猪圆环病毒2型的起源与进化动力学分析及地区流行毒株全基因组序列分析(附件)
猪圆环病毒2型（PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原。本研究对PCV2的起源，分型和进化动力学展开了综合性分析，并监测了我国安徽地区的PCV2病毒流行情况。首次通过ORF1基因追溯PCV2的起源，结果显示PCV2可能起源于蝙蝠圆环病毒。此外，从NCBI收集1169条PCV2 ORF2，去除重组序列后对全球PCV2的流行情况进行系统发育分析，发现目前PCV2的主要基因型分为PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d，PCV2e五种基因型。进化动力学显示，PCV2的进化速率较高（9.34 x 10 - 4位点/年），接近于RNA病毒。同时，本研究所得的去重组序列数据库可为以后的PCV2基因分型提供参考。此外，本研究通过PCR方法对采集的安徽省疑似圆环感染症状猪的肺脏组织进行检测，PCV2检出率为37.04%（20/54），对阳性病料进行测序，共得到17条全集因组序列，最大似然法构建系统发育树显示，17株PCV2分别为PCV2d（64.71%，11/17）和PCV2b（35.29%，6/17）两种基因型。这可能预示PCV2d在安徽地区的流行中占据主导地位。本研究对我国和世界的PCV2流行情况加以分析，为日后的PCV2的防控，监测及研究提供参考。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1起源与进化动力学 4
1.1.1序列数据集 4
1.1.2序列比对与重组分析5
1.1.3系统发育与进化动力学分析5
1.1.4选择压力分析5
1.2安徽地区流行毒株全基因组序列分析5
1.2.1病料5
1.2.2主要试剂与材料5
1.2.3主要仪器与设备 5
1.3方法 5
1.3.1病料的处理5
1.3.2病毒核酸的提取5
1.3.3反转录PCR6
1.3.4病毒检测与扩增6
2 结果7
2.1起源7
2.2分型与进化动力学9
2.3选择压力分析9
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
4病毒检测10
2.5 PCR检测样型堵住全基因组的序列测定10
2.6 PCV2测序毒株序列分析10
3 讨论11
致谢12
参考文献12
猪圆环病毒2型起源与进化动力学分析以及我国安徽地区流行毒株全基因组序列分析
引言
猪圆环病毒（Porcine cicovirus, PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属成员，是已知的最小的哺乳动物病毒[1]。病毒粒子直径为17nm，呈20面体对称，无囊膜，以滚环方式复制。目前根据其致病性和抗原性差异分为：猪圆环病毒1型（PCV1），猪圆环病毒2型（PCV2），猪圆环病毒3型（PCV3）。PCV1无致病性，PCV2有致病性，PCV3的致病性尚未明确。1974年，Tischer I等就关注到了在传代细胞系ATCC CCL31中发现一种能引起细胞病变的不明颗粒，类似于乳多空病毒和细小病毒[2]，当时被以为是细胞污染物，直到1982年Tischer I等首次分离和鉴定，并命名为猪圆环病毒（Porcine Circovirus, PCV）[1]，研究表明这一种PCV广泛存在于猪群中，但对猪群不具有致病性。PCV2的首次命名在1996年[3]，随后被世界各国家和地区相继报道，但更早的PCV2感染案例能追溯到1962年的德国[4]。我国于2001年首次报道从猪群中分离出PCV2，并且各地分离的病毒基因序列具有高度相似性[5]。为区分这两种PCV，研究人员将最早发现的命名为PCV1，后发现的命名为PCV2。2016年Pallinski等在类似PDNS症状的猪群中检测到了一种新型的猪圆环病毒，将其命名为猪圆环病毒3型PCV3[6]。
PCV2基因组是一条环状单链DNA，大小为1766 1768nt，含有11个开发阅读框（ORF），其中主要ORF有三个，即ORF1、ORF2、ORF3[1]。ORF1编码与病毒复制有关的Rep蛋白，ORF2编码与病毒结构相关的Cap蛋白，ORF3编码与病毒毒力相关的蛋白。PCV2目前以报道的主要基因型有5种：PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d，PCV2e。其中PCV2c在丹麦有报道[7]，后来在巴西的野猪中也有发现[8]，PCV2e只在美国和墨西哥有报道[9]，而PCV2a、PCV2b、PCV2d目前在世界各国流行。最先被确定的基因型为PCV2a，因此大多数商用疫苗是基于PCV2a而设计生产的。直到2003年（甚至更早），PCV2的主要流行基因型从PCV2a转为PCV2b[10]。2005年，PCV2b成为了北美地区的主要流行毒株，并伴随着严重的高致病、高发病和高死亡率[11]。这表明PCV2b相比于PCV2a可能更适应环境和宿主。Dupont等称澳大利亚的猪群中只发现PCV2a，并且无PMWS存在，因此推断PMWS的爆发与PCV2a到PCV2d的改变有关[12]。PCV2d于2002年在中国首次发现，2008年报道，PCV2d的毒力比2002年有所增强[1315]。2012年PCV2d在亚洲其他国家、欧洲以及南美洲被发现。2014年PCV2e于墨西哥首次报道，2015年美国也报道了PCV2e[9]。2008年，欧洲PCVD委员会（www.pcvd.eu）提出以邻接（NJ）树的p distance模型来鉴别PCV2的基因型，基于全基因组的分型标准为p distance的值大于0.02就可以定义为一个新的基因型，基于ORF2基因的分型标准为p distance的值大于0.035就可以定义为一个新的基因型[16]。PCV2在世界多个国家流行，随着时间测推移，PCV2的全基因和ORF2的序列数量越来越多，欧洲圆环委员会提出的分型标准受到了许多学者的质疑[13, 17]。
在中国，自PCV2首次报道以来，全国各地的猪场均有发生和感染PCV2病例的报道,PCV2的感染率很高，某些猪场甚至出现感染率为100%的情况，但是感染PCV2的猪致死率不高，能表现临床症状的大约在5 30%[18]。对2001年 2009年在中国分离到的PCV2病毒进行系统发育分析，结构显示自2005年起，分离到的几乎所有PCV2均为PCV2d基因型，而PCV2a基因型越来越少[15, 19]。2001年之前，我国猪场的主要流行的基因型为PCV2a，自2002年，PCV2b占据了主要流行地位，在一段时间内，出现PCV2a与PCV2b的共同流行。2010年，PCV2d在中国的感染率逐年上升，优势毒株由PCV2b逐渐转向PCV2d，目前PCV2d已经成为中国主要的流行基因型。徐等人对河南地区2011年至2015年收集的28份疑似感染PCV2的病料进行检测，21株PCV2中16株为PCV2d，显示河南地区的流行毒株逐渐由PCV2d所取代[20]。目前，我国的PCV2流行情况较为复杂，PCV2感染率高（2013年到2014年四川省的感染率为71.55%，2013年到2015年闽南地区的感染率为93.00%），并且出现与其他病毒混合感染的病例[21]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1起源与进化动力学 4
1.1.1序列数据集 4
1.1.2序列比对与重组分析5
1.1.3系统发育与进化动力学分析5
1.1.4选择压力分析5
1.2安徽地区流行毒株全基因组序列分析5
1.2.1病料5
1.2.2主要试剂与材料5
1.2.3主要仪器与设备 5
1.3方法 5
1.3.1病料的处理5
1.3.2病毒核酸的提取5
1.3.3反转录PCR6
1.3.4病毒检测与扩增6
2 结果7
2.1起源7
2.2分型与进化动力学9
2.3选择压力分析9
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
4病毒检测10
2.5 PCR检测样型堵住全基因组的序列测定10
2.6 PCV2测序毒株序列分析10
3 讨论11
致谢12
参考文献12
猪圆环病毒2型起源与进化动力学分析以及我国安徽地区流行毒株全基因组序列分析
引言
猪圆环病毒（Porcine cicovirus, PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属成员，是已知的最小的哺乳动物病毒[1]。病毒粒子直径为17nm，呈20面体对称，无囊膜，以滚环方式复制。目前根据其致病性和抗原性差异分为：猪圆环病毒1型（PCV1），猪圆环病毒2型（PCV2），猪圆环病毒3型（PCV3）。PCV1无致病性，PCV2有致病性，PCV3的致病性尚未明确。1974年，Tischer I等就关注到了在传代细胞系ATCC CCL31中发现一种能引起细胞病变的不明颗粒，类似于乳多空病毒和细小病毒[2]，当时被以为是细胞污染物，直到1982年Tischer I等首次分离和鉴定，并命名为猪圆环病毒（Porcine Circovirus, PCV）[1]，研究表明这一种PCV广泛存在于猪群中，但对猪群不具有致病性。PCV2的首次命名在1996年[3]，随后被世界各国家和地区相继报道，但更早的PCV2感染案例能追溯到1962年的德国[4]。我国于2001年首次报道从猪群中分离出PCV2，并且各地分离的病毒基因序列具有高度相似性[5]。为区分这两种PCV，研究人员将最早发现的命名为PCV1，后发现的命名为PCV2。2016年Pallinski等在类似PDNS症状的猪群中检测到了一种新型的猪圆环病毒，将其命名为猪圆环病毒3型PCV3[6]。
PCV2基因组是一条环状单链DNA，大小为1766 1768nt，含有11个开发阅读框（ORF），其中主要ORF有三个，即ORF1、ORF2、ORF3[1]。ORF1编码与病毒复制有关的Rep蛋白，ORF2编码与病毒结构相关的Cap蛋白，ORF3编码与病毒毒力相关的蛋白。PCV2目前以报道的主要基因型有5种：PCV2a，PCV2b，PCV2c，PCV2d，PCV2e。其中PCV2c在丹麦有报道[7]，后来在巴西的野猪中也有发现[8]，PCV2e只在美国和墨西哥有报道[9]，而PCV2a、PCV2b、PCV2d目前在世界各国流行。最先被确定的基因型为PCV2a，因此大多数商用疫苗是基于PCV2a而设计生产的。直到2003年（甚至更早），PCV2的主要流行基因型从PCV2a转为PCV2b[10]。2005年，PCV2b成为了北美地区的主要流行毒株，并伴随着严重的高致病、高发病和高死亡率[11]。这表明PCV2b相比于PCV2a可能更适应环境和宿主。Dupont等称澳大利亚的猪群中只发现PCV2a，并且无PMWS存在，因此推断PMWS的爆发与PCV2a到PCV2d的改变有关[12]。PCV2d于2002年在中国首次发现，2008年报道，PCV2d的毒力比2002年有所增强[1315]。2012年PCV2d在亚洲其他国家、欧洲以及南美洲被发现。2014年PCV2e于墨西哥首次报道，2015年美国也报道了PCV2e[9]。2008年，欧洲PCVD委员会（www.pcvd.eu）提出以邻接（NJ）树的p distance模型来鉴别PCV2的基因型，基于全基因组的分型标准为p distance的值大于0.02就可以定义为一个新的基因型，基于ORF2基因的分型标准为p distance的值大于0.035就可以定义为一个新的基因型[16]。PCV2在世界多个国家流行，随着时间测推移，PCV2的全基因和ORF2的序列数量越来越多，欧洲圆环委员会提出的分型标准受到了许多学者的质疑[13, 17]。
在中国，自PCV2首次报道以来，全国各地的猪场均有发生和感染PCV2病例的报道,PCV2的感染率很高，某些猪场甚至出现感染率为100%的情况，但是感染PCV2的猪致死率不高，能表现临床症状的大约在5 30%[18]。对2001年 2009年在中国分离到的PCV2病毒进行系统发育分析，结构显示自2005年起，分离到的几乎所有PCV2均为PCV2d基因型，而PCV2a基因型越来越少[15, 19]。2001年之前，我国猪场的主要流行的基因型为PCV2a，自2002年，PCV2b占据了主要流行地位，在一段时间内，出现PCV2a与PCV2b的共同流行。2010年，PCV2d在中国的感染率逐年上升，优势毒株由PCV2b逐渐转向PCV2d，目前PCV2d已经成为中国主要的流行基因型。徐等人对河南地区2011年至2015年收集的28份疑似感染PCV2的病料进行检测，21株PCV2中16株为PCV2d，显示河南地区的流行毒株逐渐由PCV2d所取代[20]。目前，我国的PCV2流行情况较为复杂，PCV2感染率高（2013年到2014年四川省的感染率为71.55%，2013年到2015年闽南地区的感染率为93.00%），并且出现与其他病毒混合感染的病例[21]。
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