属于正粘病毒科，A型流感病毒属，其基因组由八个单股负链RNA组成，分别编码PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2等10种蛋白，其中片段4编码的血凝素是一种糖蛋白，可使病毒吸附于易感细胞的表面受体上，诱导病毒囊膜和细胞膜融合[1]。此外，HA基因很容易发生变异，是病毒抗原变异的主要原因，HA还是病毒毒力和宿主特异性的主要决定因素[3]。
HA基因发生变异可能产生新的禽流感疫苗变异株，导致疫苗的免疫作用降低甚至消失，进而引发新的禽流感疫情，引起鸡群产蛋率下降甚至死亡，给蛋鸡养殖带来重大的经济损失[6]。更有甚者，该病毒能够通过变异与人的流感病毒受体结合，引发人的感染，给公共卫生安全带来隐患[4]。本研究中，我们从一个已进行多次免疫接种高致病性禽流感疫苗的蛋鸡养殖场中分离到H5N2亚型HPAIV，并对该病毒的HA基因进行分子进化分析，以期对我国的AIV进化提供新的论点，并对提高HPAIV的防控提供建议。
1 材料与方法
1.1 养殖场流行病学调查情况和样品的采集
该养鸡场位于红岛经济开发区河套街道办事处小涧西村，有多年的养鸡历史。目前存养海蓝褐320日龄蛋鸡11000只，分别饲养在1、2号鸡舍，100日龄育成鸡10000只，饲养在3号鸡舍。该鸡场育成鸡在2013年10月25日接种禽流感疫苗。产蛋鸡曾在2013年9月27日、11月25日、12月25日、1月8日接种禽流感疫苗（Re-4+Re-6）。1月11日开始1号鸡舍有零星死亡，之后，死亡量逐渐增加，主要集 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
中在1、2号鸡舍。病鸡表现眼脸肿胀、排黄绿稀便，产蛋鸡产蛋量下降，死亡，病死率为2.75%。剖检病死鸡有气管出血和腺胃乳头出血现象。死亡情况见表1。
时间1月11日1月12日1月13日1月14日1月15日1月16日合计
死亡只数215255060150302
2014年1月16日，青岛动物疫病预防与控制中心将采集的样品送往山东省疫控中心检测，当天下午检测结果显示，在18份送检样品中9份为H5亚型阳性（特异性100%）。结合临床观察、流行病学分析和实验室检测结果，确认为疑似H5亚型禽流感疫情。
2014年1月17日，在位于红岛经济开发区河套街道办事处小涧西村某蛋鸡养殖场采集咽喉、泄殖腔拭子样品30份。
采样时，用灭菌棉拭子采集表面健康鸡喉气管分泌液与泄殖腔分泌液（带有少量粪便），保存于终浓度为庆大霉素250 mg/L、左旋氧氟沙星60 mg/L和阿奇霉素60 mg/L的50%灭菌甘油PBS 2 mL离心管中，置于0-4℃冰盒内[2]。
1.2 主要的试剂与仪器
SPF鸡胚（购自山东省济南赛斯有限责任公司）；QIAamp Viral RNA Mini Kit （购于德国QIAGEN公司）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit，DL2 000（购于宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖（购于上海YiTo公司）；无水乙醇、甘油、6×Loading Buffer、核酸染料等其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。
生物安全柜（美国Forma Scientific）、高速台式离心机（德国HeraeusBiofugeprimoR）、PCR扩增仪（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）、微波炉（海尔）、电泳仪（东方特力工贸公司）、紫外光凝胶成像系统（美国GeneGenius UVP型）、电子天平（德国SartoriusBS-210S）、-70℃超低温冰箱（日本三洋 MDF-383E型）。
1.3 HA、NA基因引物设计与合成
根据GenBank上已经发表的禽流感病毒毒株参考序列，设计扩增HA、NA全长基因片段的引物，引物序列为：
HA：上游5’- TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG -3’
下游5’- ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAG -3’
NA：上游5’- TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAG -3’
下游5’- ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAG -3’
由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.4 病毒的增殖
将棉拭子置于25℃温箱，作用30 min后取出；10000 rpm离心10 min，取上清液200 μL，尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，并做好标记，封口后置37℃饱和湿度孵育，每12 h观察一次，弃去24 h内的死亡鸡胚，24～72 h死亡和未死亡鸡胚4℃放置过夜后，收集尿囊液，分装并置-70℃冰箱保存备用[5]。
1.5 血凝实验
1) 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加25 μL PBS；
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2) 分别吸取25 μL鸡胚尿囊液加入到第1列孔中，吹打3～5次充分混匀；
3) 从第1列孔吸取25 μL混匀后的尿囊液加到第2列孔中，混匀后吸取25 μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细胞对照；
4) 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液；
5) 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20～25℃）静置45 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。
HA试验结果判断时要求将板倾斜45度，观察沉集红细胞流淌情况（图1中C、D所示），凡是有流淌的都不能算成100％凝集[9]。本次实验血凝结果大于24则为阳性[15]。
1.6 病毒RNA的提取
用QIAamp Viral RNA Mini Kit进行病毒RNA的纯化提取，具体步骤如下：
1) 吸取560 μL的Buffer AVL加入到有carrier RNA的1.5 mL离心管中，混匀；
2) 将140 μL尿囊液加入到上述离心管中，斡旋15 s，混匀；
3) 室温放置10 min；
4) 瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；
5) 样品中加入560 μL无水乙醇，斡旋15 s充分混匀，瞬时离心；
6) 吸取630 μL上步中的溶液小心加入column（已放到2 mL离心管中），不要碰到柱子的边缘，8000 rpm离心1 min。离心后将column放入到新的2 mL离心管中，弃去旧的离心管；
3.2.2 疫苗接种后要进行免疫效果监测
应在家禽免疫后2l天用禽流感抗体血凝抑制试验进行免疫效果监测。（HI）抗体效价≥24判定为合格。存栏禽群免疫抗体合格率≥70％判定为合格[10]。
摘要：2014年1月，通过常规监测发现青岛市红岛经济开发区某蛋鸡场发生疑似H5亚型高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）疫情，该鸡场曾4次接种高致病性禽流感疫苗，我们通过在健康鸡群中采集30份棉拭子，通过RT-PCR实验对H5亚型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因进行检测，发现3例阳性，对其HA基因进行分子进化分析，发现H5亚型HPAIV的HA基因已发生了很大变异。疫苗变异株的出现，养殖场环境不好，都可能是疫情出现的原因。因此，建议养殖场要通过改善养殖环境、加强生物安全和及时更新疫苗品种来防治禽流感的发生。
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引言
禽流感是一种由禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）引起的接触性高传染性疾病，不仅感染鸡群还可以感染各种禽类、猪甚至人类。禽流感病毒属于正粘病毒科，A型流感病毒属，其基因组由八个单股负链RNA组成，分别编码PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2等10种蛋白，其中片段4编码的血凝素是一种糖蛋白，可使病毒吸附于易感细胞的表面受体上，诱导病毒囊膜和细胞膜融合[1]。此外，HA基因很容易发生变异，是病毒抗原变异的主要原因，HA还是病毒毒力和宿主特异性的主要决定因素[3]。
HA基因发生变异可能产生新的禽流感疫苗变异株，导致疫苗的免疫作用降低甚至消失，进而引发新的禽流感疫情，引起鸡群产蛋率下降甚至死亡，给蛋鸡养殖带来重大的经济损失[6]。更有甚者，该病毒能够通过变异与人的流感病毒受体结合，引发人的感染，给公共卫生安全带来隐患[4]。本研究中，我们从一个已进行多次免疫接种高致病性禽流感疫苗的蛋鸡养殖场中分离到H5N2亚型HPAIV，并对该病毒的HA基因进行分子进化分析，以期对我国的AIV进化提供新的论点，并对提高HPAIV的防控提供建议。
1 材料与方法
1.1 养殖场流行病学调查情况和样品的采集
该养鸡场位于红岛经济开发区河套街道办事处小涧西村，有多年的养鸡历史。目前存养海蓝褐320日龄蛋鸡11000只，分别饲养在1、2号鸡舍，100日龄育成鸡10000只，饲养在3号鸡舍。该鸡场育成鸡在2013年10月25日接种禽流感疫苗。产蛋鸡曾在2013年9月27日、11月25日、12月25日、1月8日接种禽流感疫苗（Re-4+Re-6）。1月11日开始1号鸡舍有零星死亡，之后，死亡量逐渐增加，主要集 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
中在1、2号鸡舍。病鸡表现眼脸肿胀、排黄绿稀便，产蛋鸡产蛋量下降，死亡，病死率为2.75%。剖检病死鸡有气管出血和腺胃乳头出血现象。死亡情况见表1。
时间1月11日1月12日1月13日1月14日1月15日1月16日合计
死亡只数215255060150302
2014年1月16日，青岛动物疫病预防与控制中心将采集的样品送往山东省疫控中心检测，当天下午检测结果显示，在18份送检样品中9份为H5亚型阳性（特异性100%）。结合临床观察、流行病学分析和实验室检测结果，确认为疑似H5亚型禽流感疫情。
2014年1月17日，在位于红岛经济开发区河套街道办事处小涧西村某蛋鸡养殖场采集咽喉、泄殖腔拭子样品30份。
采样时，用灭菌棉拭子采集表面健康鸡喉气管分泌液与泄殖腔分泌液（带有少量粪便），保存于终浓度为庆大霉素250 mg/L、左旋氧氟沙星60 mg/L和阿奇霉素60 mg/L的50%灭菌甘油PBS 2 mL离心管中，置于0-4℃冰盒内[2]。
1.2 主要的试剂与仪器
SPF鸡胚（购自山东省济南赛斯有限责任公司）；QIAamp Viral RNA Mini Kit （购于德国QIAGEN公司）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit，DL2 000（购于宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖（购于上海YiTo公司）；无水乙醇、甘油、6×Loading Buffer、核酸染料等其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。
生物安全柜（美国Forma Scientific）、高速台式离心机（德国HeraeusBiofugeprimoR）、PCR扩增仪（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）、微波炉（海尔）、电泳仪（东方特力工贸公司）、紫外光凝胶成像系统（美国GeneGenius UVP型）、电子天平（德国SartoriusBS-210S）、-70℃超低温冰箱（日本三洋 MDF-383E型）。
1.3 HA、NA基因引物设计与合成
根据GenBank上已经发表的禽流感病毒毒株参考序列，设计扩增HA、NA全长基因片段的引物，引物序列为：
HA：上游5’- TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG -3’
下游5’- ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAG -3’
NA：上游5’- TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAG -3’
下游5’- ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAG -3’
由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.4 病毒的增殖
将棉拭子置于25℃温箱，作用30 min后取出；10000 rpm离心10 min，取上清液200 μL，尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，并做好标记，封口后置37℃饱和湿度孵育，每12 h观察一次，弃去24 h内的死亡鸡胚，24～72 h死亡和未死亡鸡胚4℃放置过夜后，收集尿囊液，分装并置-70℃冰箱保存备用[5]。
1.5 血凝实验
1) 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加25 μL PBS；
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2) 分别吸取25 μL鸡胚尿囊液加入到第1列孔中，吹打3～5次充分混匀；
3) 从第1列孔吸取25 μL混匀后的尿囊液加到第2列孔中，混匀后吸取25 μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细胞对照；
4) 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液；
5) 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20～25℃）静置45 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。
HA试验结果判断时要求将板倾斜45度，观察沉集红细胞流淌情况（图1中C、D所示），凡是有流淌的都不能算成100％凝集[9]。本次实验血凝结果大于24则为阳性[15]。
1.6 病毒RNA的提取
用QIAamp Viral RNA Mini Kit进行病毒RNA的纯化提取，具体步骤如下：
1) 吸取560 μL的Buffer AVL加入到有carrier RNA的1.5 mL离心管中，混匀；
2) 将140 μL尿囊液加入到上述离心管中，斡旋15 s，混匀；
3) 室温放置10 min；
4) 瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；
5) 样品中加入560 μL无水乙醇，斡旋15 s充分混匀，瞬时离心；
6) 吸取630 μL上步中的溶液小心加入column（已放到2 mL离心管中），不要碰到柱子的边缘，8000 rpm离心1 min。离心后将column放入到新的2 mL离心管中，弃去旧的离心管；
3.2.2 疫苗接种后要进行免疫效果监测
应在家禽免疫后2l天用禽流感抗体血凝抑制试验进行免疫效果监测。（HI）抗体效价≥24判定为合格。存栏禽群免疫抗体合格率≥70％判定为合格[10]。
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