鸭甲型肝炎病毒ly2015株的分离鉴定
：鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）是一种传播迅速且高度致病的急性传染病，其临床症状表现为角弓反张，病理变化为肝炎和出血。该病现已成为严重危害养鸭业的重要传染病之一。2015年10月份，山东临沂地区多个鸭场发生鸭病毒性肝炎疫情，某些鸭场已免疫鸭肝炎疫苗，初步怀疑是新型鸭病毒性肝炎感染所致。本研究将该地区五个发病鸭场采集回来的病死雏鸭肝脏病料做RT-PCR检测。发现五个发病鸭场均为新型鸭肝炎病毒阳性，随之将样品回收测序，发现五个样品与DHAV JS2010株同源性极高，即确定临沂地区新型鸭病毒性肝炎为优势流行毒株，遂接种9日龄鸭胚，分离病毒。同时根据DHAV-JS2010全基因序列设计了DHAV变异株全基因扩增引物，对样品全基因扩增、回收纯化并测序。分析测序结果发现DHAV-C-LY主要抗原性结构蛋白VP1与疫苗株DHAV-A A66株的同源性仅为75.8%，存在大量的氨基酸突变和连续2个氨基酸的插入。DHAV-C-LY属于基因C型，而疫苗株DHAV-A A66属于基因A型。目前市售鸭肝炎疫苗均为以DHAV-A A66疫苗株为主的基因A型鸭肝炎疫苗，以致该地区鸭场虽接种疫苗，却仍然会发病。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1．1．1 病料来源3
1．1．2 实验动物3
1．1．3 主要试剂3
1．1．4 主要仪器3
1．1．5 有关溶液的配制3
1.2 实验方法3
1.2.1 病料的处理3
1.2.2 鸭肝炎病毒的RTPCR检测3
1.2.2.1 RNA的提取3
1.2.2.2 cDNA的制备4
1.2.2.3 PCR反应4
1.2.2.4 PCR产物的回收纯化与测序5
1.2.3 分离病毒5
1.2.4 全基因测序6
1.2.4.1 引物设计6
1.2.4.2 PCR反应6
1.2.4.3 PCR产物的回收纯化与测序 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
2 结果与分析7
2.1 结果7
2.1.1 临床症状与病理观察结果7
2.1.2 鸭肝炎病毒的RTPCR检测结果7
2.1.3 鸭肝炎病毒的分离结果8
2.1.4 各片段RTＰＣＲ扩增结果8
2.1.5 测序结果及序列分析9
2.2 分析10
3 讨论 10
致谢10
参考文献11 鸭甲型肝炎病毒LY/2015株的分离鉴定
引言
前言
鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）是一种传播迅速且高度致死的急性传染病，其特征为发病急，传播快，死亡率高，常见于1～3周龄鸭群[1]。该病临床特征症状表现为角弓反张，病理变化为肝炎和出血，是严重危害养鸭业的重要传染病之一。该病病原有三个血清型，即I、II、III型，三个血清型病毒之间没有交叉免疫反应，而所致症状与病理变化相似[2]。血清I型鸭肝炎病毒毒力最强，流行最广，血清II型和III型毒力较弱，流行范围小[3]，我国流行的多为血清I型鸭肝炎病毒。
血清I型鸭肝炎病毒最早在1945年，由美国学者Levine发现[4]。我国在1963年由黄均建等人首次报道血清I型鸭病毒性肝炎的初次流行[5]。近年来，国内外学者先后分离到新的血清型，Tseng CT等在台湾地区报道新型鸭肝炎病毒，命名“台湾NDHV”[6]；Kim等在韩国报道新型鸭肝炎病毒，命名“韩国NDHV”[7]，它们均不与经典血清I型鸭肝炎病毒产生交叉中和反应[8]。为了更好地研究鸭病毒性肝炎的病原，且DHVI、台湾NDHV和韩国NDHV具有典型的小RNA病毒基因组结构特征，国内学者将其称为鸭甲型肝炎病毒（DHAV），按其基因进化规律分为A、B、C三型，分别对应原有的DHVI、台湾NDHV、韩国NDHV[9]。随后小RNA病毒科研究小组建议在小RNA 病毒科中增设禽肝病毒属鸭甲肝病毒种[10]， 国际病毒分类委员员(ICTV)在第十次病毒分类报告中正式将DHVI命名为小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus ，DHAV）[11]。
近来我国临床上的鸭肝炎病例逐渐增多，采用经典血清I型鸭肝炎病毒（DHAVA）疫苗免疫的雏鸭也时常发病，从各地经免疫或高免卵黄抗体无法预防和治愈的发病雏鸭中均分离到新型鸭肝炎病毒[1214]，说明我国部分地区已然开始流行新型鸭病毒性肝炎且多数是混合感染[15]，传统疫苗与卵黄抗体已不能完全保护鸭群，而针对DHAVA和DHAVC的二价灭活疫苗还在试验阶段[16]。目前，新型鸭病毒性肝炎的防治是我国养鸭业的重大挑战。
本研究在山东临沂地区五个发病鸭场采集到肝脏组织，采用RTPCR反应检测新型鸭肝炎病毒，接种9日龄鸭胚以分离出病毒，对病毒分离株进行全基因测序以进一步研究病毒核苷酸序列特征，并相应做一些病毒生物学特性的研究，以期为新型鸭病毒性肝炎的疫苗研制提供参考信息。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料来源
2015年10月上旬，山东临沂地区五个发病鸭场突然发病死亡的2周龄雏鸭，解剖取出的肝脏组织。
1．1．2 实验动物
9日龄鸭胚，购于南京青龙山种鸭场。
1．1．3 主要试剂
总RNA提取试剂Trizol、Random primer、dNTP Mixture、5×Prime Script Buffer、RNase Inhibitor、Prime Script Reverse Transcriptase、DEPC Treated Water、rTaq聚合酶、DNA回收试剂盒、DL2000DNA Marker均购自TaKaRa；核酸染料：Tanon? 1703001，琼脂糖REGULAE AGAROSE G10购于BIOWEST；其余试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等为国产分析纯。
1．1．4 主要仪器
PCR扩增仪购自TaKaRa，核酸曝光仪、电泳仪电源、电泳槽购自天能，DK8D型电热恒温水槽购自上海一恒科技有限公司，隔水式恒温培养箱购于上海索普仪器有限公司，超净工作台购自AIRTECH，低温台式高速离心机：eppendorf centrifuge 5424R，漩涡振荡器购于上海青浦沪西仪器厂，电子称：JY1002良平仪器,立式高压蒸汽灭菌器：LDZX75KBS上海申安医疗器械厂，精密鼓风干燥箱：BAO150A施都凯仪器设备（上海）有限公司。
1．1．5有关溶液的配制
⑴ 50×TAE Buffer:称量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g于1L烧杯中；向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存，用时将其稀释成1×TAE,充分混匀。
⑵ PBS缓冲液：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1．1．1 病料来源3
1．1．2 实验动物3
1．1．3 主要试剂3
1．1．4 主要仪器3
1．1．5 有关溶液的配制3
1.2 实验方法3
1.2.1 病料的处理3
1.2.2 鸭肝炎病毒的RTPCR检测3
1.2.2.1 RNA的提取3
1.2.2.2 cDNA的制备4
1.2.2.3 PCR反应4
1.2.2.4 PCR产物的回收纯化与测序5
1.2.3 分离病毒5
1.2.4 全基因测序6
1.2.4.1 引物设计6
1.2.4.2 PCR反应6
1.2.4.3 PCR产物的回收纯化与测序 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
2 结果与分析7
2.1 结果7
2.1.1 临床症状与病理观察结果7
2.1.2 鸭肝炎病毒的RTPCR检测结果7
2.1.3 鸭肝炎病毒的分离结果8
2.1.4 各片段RTＰＣＲ扩增结果8
2.1.5 测序结果及序列分析9
2.2 分析10
3 讨论 10
致谢10
参考文献11 鸭甲型肝炎病毒LY/2015株的分离鉴定
引言
前言
鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）是一种传播迅速且高度致死的急性传染病，其特征为发病急，传播快，死亡率高，常见于1～3周龄鸭群[1]。该病临床特征症状表现为角弓反张，病理变化为肝炎和出血，是严重危害养鸭业的重要传染病之一。该病病原有三个血清型，即I、II、III型，三个血清型病毒之间没有交叉免疫反应，而所致症状与病理变化相似[2]。血清I型鸭肝炎病毒毒力最强，流行最广，血清II型和III型毒力较弱，流行范围小[3]，我国流行的多为血清I型鸭肝炎病毒。
血清I型鸭肝炎病毒最早在1945年，由美国学者Levine发现[4]。我国在1963年由黄均建等人首次报道血清I型鸭病毒性肝炎的初次流行[5]。近年来，国内外学者先后分离到新的血清型，Tseng CT等在台湾地区报道新型鸭肝炎病毒，命名“台湾NDHV”[6]；Kim等在韩国报道新型鸭肝炎病毒，命名“韩国NDHV”[7]，它们均不与经典血清I型鸭肝炎病毒产生交叉中和反应[8]。为了更好地研究鸭病毒性肝炎的病原，且DHVI、台湾NDHV和韩国NDHV具有典型的小RNA病毒基因组结构特征，国内学者将其称为鸭甲型肝炎病毒（DHAV），按其基因进化规律分为A、B、C三型，分别对应原有的DHVI、台湾NDHV、韩国NDHV[9]。随后小RNA病毒科研究小组建议在小RNA 病毒科中增设禽肝病毒属鸭甲肝病毒种[10]， 国际病毒分类委员员(ICTV)在第十次病毒分类报告中正式将DHVI命名为小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus ，DHAV）[11]。
近来我国临床上的鸭肝炎病例逐渐增多，采用经典血清I型鸭肝炎病毒（DHAVA）疫苗免疫的雏鸭也时常发病，从各地经免疫或高免卵黄抗体无法预防和治愈的发病雏鸭中均分离到新型鸭肝炎病毒[1214]，说明我国部分地区已然开始流行新型鸭病毒性肝炎且多数是混合感染[15]，传统疫苗与卵黄抗体已不能完全保护鸭群，而针对DHAVA和DHAVC的二价灭活疫苗还在试验阶段[16]。目前，新型鸭病毒性肝炎的防治是我国养鸭业的重大挑战。
本研究在山东临沂地区五个发病鸭场采集到肝脏组织，采用RTPCR反应检测新型鸭肝炎病毒，接种9日龄鸭胚以分离出病毒，对病毒分离株进行全基因测序以进一步研究病毒核苷酸序列特征，并相应做一些病毒生物学特性的研究，以期为新型鸭病毒性肝炎的疫苗研制提供参考信息。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料来源
2015年10月上旬，山东临沂地区五个发病鸭场突然发病死亡的2周龄雏鸭，解剖取出的肝脏组织。
1．1．2 实验动物
9日龄鸭胚，购于南京青龙山种鸭场。
1．1．3 主要试剂
总RNA提取试剂Trizol、Random primer、dNTP Mixture、5×Prime Script Buffer、RNase Inhibitor、Prime Script Reverse Transcriptase、DEPC Treated Water、rTaq聚合酶、DNA回收试剂盒、DL2000DNA Marker均购自TaKaRa；核酸染料：Tanon? 1703001，琼脂糖REGULAE AGAROSE G10购于BIOWEST；其余试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等为国产分析纯。
1．1．4 主要仪器
PCR扩增仪购自TaKaRa，核酸曝光仪、电泳仪电源、电泳槽购自天能，DK8D型电热恒温水槽购自上海一恒科技有限公司，隔水式恒温培养箱购于上海索普仪器有限公司，超净工作台购自AIRTECH，低温台式高速离心机：eppendorf centrifuge 5424R，漩涡振荡器购于上海青浦沪西仪器厂，电子称：JY1002良平仪器,立式高压蒸汽灭菌器：LDZX75KBS上海申安医疗器械厂，精密鼓风干燥箱：BAO150A施都凯仪器设备（上海）有限公司。
1．1．5有关溶液的配制
⑴ 50×TAE Buffer:称量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g于1L烧杯中；向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存，用时将其稀释成1×TAE,充分混匀。
⑵ PBS缓冲液：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
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