猪链球菌新血清型荚膜多糖提取纯化及组成研究
一些细菌能在细胞壁外围产生一种粘液样物质被称为荚膜。荚膜多糖具有抗吞噬活性，对猪链球菌的感染和致病力有非常重要的作用，以其为基础的疫苗研究正在开展。本试验拟摸索猪链球菌新血清型分离株荚膜的最适培养条件，提取、超滤并冻干后采用Sephacryl S-300凝胶层析柱进行分离纯化得到多种组分，并经Dot-ELISA鉴定后采用高效液相色谱法、硫酸-苯酚法以及BCA蛋白定量法对荚膜多糖及各组分进行初步分析研究。结果得到两种免疫原性较好的组分并测得其分子量、糖含量及蛋白含量。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言.............................................................................................................................................1
1 材料与方法 2
1.1 荚膜多糖的提取 2
1.1.1 主要试剂与仪器 2
1.1.2 提取方法 2
1.1.3 培养条件优化 2
1.2 荚膜多糖的纯化 2
1.2.1 主要试剂与仪器 2
1.2.2 纯化方法 2
1.3 荚膜多糖的鉴定 3
1.3.1 主要试剂与仪器 3
1.3.2 DotELISA鉴定荚膜多糖 3
1.4 荚膜多糖的分子量测定与纯度分析 3
1.4.1 主要试剂与仪器 3
1.4.2 高效液相色谱 3
1.5 荚膜多糖组分糖含量及蛋白含量的测定 4
1.5.1 硫酸苯酚法测糖含量 4
1.5.2 BCA蛋白定量法测蛋白含量 4
2 结果与分析 4
2.1 荚膜多糖的提取及工艺改进结果 4
2.2 荚膜多糖的分离纯化结果 4
2.3 荚膜多糖的鉴定结果 5
2.4 高效液相色谱测分子量测定与纯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
度分析结果 5
2.5 荚膜多糖组糖含量及蛋白含量测定结果 6
2.5.1 硫酸苯酚法测糖含量结果 6
2.5.2 BCA蛋白定量法测定结果 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
猪链球菌新血清型荚膜多糖提取纯化及组成研究
引言
猪链球菌为链球菌科链球菌属革兰阳性菌。菌落小，直径 0.51.0 mm，半透明颜色略带灰白色，菌落周围有轻微溶血环[1]。猪链球菌的定植部位主要是扁桃体和鼻腔，感染后可引起猪的急性败血症、关节炎、脑膜炎和急性死亡等，对养猪业产生较为严重的影响。不仅如此，人若接触病（死）猪或其生肉制品可能发生感染，严重的病例甚至会发生死亡[2]。1968 年丹麦发生了人感染猪链球菌病，是目前有关人感染该病的最早报道，此后相继在北欧等国家也发生了相关报道，但主要是散发[1]。在我国2004年四川爆发了人—猪链球菌病，导致两百多人感染，三十余人死亡，给人类健康、公共卫生和社会安定造成严重影响。
该菌的毒力因子比较复杂，其中荚膜具有耐干燥、保护菌体、抗吞噬、影响细菌与上皮细胞的黏附和抵抗宿主特异性或非特异性免疫等作用[3]，是非常重要的毒力因子。一般情况下无法观察到荚膜，若将荚膜通过特殊处理如Tyler染色等后可在光学显微镜下看到，此外也可对荚膜进行背景染色，从而使之被方便地观察到[45]。
猪链球菌荚膜主要含多糖类，此外也有少数主要含多肽类或此两类都有[6]。荚膜多糖是由两种及以上单糖通过糖苷键链接而成的复杂长链结构[7]。荚膜多糖在菌体内的合成是一个复杂的酶促反应过程，菌体首先合成或摄取单糖，然后活化相应的核苷酸衍生物，使其与位于膜骨架上的转移酶形成复合物，催化一系列单糖排列连接形成糖亚单元，最后形成完整的荚膜多糖并将其输出装配到菌体表面[810]。
由于猪链球菌血清2型是主要的致病性血清型，故目前对荚膜多糖的研究主要集中在该血清型上，而对具有致病性的其它血清型猪链球菌研究并不多，尤其是对其分离纯化和结构分析方面的研究报道更是不多见[11]。2012年冬季以来，常州市多个猪场均出现较为严重的猪链球菌感染情况。病猪表现为后驱瘫痪，预后不良，为典型脑膜炎型猪链球菌病，本实验室采集病猪粪便，最终分离到猪链球菌新血清型株CZ130302。本试验拟摸索猪链球菌新血清型分离株CZ130302荚膜的最适培养条件，提取、超滤并冻干后采用Sephacry1S300凝胶层析柱进行分离纯化得到多种组分，并经DotELISA鉴定后采用高效液相色谱法、硫酸苯酚法以及BCA蛋白定量法对荚膜多糖及各组分进行初步分析研究，以期对以荚膜多糖为基础的检测试剂和疫苗研制提供更多的线索和依据，进而推动未来检测和预防猪链球菌的发展。
1 材料与方法
1.1 荚膜多糖的提取
1.1.1 主要试剂与仪器 THB肉汤；生理盐水；甘氨酸缓冲液；叠氮化钠；蛋白酶K购自Takara公司；DNA酶；RNA酶；CaCl2；无水乙醇；高速离心机购自美国Beckman Coulter 公司；微生物培养箱购自美国Thermo公司；磁力搅拌器购自德国IKA公司；恒温水浴锅。
1.1.2 提取方法 猪链球菌新血清型分离株CZ130302在5 L THB肉汤中37℃培养20 h。9800 rpm离心10 min弃上清获得猪链球菌，将其用生理盐水洗涤一次，离心后将沉淀悬浮于100 mL甘氨酸缓冲液（含有100 mg结晶状无盐卵清溶菌酶，0.1 M，pH 9.2）中，并加入叠氮化钠使终浓度为0.02%[12]。将上述新血清型猪链球菌悬浮液在37℃不断搅拌下裂解6~8 h。待溶菌酶裂解消化之后9800 rpm离心10 min弃去沉淀。上清中加蛋白酶K至终浓度为100 μg/mL，于55℃作用2 h，再加入Dnase及Rnase（10 μg/mL），37℃作用l h。得到的溶液加入CaCl2调至终浓度为0.1 M，用磁力搅拌器搅拌1 h。搅拌后的溶液中加无水乙醇（约1/3体积，浓度至25% vol/vol），于4℃环境放置3 h，9800 rpm离心10 min除去沉淀下来的核酸。最后加入无水乙醇（约4倍体积，浓度至80% vol/vol），充分振摇后于4℃环境放置16 h以上，9800 rpm离心20 min使荚膜多糖从溶液中沉淀下来，收集沉淀即为粗制的荚膜多糖。
1.1.3 培养条件优化 采用静置和震荡培养方法，培养时间分别设置为14 h、16 h、18 h、20 h、22 h，比较最后提取到的荚膜粗多糖的产量，确定最佳培养条件。
1.2 荚膜多糖的分离纯化
1.2.1 主要试剂与仪器 3 KD超滤管；0.22 μm滤器购自美国Merck Millipore公司；离心机购自日本HITACHI公司；高速冷冻离心机购自美国Thermo公司；超低温冰箱购自澳柯玛公司；冻干机购自德国CHRIST公司；NGC层析系统购自美国BIORAD公司；ENrichTM SEC 650离子交换柱购自美国BIORAD公司；Sephacry1 S300凝胶层析柱购自美国GE公司。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言.............................................................................................................................................1
1 材料与方法 2
1.1 荚膜多糖的提取 2
1.1.1 主要试剂与仪器 2
1.1.2 提取方法 2
1.1.3 培养条件优化 2
1.2 荚膜多糖的纯化 2
1.2.1 主要试剂与仪器 2
1.2.2 纯化方法 2
1.3 荚膜多糖的鉴定 3
1.3.1 主要试剂与仪器 3
1.3.2 DotELISA鉴定荚膜多糖 3
1.4 荚膜多糖的分子量测定与纯度分析 3
1.4.1 主要试剂与仪器 3
1.4.2 高效液相色谱 3
1.5 荚膜多糖组分糖含量及蛋白含量的测定 4
1.5.1 硫酸苯酚法测糖含量 4
1.5.2 BCA蛋白定量法测蛋白含量 4
2 结果与分析 4
2.1 荚膜多糖的提取及工艺改进结果 4
2.2 荚膜多糖的分离纯化结果 4
2.3 荚膜多糖的鉴定结果 5
2.4 高效液相色谱测分子量测定与纯
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
度分析结果 5
2.5 荚膜多糖组糖含量及蛋白含量测定结果 6
2.5.1 硫酸苯酚法测糖含量结果 6
2.5.2 BCA蛋白定量法测定结果 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
猪链球菌新血清型荚膜多糖提取纯化及组成研究
引言
猪链球菌为链球菌科链球菌属革兰阳性菌。菌落小，直径 0.51.0 mm，半透明颜色略带灰白色，菌落周围有轻微溶血环[1]。猪链球菌的定植部位主要是扁桃体和鼻腔，感染后可引起猪的急性败血症、关节炎、脑膜炎和急性死亡等，对养猪业产生较为严重的影响。不仅如此，人若接触病（死）猪或其生肉制品可能发生感染，严重的病例甚至会发生死亡[2]。1968 年丹麦发生了人感染猪链球菌病，是目前有关人感染该病的最早报道，此后相继在北欧等国家也发生了相关报道，但主要是散发[1]。在我国2004年四川爆发了人—猪链球菌病，导致两百多人感染，三十余人死亡，给人类健康、公共卫生和社会安定造成严重影响。
该菌的毒力因子比较复杂，其中荚膜具有耐干燥、保护菌体、抗吞噬、影响细菌与上皮细胞的黏附和抵抗宿主特异性或非特异性免疫等作用[3]，是非常重要的毒力因子。一般情况下无法观察到荚膜，若将荚膜通过特殊处理如Tyler染色等后可在光学显微镜下看到，此外也可对荚膜进行背景染色，从而使之被方便地观察到[45]。
猪链球菌荚膜主要含多糖类，此外也有少数主要含多肽类或此两类都有[6]。荚膜多糖是由两种及以上单糖通过糖苷键链接而成的复杂长链结构[7]。荚膜多糖在菌体内的合成是一个复杂的酶促反应过程，菌体首先合成或摄取单糖，然后活化相应的核苷酸衍生物，使其与位于膜骨架上的转移酶形成复合物，催化一系列单糖排列连接形成糖亚单元，最后形成完整的荚膜多糖并将其输出装配到菌体表面[810]。
由于猪链球菌血清2型是主要的致病性血清型，故目前对荚膜多糖的研究主要集中在该血清型上，而对具有致病性的其它血清型猪链球菌研究并不多，尤其是对其分离纯化和结构分析方面的研究报道更是不多见[11]。2012年冬季以来，常州市多个猪场均出现较为严重的猪链球菌感染情况。病猪表现为后驱瘫痪，预后不良，为典型脑膜炎型猪链球菌病，本实验室采集病猪粪便，最终分离到猪链球菌新血清型株CZ130302。本试验拟摸索猪链球菌新血清型分离株CZ130302荚膜的最适培养条件，提取、超滤并冻干后采用Sephacry1S300凝胶层析柱进行分离纯化得到多种组分，并经DotELISA鉴定后采用高效液相色谱法、硫酸苯酚法以及BCA蛋白定量法对荚膜多糖及各组分进行初步分析研究，以期对以荚膜多糖为基础的检测试剂和疫苗研制提供更多的线索和依据，进而推动未来检测和预防猪链球菌的发展。
1 材料与方法
1.1 荚膜多糖的提取
1.1.1 主要试剂与仪器 THB肉汤；生理盐水；甘氨酸缓冲液；叠氮化钠；蛋白酶K购自Takara公司；DNA酶；RNA酶；CaCl2；无水乙醇；高速离心机购自美国Beckman Coulter 公司；微生物培养箱购自美国Thermo公司；磁力搅拌器购自德国IKA公司；恒温水浴锅。
1.1.2 提取方法 猪链球菌新血清型分离株CZ130302在5 L THB肉汤中37℃培养20 h。9800 rpm离心10 min弃上清获得猪链球菌，将其用生理盐水洗涤一次，离心后将沉淀悬浮于100 mL甘氨酸缓冲液（含有100 mg结晶状无盐卵清溶菌酶，0.1 M，pH 9.2）中，并加入叠氮化钠使终浓度为0.02%[12]。将上述新血清型猪链球菌悬浮液在37℃不断搅拌下裂解6~8 h。待溶菌酶裂解消化之后9800 rpm离心10 min弃去沉淀。上清中加蛋白酶K至终浓度为100 μg/mL，于55℃作用2 h，再加入Dnase及Rnase（10 μg/mL），37℃作用l h。得到的溶液加入CaCl2调至终浓度为0.1 M，用磁力搅拌器搅拌1 h。搅拌后的溶液中加无水乙醇（约1/3体积，浓度至25% vol/vol），于4℃环境放置3 h，9800 rpm离心10 min除去沉淀下来的核酸。最后加入无水乙醇（约4倍体积，浓度至80% vol/vol），充分振摇后于4℃环境放置16 h以上，9800 rpm离心20 min使荚膜多糖从溶液中沉淀下来，收集沉淀即为粗制的荚膜多糖。
1.1.3 培养条件优化 采用静置和震荡培养方法，培养时间分别设置为14 h、16 h、18 h、20 h、22 h，比较最后提取到的荚膜粗多糖的产量，确定最佳培养条件。
1.2 荚膜多糖的分离纯化
1.2.1 主要试剂与仪器 3 KD超滤管；0.22 μm滤器购自美国Merck Millipore公司；离心机购自日本HITACHI公司；高速冷冻离心机购自美国Thermo公司；超低温冰箱购自澳柯玛公司；冻干机购自德国CHRIST公司；NGC层析系统购自美国BIORAD公司；ENrichTM SEC 650离子交换柱购自美国BIORAD公司；Sephacry1 S300凝胶层析柱购自美国GE公司。
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