优化猪胚胎Cryotop冷冻保存技术
优化猪胚胎Cryotop冷冻保存技术[20200510204815]
摘要: 在过去的几年中，玻璃化冷冻在人和动物胚胎学领域，已经被认为是可替代传统慢速冷冻的一种非常有效的方法。Cryotop是当前使用最广泛的玻璃化冷冻方式之一，可以很大程度上提高猪胚胎的冷冻效率。为对猪胚胎Cryotop冷冻保存技术做进一步优化，在第一阶段的实验中，分别在孤雌激活（D0）后第4天（D4）、第5天（D5）、第6天（D6）对胚胎进行Cryotop冷冻/复苏，随后将这些胚胎培养24h，观察记录它们在解冻后0h、6h、12h以及24h的复苏情况，并统计其第七天（D7）的囊胚率，进而验证体外发育胚胎的最佳冷冻时间D(x)。在第二阶段的实验中，卵母细胞成熟后被随机平均分成去脂组/非去脂组，去脂组中的卵母细胞在离心去脂后，与非去脂组卵母细胞分别进行孤雌激活、体外培养，并于最佳冷冻时间前后，即孤雌激活（D0）后D(x-1)、D(x)、D(x+1)，进行Cryotop冷冻/复苏，随后两组胚胎的24h培养、复苏情况观察，以及第七天（D7）囊胚率的统计均与第一阶段中相同。至今本实验先后进行了10批共20余次，255枚胚胎用于冷冻。除4月20日冷冻的孤雌激活后第六日（D6）的12枚囊胚中，复苏后有2枚重新形成囊胚腔（复苏囊胚率16.67%），其余批次冷冻的胚胎全部死亡。由于在验证阶段的实验中冷冻的胚胎一直未能成功复苏，因此，没有得到关于确定体外发育胚胎最佳冷冻时间的任何可用数据，进而去脂处理对照试验并未开展。通过本实验，可熟练掌握猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活技术，并能熟悉猪胚胎的玻璃化冷冻技术，从而为Cryotop冷冻技术的优化提供一种思路。
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关键字:猪；孤雌激活；玻璃化冷冻；损伤；优化
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract. 3
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 实验动物 5
1.1.2主要实验试剂 5
1.2 方法 5
1.2.1 制备孤雌激活胚胎 6
1.2.2 冷冻和复苏 6
1.2.3 胚胎发育观察并确定体外发育胚胎最佳冷冻时间 6
1.2.4 离心去脂对照实验 6
1.3 数据分析 6
2 结果与分析 7
3 讨论 8
4 结论 9
致谢 9
参考文献： 10
优化猪胚胎Cryotop冷冻保存技术
引言
引言：猪胚胎保存对增加高质量遗传资源的高效利用，阻止疾病通过动物传播以及降低猪的运输成本具有重要意义[1]。但猪胚胎中含有大量的脂肪颗粒，使其对于低温敏感性极高。常温下，脂肪滴均匀分散分布于猪卵子和胚胎中，其空间结构在4-5℃时发生相互聚集的趋势。低于0℃时大量脂肪滴溢出，膜破裂，细胞崩解[2]。因而，与其他哺乳动物相比，猪胚胎的冷冻保存受到极大地限制[3,4]，从而猪胚胎冷冻一直是一个难题，也没有得到广泛应用。
当前，由于传统的慢速冷冻程序不能为猪胚胎的冷冻保存提供令人满意的结果，玻璃化冷冻被视作可替代传统慢速冷冻的一个十分有效的方法。在一些实验室中，玻璃化冷冻体系的发展已经实现了预处理（去脂或细胞松弛素处理）或未处理冷冻/复苏的猪胚胎移植后仔猪的出生[5-12]。但许多因素影响玻璃化冷冻后猪胚胎的存活，如胚胎发育阶段[11]，冷冻保 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
护剂毒性[13]，冷冻液组成[6,14]，以及冷冻和复苏速率。不同发育阶段猪胚胎，其脂滴含量会发生变化，进而导致对于冷冻保存的敏感性不同，发育阶段越早，其冷冻耐受力越低。猪已孵化的囊胚和近孵化阶段的囊胚可以在没有特殊胚胎预处理的情况下忍受慢速冷冻（2-50%体外存活；Berthelot et al综述。[15]），而其桑椹胚和早期囊胚不能在该冷冻保存程序中存活[17]。当未处理的早期到已孵化囊胚阶段的胚胎用于冷冻保存时，玻璃化冷冻可以实现复苏后更高的存活率（33-90%）[6,12,16,17] 。然而，尽管未处理的桑椹胚可以存活于玻璃化冷冻，其体外孵化率仍然比从囊胚获得的更低[6]。对于体外培养的猪胚胎其脂滴密度可能比体内胚胎更高[18]，并且体外培养的时间会增加脂质含量[19]，更高的脂质含量进而会减少胚胎冷冻保存后的存活[20]。此外，Khurana和Niemann[21]阐明猪体内胚胎的代谢水平和冷冻耐受均高于体外胚胎，体外培养仅24h后，胚胎的代谢水平和冷冻耐受就将减少。2012年Rong Li等[22]研究表明，孤雌激活（D0）后第四天（D4）为猪胚胎冷冻的最佳时期。
冷冻速率似乎是胚胎玻璃化冷冻中的一个关键因素。冷冻速率的增加可以减少冷冻损伤[23,24]并且可以允许冷冻保护剂浓度的减少[25]。直到最近，几种样本的胚胎已经被冷冻于0.25ml体积的吸管中，这些吸管可以把冷冻速率限制到2500℃/min以下[27]。而通过使用新的器皿如开放式拉管（OPS；[26]）玻璃化冷冻程序的成功率得以进一步增加。与0.25ml吸管相比，OPS将冷冻速率增加了大约8倍。在过去的10年中，至少有20中不同的玻璃化冷冻方式被推出[27]。在这些冷冻方式中很多都是先前技术轻微修饰后的复制品，相关工作者希望从根本上减少对冷冻方式的选择，以使冷冻工作标准化，并完全发挥出玻璃化冷冻的真正优势。Cryotop是当前使用最广泛的玻璃化冷冻方式之一，装置易购买，待用溶液也易提供[28,29]。2012年，Ying Liu等[30]证明，相较OPS法，Cryotop法具有冷冻速度更快、在液氮中的体积暴露比更高、渗透性保护剂浓度更低，溶液补充物（如SSS）更优，冷冻复苏率更高等优点。对于高敏感性生物标本（包括猪卵母细胞）的冷冻保存，Cryotop玻璃化冷冻优于OPS技术。然而，Cryotop的冷冻效率仍没有达到最理想状态，其距推广应用尚有一定距离。
有研究表明，冻前对猪胚胎进行一些如添加细胞松弛素、离心或离心去脂等辅助处理，可以有效提高其冷冻效率[31]。2013年，许惠艳等[2]证明，离心处理孤雌激活后第3天的猪胚胎，其到囊胚的发育不受影响，且冷冻后的复苏率及胚胎内细胞团数较好。目前还没有对孤雌激活前离心去脂的猪胚胎，进行Cryotop冷冻的效果的讨论。因此本研究以体外成熟卵子经孤雌激活所获胚胎为研究模型，试图在现有Cryotop的玻璃化冷冻技术的基础上，通过统计离心去脂胚胎不同发育阶段进行的冷冻效果，优化Cryotop玻璃化冷冻体系，以期提高猪胚胎冷冻成功率，为猪胚胎的冷冻保存提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物 卵巢从南京枫勇食品有限公司采取，保存于37℃加有青链霉素生理盐水的保温瓶中，四小时内运回实验室。
1.1.2主要实验试剂 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
T2：TCM199中添加2%的牛血清(CS)，4℃保存。
T20：TCM199中添加20%的牛血清(CS)，4℃保存。
HYA：透明质酸酶，溶解于TCM199中，1.0mg/ml，0.22μm滤器过滤，-20℃冷冻保存。
PCC：由PZM3、放线菌酮(CHX)、细胞松弛素(CB)按体积比1000：10：1配制，用于化学激活。
洗 液(WS)：TCM199+20%血清(Serum)
平衡液(ES)：10%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)+TCM199+20%牛血清(CS)
冷冻液(VS)：18% EG+18% DMSO+0.5M蔗糖(suc)+TCM199+20%CS
解冻液(TS)：1.0 M suc+M199+20%CS
缓冲液(DS)：0.5 M suc +M199 + 20%CS
洗 液(Ws1,Ws2)：M199+20%CS
1.2 方法
本实验的实验设计如图1所示：
1.2.1 制备孤雌激活胚胎 从屠宰场采集猪卵巢，用带18号针头的20ml一次性灭菌注射器从卵巢上直径为2-6mm的卵泡中吸取卵丘卵母细胞复合物(COCs)。选出致密并且带有至少两层卵丘细胞的COCs放入四孔盘中，在38.5℃、5%CO2，饱和湿度的条件下体外成熟（IVM）培养42-44h。IVM培养液为：碳酸氢盐-缓冲TCM199+10%(v/v)胎牛血清(FBS；四季青)+10%(v/v)母猪卵泡液+15IU/ml PMSG+15IU/ml HCG+75μg/ml青霉素G钾+50μg/ml硫酸链霉素。
成熟培养后，将排出第一极体的卵母细胞移入38.5℃预热的激活液中平衡3-5分钟，随后移入装有激活液的直径为0.5mm的电融槽中，用BLS细胞激活仪在设定后的参数（63V/80us）下进行电激活。
图3为4月20日冷冻的孤雌激活后第六日（D6）胚胎解冻后0h、6h、12h以及24h的复苏情况。本次实验共冷冻囊胚12枚，其中2枚在解冻后24h完全复苏。
摘要: 在过去的几年中，玻璃化冷冻在人和动物胚胎学领域，已经被认为是可替代传统慢速冷冻的一种非常有效的方法。Cryotop是当前使用最广泛的玻璃化冷冻方式之一，可以很大程度上提高猪胚胎的冷冻效率。为对猪胚胎Cryotop冷冻保存技术做进一步优化，在第一阶段的实验中，分别在孤雌激活（D0）后第4天（D4）、第5天（D5）、第6天（D6）对胚胎进行Cryotop冷冻/复苏，随后将这些胚胎培养24h，观察记录它们在解冻后0h、6h、12h以及24h的复苏情况，并统计其第七天（D7）的囊胚率，进而验证体外发育胚胎的最佳冷冻时间D(x)。在第二阶段的实验中，卵母细胞成熟后被随机平均分成去脂组/非去脂组，去脂组中的卵母细胞在离心去脂后，与非去脂组卵母细胞分别进行孤雌激活、体外培养，并于最佳冷冻时间前后，即孤雌激活（D0）后D(x-1)、D(x)、D(x+1)，进行Cryotop冷冻/复苏，随后两组胚胎的24h培养、复苏情况观察，以及第七天（D7）囊胚率的统计均与第一阶段中相同。至今本实验先后进行了10批共20余次，255枚胚胎用于冷冻。除4月20日冷冻的孤雌激活后第六日（D6）的12枚囊胚中，复苏后有2枚重新形成囊胚腔（复苏囊胚率16.67%），其余批次冷冻的胚胎全部死亡。由于在验证阶段的实验中冷冻的胚胎一直未能成功复苏，因此，没有得到关于确定体外发育胚胎最佳冷冻时间的任何可用数据，进而去脂处理对照试验并未开展。通过本实验，可熟练掌握猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活技术，并能熟悉猪胚胎的玻璃化冷冻技术，从而为Cryotop冷冻技术的优化提供一种思路。
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关键字:猪；孤雌激活；玻璃化冷冻；损伤；优化
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract. 3
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.1.1 实验动物 5
1.1.2主要实验试剂 5
1.2 方法 5
1.2.1 制备孤雌激活胚胎 6
1.2.2 冷冻和复苏 6
1.2.3 胚胎发育观察并确定体外发育胚胎最佳冷冻时间 6
1.2.4 离心去脂对照实验 6
1.3 数据分析 6
2 结果与分析 7
3 讨论 8
4 结论 9
致谢 9
参考文献： 10
优化猪胚胎Cryotop冷冻保存技术
引言
引言：猪胚胎保存对增加高质量遗传资源的高效利用，阻止疾病通过动物传播以及降低猪的运输成本具有重要意义[1]。但猪胚胎中含有大量的脂肪颗粒，使其对于低温敏感性极高。常温下，脂肪滴均匀分散分布于猪卵子和胚胎中，其空间结构在4-5℃时发生相互聚集的趋势。低于0℃时大量脂肪滴溢出，膜破裂，细胞崩解[2]。因而，与其他哺乳动物相比，猪胚胎的冷冻保存受到极大地限制[3,4]，从而猪胚胎冷冻一直是一个难题，也没有得到广泛应用。
当前，由于传统的慢速冷冻程序不能为猪胚胎的冷冻保存提供令人满意的结果，玻璃化冷冻被视作可替代传统慢速冷冻的一个十分有效的方法。在一些实验室中，玻璃化冷冻体系的发展已经实现了预处理（去脂或细胞松弛素处理）或未处理冷冻/复苏的猪胚胎移植后仔猪的出生[5-12]。但许多因素影响玻璃化冷冻后猪胚胎的存活，如胚胎发育阶段[11]，冷冻保 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
护剂毒性[13]，冷冻液组成[6,14]，以及冷冻和复苏速率。不同发育阶段猪胚胎，其脂滴含量会发生变化，进而导致对于冷冻保存的敏感性不同，发育阶段越早，其冷冻耐受力越低。猪已孵化的囊胚和近孵化阶段的囊胚可以在没有特殊胚胎预处理的情况下忍受慢速冷冻（2-50%体外存活；Berthelot et al综述。[15]），而其桑椹胚和早期囊胚不能在该冷冻保存程序中存活[17]。当未处理的早期到已孵化囊胚阶段的胚胎用于冷冻保存时，玻璃化冷冻可以实现复苏后更高的存活率（33-90%）[6,12,16,17] 。然而，尽管未处理的桑椹胚可以存活于玻璃化冷冻，其体外孵化率仍然比从囊胚获得的更低[6]。对于体外培养的猪胚胎其脂滴密度可能比体内胚胎更高[18]，并且体外培养的时间会增加脂质含量[19]，更高的脂质含量进而会减少胚胎冷冻保存后的存活[20]。此外，Khurana和Niemann[21]阐明猪体内胚胎的代谢水平和冷冻耐受均高于体外胚胎，体外培养仅24h后，胚胎的代谢水平和冷冻耐受就将减少。2012年Rong Li等[22]研究表明，孤雌激活（D0）后第四天（D4）为猪胚胎冷冻的最佳时期。
冷冻速率似乎是胚胎玻璃化冷冻中的一个关键因素。冷冻速率的增加可以减少冷冻损伤[23,24]并且可以允许冷冻保护剂浓度的减少[25]。直到最近，几种样本的胚胎已经被冷冻于0.25ml体积的吸管中，这些吸管可以把冷冻速率限制到2500℃/min以下[27]。而通过使用新的器皿如开放式拉管（OPS；[26]）玻璃化冷冻程序的成功率得以进一步增加。与0.25ml吸管相比，OPS将冷冻速率增加了大约8倍。在过去的10年中，至少有20中不同的玻璃化冷冻方式被推出[27]。在这些冷冻方式中很多都是先前技术轻微修饰后的复制品，相关工作者希望从根本上减少对冷冻方式的选择，以使冷冻工作标准化，并完全发挥出玻璃化冷冻的真正优势。Cryotop是当前使用最广泛的玻璃化冷冻方式之一，装置易购买，待用溶液也易提供[28,29]。2012年，Ying Liu等[30]证明，相较OPS法，Cryotop法具有冷冻速度更快、在液氮中的体积暴露比更高、渗透性保护剂浓度更低，溶液补充物（如SSS）更优，冷冻复苏率更高等优点。对于高敏感性生物标本（包括猪卵母细胞）的冷冻保存，Cryotop玻璃化冷冻优于OPS技术。然而，Cryotop的冷冻效率仍没有达到最理想状态，其距推广应用尚有一定距离。
有研究表明，冻前对猪胚胎进行一些如添加细胞松弛素、离心或离心去脂等辅助处理，可以有效提高其冷冻效率[31]。2013年，许惠艳等[2]证明，离心处理孤雌激活后第3天的猪胚胎，其到囊胚的发育不受影响，且冷冻后的复苏率及胚胎内细胞团数较好。目前还没有对孤雌激活前离心去脂的猪胚胎，进行Cryotop冷冻的效果的讨论。因此本研究以体外成熟卵子经孤雌激活所获胚胎为研究模型，试图在现有Cryotop的玻璃化冷冻技术的基础上，通过统计离心去脂胚胎不同发育阶段进行的冷冻效果，优化Cryotop玻璃化冷冻体系，以期提高猪胚胎冷冻成功率，为猪胚胎的冷冻保存提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物 卵巢从南京枫勇食品有限公司采取，保存于37℃加有青链霉素生理盐水的保温瓶中，四小时内运回实验室。
1.1.2主要实验试剂 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
T2：TCM199中添加2%的牛血清(CS)，4℃保存。
T20：TCM199中添加20%的牛血清(CS)，4℃保存。
HYA：透明质酸酶，溶解于TCM199中，1.0mg/ml，0.22μm滤器过滤，-20℃冷冻保存。
PCC：由PZM3、放线菌酮(CHX)、细胞松弛素(CB)按体积比1000：10：1配制，用于化学激活。
洗 液(WS)：TCM199+20%血清(Serum)
平衡液(ES)：10%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)+TCM199+20%牛血清(CS)
冷冻液(VS)：18% EG+18% DMSO+0.5M蔗糖(suc)+TCM199+20%CS
解冻液(TS)：1.0 M suc+M199+20%CS
缓冲液(DS)：0.5 M suc +M199 + 20%CS
洗 液(Ws1,Ws2)：M199+20%CS
1.2 方法
本实验的实验设计如图1所示：
1.2.1 制备孤雌激活胚胎 从屠宰场采集猪卵巢，用带18号针头的20ml一次性灭菌注射器从卵巢上直径为2-6mm的卵泡中吸取卵丘卵母细胞复合物(COCs)。选出致密并且带有至少两层卵丘细胞的COCs放入四孔盘中，在38.5℃、5%CO2，饱和湿度的条件下体外成熟（IVM）培养42-44h。IVM培养液为：碳酸氢盐-缓冲TCM199+10%(v/v)胎牛血清(FBS；四季青)+10%(v/v)母猪卵泡液+15IU/ml PMSG+15IU/ml HCG+75μg/ml青霉素G钾+50μg/ml硫酸链霉素。
成熟培养后，将排出第一极体的卵母细胞移入38.5℃预热的激活液中平衡3-5分钟，随后移入装有激活液的直径为0.5mm的电融槽中，用BLS细胞激活仪在设定后的参数（63V/80us）下进行电激活。
图3为4月20日冷冻的孤雌激活后第六日（D6）胚胎解冻后0h、6h、12h以及24h的复苏情况。本次实验共冷冻囊胚12枚，其中2枚在解冻后24h完全复苏。
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