华东地区猪流行性腹泻病毒的ptpcr鉴定和s基因序列比较
猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科，冠状病毒属的成员,是对养猪业危害极大的病原之一。患猪以呕吐，腹泻，脱水为主要临床症状，仔猪感染致死率高。近年来，该病发病率呈上升态势，且疫苗的免疫效果不佳。据相关研究发现，该病毒的基因的变异可能是导致疫苗免疫失败的重要原因。本文以华东部分地区10例疑似猪流行性腹泻病死仔猪的病变组织为样本，分别用一步法和两步法RT-PCR对猪流行性腹泻病毒的S基因进行了检测，并对阳性条带进行了测序分析。通过NCBI网站的序列对比，我们检测到的病毒S基因与基因库中的序列相似度最低只有97%，有18个碱基出现了突变或缺失，说明当前疫苗株免疫效果不佳的原因可能与S基因的变异有关。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1病料2
1.1.2主要试剂和仪器2
1.1.3引物设计与合成3
1.2方法3
1.2.1技术路线3
1.2.2样品处理3
1.2.3疑似病料的PTPCR检测3
1.2.3.1病毒总RNA的提取3
1.2.3.2反转录的体系与实验条件4
1.2.2.3 PCR扩增体系及反应条件4
2.2.3.4琼脂糖凝胶电泳4
2.2.3.5 目的基因片段的胶回收和纯化4
2.2.3.6测序分析5
3. 结果5
3.1 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定5
3.2 阳性条带序列分析5
4. 讨论7
4.1 PEDV的S基因变异7
4.2 实验体系的优化7
4.3 多种检测方法7
5致谢8 华东地区猪流行性腹泻病毒的RTPCR鉴定和S基因序列比较分析
动物医学院 董亚伦
引言
前言
猪流行性腹泻是近年来对国内外养猪行业威胁极大的急性传染病，且在我国各大省份均有爆发，特别是在2010年后，该病对中国养猪业造成了巨大的损失。对养猪行业 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
的危害主要如下：（1）7日龄以下仔猪，感染后死亡率为100%。即使部分发病较轻的仔猪康复后，也会生长缓慢，成为僵猪（2）导致日龄较大仔猪掉膘（3）降低饲料报酬，提高养殖成本。（4）导致机体抵抗力降低，易感染其他疾病。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的的一种急性，传染性胃肠道疾病，主要以呕吐，腹泻，脱水为临床特征，各年龄段仔猪均易感染，对感染仔猪的致死率高达80%~100%。发病猪大都食欲减退，体温升高，精神沉郁。临床上以呕吐，腹泻，脱水为主要表现。一般在吮乳或进食后发生呕吐（与TEG相似）。新生仔猪死亡率高达100%[1]其他年龄段仔猪发病后一般在约1周后恢复，死亡较少。PEDV的病理变化主要集中在小肠，肠壁变薄透明，有黄色水样粪便充盈，肠粘膜有出血点。组织学研究表明：小肠区域会出现肠绒毛的浸润与融合。病理变化与TGEV相似[2]。该病毒是通过感染，破坏小肠上皮细胞，导致机体对营养物质的吸收能力下降，进而引发腹泻。且随着病毒对肠上皮细胞的破坏，腹泻会越来越严重。由于引起的腹泻均为渗出性腹泻，严重的腹泻会导致脱水，最终病猪会因衰竭而死。所以，对该病的研究对实际生产有较大意义。
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于冠状病毒科，冠状病毒属。在病毒粒子形态特征上，PEDV和其他冠状病毒相似。病毒粒子平均直径为130 nm，具有多形性，但是以球形为主，有囊膜。PEDV是有囊膜不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为28nt。PEDV基因组5’端有帽子结构，3’端有Poly(A)尾巴；由5’非编区（5’untranslated region, UTR）、6个开放阅读框（open reading frames, ORFs）和3’UTR组成[3]。该病毒的6个ORF分别为Replicase(ORF1)基因,S基因,ORF3基因,E基因,M基因和N基因，其中的S、E、M和N基因分别代表纤突（Spike，S）蛋白、小膜（Envelope，E）蛋白、膜（Membrane，M）蛋白、核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋白。Replicase基因编码多聚蛋白（Polyprotein 1ab，PP1ab）。ORF3基因编码的蛋白为ns3蛋白，由于该蛋白位于S蛋白与E蛋白之间，该蛋白又被称为SNE蛋白[4]。
猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白是一种分子量约为180200 kDa的大分子糖蛋白,属于I型膜融合蛋白,以三聚体的形式形成纤突存在于病毒粒子的表面。S蛋白可被宿主衍生性的蛋白酶消化成S1亚基和S2亚基两部分。S1亚基是结合PEDV的特异性受体,而S2亚基主要负责病毒与特异性受体结合后的膜融合活动[5][6]。Duarte等研究学者早在1994年就发现S蛋白有3个比较特别的结构域,其中的外部结构域是受体结合域,含有诱导宿主机体产生抗体的抗原表位,并在这个区域和宿主细胞表面大分子结合。近年来国内外不断有学者对PEDV的S基因进行遗传进化分析。相关测序结果均显示，我国各地方株基因组的S基因序列,与欧洲毒株CV777株,以及国内早期的毒株相比，差异较为明显，但与韩国毒株保持着较高的同源性[7]。
大量实验研究表明，S蛋白有着调节诱导病毒进入细胞,刺激被感染的自然宿主产生中和抗体的作用[8]，以S基因作为靶基因的载体均能刺激动物机体产生较好的免疫反应[2]，因此S基因成为基因工程疫苗研究的一个重要的靶基因。不仅如此,S蛋白在机体的免疫中起到的重要作用还体现在该病毒的体外适应生长和宿主内毒力的致弱等方面 [9]。早在20世纪90年代，我国哈尔滨兽医研究所就研制出了TGEVPEDV二联苗和弱毒苗，该疫苗一直沿用至今，对防治流行性腹泻起到了十分重要的作用。近年来，流行性腹泻呈高发趋势，国内外专家学者发现该病毒出现了新的变种。通过流行病学调查发现，S基因，ORF3基因等均发生较大变异，这可能是免疫效果不佳的主要原因。所以现在急需开发新疫苗。
本实验就是针对华东部分地区毒株的S基因进行序列的扩增和测序比较，了解其遗传特点，为今后对该病的防治工作，特别是新型疫苗研制方面提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1病料：
本次进行PEDV分离鉴定的病料是于2015年3月至5月间在江苏、山东和安徽3省的10个地区(表1)疑似发病的猪场取得。病料样本包括7份小肠组织和3份血样，图1为部分病理剖检照片。
表1 病料的采集
Table 1 Collection of sample
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1病料2
1.1.2主要试剂和仪器2
1.1.3引物设计与合成3
1.2方法3
1.2.1技术路线3
1.2.2样品处理3
1.2.3疑似病料的PTPCR检测3
1.2.3.1病毒总RNA的提取3
1.2.3.2反转录的体系与实验条件4
1.2.2.3 PCR扩增体系及反应条件4
2.2.3.4琼脂糖凝胶电泳4
2.2.3.5 目的基因片段的胶回收和纯化4
2.2.3.6测序分析5
3. 结果5
3.1 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定5
3.2 阳性条带序列分析5
4. 讨论7
4.1 PEDV的S基因变异7
4.2 实验体系的优化7
4.3 多种检测方法7
5致谢8 华东地区猪流行性腹泻病毒的RTPCR鉴定和S基因序列比较分析
动物医学院 董亚伦
引言
前言
猪流行性腹泻是近年来对国内外养猪行业威胁极大的急性传染病，且在我国各大省份均有爆发，特别是在2010年后，该病对中国养猪业造成了巨大的损失。对养猪行业 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
的危害主要如下：（1）7日龄以下仔猪，感染后死亡率为100%。即使部分发病较轻的仔猪康复后，也会生长缓慢，成为僵猪（2）导致日龄较大仔猪掉膘（3）降低饲料报酬，提高养殖成本。（4）导致机体抵抗力降低，易感染其他疾病。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的的一种急性，传染性胃肠道疾病，主要以呕吐，腹泻，脱水为临床特征，各年龄段仔猪均易感染，对感染仔猪的致死率高达80%~100%。发病猪大都食欲减退，体温升高，精神沉郁。临床上以呕吐，腹泻，脱水为主要表现。一般在吮乳或进食后发生呕吐（与TEG相似）。新生仔猪死亡率高达100%[1]其他年龄段仔猪发病后一般在约1周后恢复，死亡较少。PEDV的病理变化主要集中在小肠，肠壁变薄透明，有黄色水样粪便充盈，肠粘膜有出血点。组织学研究表明：小肠区域会出现肠绒毛的浸润与融合。病理变化与TGEV相似[2]。该病毒是通过感染，破坏小肠上皮细胞，导致机体对营养物质的吸收能力下降，进而引发腹泻。且随着病毒对肠上皮细胞的破坏，腹泻会越来越严重。由于引起的腹泻均为渗出性腹泻，严重的腹泻会导致脱水，最终病猪会因衰竭而死。所以，对该病的研究对实际生产有较大意义。
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于冠状病毒科，冠状病毒属。在病毒粒子形态特征上，PEDV和其他冠状病毒相似。病毒粒子平均直径为130 nm，具有多形性，但是以球形为主，有囊膜。PEDV是有囊膜不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为28nt。PEDV基因组5’端有帽子结构，3’端有Poly(A)尾巴；由5’非编区（5’untranslated region, UTR）、6个开放阅读框（open reading frames, ORFs）和3’UTR组成[3]。该病毒的6个ORF分别为Replicase(ORF1)基因,S基因,ORF3基因,E基因,M基因和N基因，其中的S、E、M和N基因分别代表纤突（Spike，S）蛋白、小膜（Envelope，E）蛋白、膜（Membrane，M）蛋白、核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋白。Replicase基因编码多聚蛋白（Polyprotein 1ab，PP1ab）。ORF3基因编码的蛋白为ns3蛋白，由于该蛋白位于S蛋白与E蛋白之间，该蛋白又被称为SNE蛋白[4]。
猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白是一种分子量约为180200 kDa的大分子糖蛋白,属于I型膜融合蛋白,以三聚体的形式形成纤突存在于病毒粒子的表面。S蛋白可被宿主衍生性的蛋白酶消化成S1亚基和S2亚基两部分。S1亚基是结合PEDV的特异性受体,而S2亚基主要负责病毒与特异性受体结合后的膜融合活动[5][6]。Duarte等研究学者早在1994年就发现S蛋白有3个比较特别的结构域,其中的外部结构域是受体结合域,含有诱导宿主机体产生抗体的抗原表位,并在这个区域和宿主细胞表面大分子结合。近年来国内外不断有学者对PEDV的S基因进行遗传进化分析。相关测序结果均显示，我国各地方株基因组的S基因序列,与欧洲毒株CV777株,以及国内早期的毒株相比，差异较为明显，但与韩国毒株保持着较高的同源性[7]。
大量实验研究表明，S蛋白有着调节诱导病毒进入细胞,刺激被感染的自然宿主产生中和抗体的作用[8]，以S基因作为靶基因的载体均能刺激动物机体产生较好的免疫反应[2]，因此S基因成为基因工程疫苗研究的一个重要的靶基因。不仅如此,S蛋白在机体的免疫中起到的重要作用还体现在该病毒的体外适应生长和宿主内毒力的致弱等方面 [9]。早在20世纪90年代，我国哈尔滨兽医研究所就研制出了TGEVPEDV二联苗和弱毒苗，该疫苗一直沿用至今，对防治流行性腹泻起到了十分重要的作用。近年来，流行性腹泻呈高发趋势，国内外专家学者发现该病毒出现了新的变种。通过流行病学调查发现，S基因，ORF3基因等均发生较大变异，这可能是免疫效果不佳的主要原因。所以现在急需开发新疫苗。
本实验就是针对华东部分地区毒株的S基因进行序列的扩增和测序比较，了解其遗传特点，为今后对该病的防治工作，特别是新型疫苗研制方面提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1病料：
本次进行PEDV分离鉴定的病料是于2015年3月至5月间在江苏、山东和安徽3省的10个地区(表1)疑似发病的猪场取得。病料样本包括7份小肠组织和3份血样，图1为部分病理剖检照片。
表1 病料的采集
Table 1 Collection of sample
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