猪肠道食糜和粪便中益生性乳酸菌的分离与筛选
猪肠道食糜和粪便中益生性乳酸菌的分离与筛选[20200510204314]
摘要：本试验拟从猪肠道食糜和粪便中分离筛选具有益生性的乳酸菌菌株，为开发新的益生素奠定基础。实验利用常规乳酸菌分离方法，结合体外发酵手段，从93株菌中筛选出4株耐酸能力强的乳酸菌菌株，其编号为L71、L76和L104，这些乳酸菌均能耐受pH2.5的酸性。但4株菌中，仅L104能耐受0.5%浓度的胆盐，其他菌株对0.5%浓度胆盐的耐受能力较弱；在抑菌能力上，菌株L71、L76、L96和L104的发酵液上清对大肠杆菌K88和K99有抑菌作用，但L71、L96和L104上述三株菌在排除酸效应时失去抑菌性；L76上清液和排出酸效应时对沙门氏菌均有抑菌能力。结果表明，分离筛选获得的部分乳酸菌具有较好的产酸特性，并且具有一定的抑菌能力和耐受胃肠道环境的能力。
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关键字:乳酸菌；分离；筛选
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1.材料与方法4
1.1试验材料 4
1.1.1试验动物4
1.1.2仪器和设备4
1.1.3培养基与试剂4
1.2方法 4
1.2.1生长曲线的测定4
1.2.2分离纯化乳酸菌4
1.2.3革兰氏染色4
1.2.4属的鉴定4
1.2.5酸化试验5
1.2.6耐酸试验5
1.2.7耐胆盐试验5
1.2.8抑菌试验5
1.2.9统计分析6
2.结果与分析6
2.1乳酸菌的形态学6
2.2乳酸菌的产酸性能测定结果7
2.3乳酸菌的生化鉴定8
2.4经过产酸性能筛选9
2.5益生特性分析9
2.5.1乳酸菌耐酸耐胆盐情况9
2.5.2乳酸菌抑菌能力10
2.6乳酸菌生长曲线10
3.讨论 10
3.1乳酸菌生长曲线11
3.2乳酸菌产酸性能及筛选11
3.3乳酸菌的益生性11
致谢11
参考文献12
猪肠道食糜和粪便中益生性乳酸菌的分离与筛选
引言
抗生素作为饲料添加剂在畜牧业中的应用主要是起预防、治疗动物疾病及促进动物生长的作用，但近年来的研究发现，抗生素在抑制和杀灭病原菌的同时也抑制和杀灭了有益菌群，破坏了肠道微生态的平衡，使得动物免疫水平低下，对病原菌的抵抗力降低[1]，而且造成 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
抗生素在畜禽产品中残留[2]，危害到消费者的健康，降低了畜禽产品在国际市场上的竞争力[3]。因此，有关抗生素替代品的研究与开发成为热点问题。而益生素(probiotics)是一类能通过调控生物体微生态平衡进而有效促进宿主健康和生长的活微生物制剂[4]，又被称为活菌制剂、微生态制剂等(Golden,1998,Fioramonti等,2003)[5]。微生态制剂具有绿色安全、无毒、无残留等优点，并且在增强禽畜免疫力，提高生长性能、降低死亡率等方面具有良好功效[6]，已经作为饲料添加剂得到广泛应用，并显示出具有减少抗生素类添加剂使用量的效果。乳酸菌是应用最早、最广泛的益生素[7]。益生性乳酸菌由于其代谢物能使肠道环境偏酸性，可加强肠道的蠕动和肠液分泌，促进机体养分的消化吸收并有利于维持肠道的微生态平衡而在养殖业生产中得到大量的应用[8]。本试验这是基于这一理念，从健康仔猪肠道内的食糜和粪便中分离出产酸特性高以及抑菌效果好的乳酸菌，并通过纯化、鉴定以及筛选具有良好特性的乳酸菌菌株，为进—步研制猪源微生态制剂奠定前期工作基础。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
14、28日龄左右的大白和梅山黑猪仔猪。分别在太仓梅山黑猪种猪场、上海农场安丰养猪场饲养。
1.1.2仪器和设备
ZHWY--2102型全温振荡培养箱，H6000型生物显微镜，HZQ--C型双层空气恒温振荡器，pH213型酸度计，101A-2型电热鼓风干燥箱，UV--4802型紫外可见光光度计，YMQ--L31--400型立式压力蒸汽灭菌锅，JJT-1300型洁净工作台，MDF-382E日本三洋超低温冰箱，发酵罐，厌氧滚管，CO2罐，培养皿。
1.1.3培养基与试剂
改良MRS培养基：蛋白胨l0g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，K2HP042g，吐温(Tween)-80 1.0ml，MgS047H20 0.5g，MnS044H20 0.2g，蒸馏水1000ml，盐酸调pH到6.5，121℃灭菌20min。
试剂：MRS固体培养基、吲哚试剂、硝酸盐还原试剂、双氧水、L.精氨酸液、奈氏试剂、革兰氏染色液、孔雀绿染色液、溴酚蓝指示剂、半胱氨酸盐、乳酸试剂盒。
1.2方法
1.2.1生长曲线的测定
将乳酸菌原液按1％的接种量接种MRS培养基，0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h取样测定发酵液的OD600值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘出生长曲线。
1.2.2分离纯化乳酸菌
无菌采集14日龄和28日龄健康仔猪肠道粘膜与食糜（冻存于-20℃条件下或者整肠带回）。新鲜类便或者粘膜0.5 g于4.5 mL灭菌生理盐水中，摇匀。进行梯度稀释，稀释至第7个梯度，吸取10-5、10-6、10-7梯度稀释液100μL于固体MRS(pH5.5-6.2)培养基平板上均匀涂布。每个平板两个平行，将上述平板置于37℃恒温培养箱培养48h。在每个MRS固体培养基培养板上挑取5个左右、活性高、不同菌落形态的菌株（灰白色，乳白色，白色的菌落），并在平板上标明釆样的部位，作好标记、记录，进行MRS平板划线纯化，连续纯化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
2-3次到获得纯菌株为止。（菌落形态与革兰氏染色的菌体形态一致，呈白色或乳白色，还有半透明状，其表面光滑且中央有隆起现象较多，边缘大部分整齐也有少部分放射粗糙型。
1.2.3革兰氏染色
菌体形态的观察取干净载玻片，用接种环取一环无菌生理盐水于玻片，挑取少量细菌，在玻片上涂匀，干燥、固定，再染色，镜检(16×100)。
革兰氏染色:选择革兰氏阳性菌且无芽孢的菌株为后备菌株。将菌液（MRS肉汤）与40%灭菌甘油按1:1混合（甘油终浓度20%）置于-20℃冰箱进行菌株保存。
1.2.4属的鉴定
革兰氏阳性兼性厌氧无芽抱杆菌：作过氧化氢酶试验、哨酸盐还原试验、明胶液化试验、叫垛试验、硫化氢试验，如均为阴性，则可初步定为乳酸杆菌属。革兰氏阳性兼性厌氧球菌：根据细胞形态学、从葡萄糖产酸产气、10℃、45℃生长试验，pH9.6生长试验，4%NaCI、6.5%NaCI生长试验，细胞运动性(半固体穿刺)试验，做初步鉴别。保存在终浓度20%甘油中。
1.2.5酸化试验
酸化能力测定主要包括产酸酸度和产酸量，产酸酸度主要体现在pH降低速度，用溴酚蓝指示剂指示、产酸量主要是乳酸含量测定，取样时间最初是48h终末；厌氧条件下37℃48 h在10mL标准MRS肉汤活化乳酸菌菌株，制成乳酸菌的预先培养物，48h后检查活化的菌的生长情况；包含0.01g/L的溴酚蓝指示剂的改良肉汤，进行厌氧通CO2四小时，灭菌，每个滚管中分装10mL；随后将100μL的乳酸菌菌株的预先培养物接种到每个滚管中。为了调查酸的产生速度 ，改良MRS肉汤包括标准肉汤(pH值6.3)，含有35 g / L麦芽糖和5 g / L果糖 。培养时覆盖着1mL石蜡排除氧气在30℃培养，在4 d内观察培养物的颜色变化，颜色变化的时间即溴苯酚酸碱指示剂变色时间。在90 h，培养物的pH值测量。为测定最大产酸量，100μL升的乳酸菌液体培养基接种在10mL改良肉汤含2%CaCO3(w / v)，在厌氧30℃条件下培养48h。用试剂盒测定乳酸。对乳酸菌产酸性能强的进行初次筛选。乳酸的浓度和乙酸在培养物上清是由高效液相色谱分析，通过离心10min20000g将细菌细胞从液体培养物中剔除，然后又加入800μL0.1M硫酸到1mL的上清液中，除去蛋白是通过加入100μLCarrez l (36g/L FeK3(CN) 6﹒3H2O)和100μL Carrez II ( 72 g / L ZnSO4﹒7 H2O)试剂。5min后，然后悬浊液在20000g离心10min之后，上层清液过滤使用0.45米注射器过滤器(Chromacol有限公司，赫特福德郡，英国)。然后使用高效液相色谱测定。
摘要：本试验拟从猪肠道食糜和粪便中分离筛选具有益生性的乳酸菌菌株，为开发新的益生素奠定基础。实验利用常规乳酸菌分离方法，结合体外发酵手段，从93株菌中筛选出4株耐酸能力强的乳酸菌菌株，其编号为L71、L76和L104，这些乳酸菌均能耐受pH2.5的酸性。但4株菌中，仅L104能耐受0.5%浓度的胆盐，其他菌株对0.5%浓度胆盐的耐受能力较弱；在抑菌能力上，菌株L71、L76、L96和L104的发酵液上清对大肠杆菌K88和K99有抑菌作用，但L71、L96和L104上述三株菌在排除酸效应时失去抑菌性；L76上清液和排出酸效应时对沙门氏菌均有抑菌能力。结果表明，分离筛选获得的部分乳酸菌具有较好的产酸特性，并且具有一定的抑菌能力和耐受胃肠道环境的能力。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:乳酸菌；分离；筛选
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1.材料与方法4
1.1试验材料 4
1.1.1试验动物4
1.1.2仪器和设备4
1.1.3培养基与试剂4
1.2方法 4
1.2.1生长曲线的测定4
1.2.2分离纯化乳酸菌4
1.2.3革兰氏染色4
1.2.4属的鉴定4
1.2.5酸化试验5
1.2.6耐酸试验5
1.2.7耐胆盐试验5
1.2.8抑菌试验5
1.2.9统计分析6
2.结果与分析6
2.1乳酸菌的形态学6
2.2乳酸菌的产酸性能测定结果7
2.3乳酸菌的生化鉴定8
2.4经过产酸性能筛选9
2.5益生特性分析9
2.5.1乳酸菌耐酸耐胆盐情况9
2.5.2乳酸菌抑菌能力10
2.6乳酸菌生长曲线10
3.讨论 10
3.1乳酸菌生长曲线11
3.2乳酸菌产酸性能及筛选11
3.3乳酸菌的益生性11
致谢11
参考文献12
猪肠道食糜和粪便中益生性乳酸菌的分离与筛选
引言
抗生素作为饲料添加剂在畜牧业中的应用主要是起预防、治疗动物疾病及促进动物生长的作用，但近年来的研究发现，抗生素在抑制和杀灭病原菌的同时也抑制和杀灭了有益菌群，破坏了肠道微生态的平衡，使得动物免疫水平低下，对病原菌的抵抗力降低[1]，而且造成 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
抗生素在畜禽产品中残留[2]，危害到消费者的健康，降低了畜禽产品在国际市场上的竞争力[3]。因此，有关抗生素替代品的研究与开发成为热点问题。而益生素(probiotics)是一类能通过调控生物体微生态平衡进而有效促进宿主健康和生长的活微生物制剂[4]，又被称为活菌制剂、微生态制剂等(Golden,1998,Fioramonti等,2003)[5]。微生态制剂具有绿色安全、无毒、无残留等优点，并且在增强禽畜免疫力，提高生长性能、降低死亡率等方面具有良好功效[6]，已经作为饲料添加剂得到广泛应用，并显示出具有减少抗生素类添加剂使用量的效果。乳酸菌是应用最早、最广泛的益生素[7]。益生性乳酸菌由于其代谢物能使肠道环境偏酸性，可加强肠道的蠕动和肠液分泌，促进机体养分的消化吸收并有利于维持肠道的微生态平衡而在养殖业生产中得到大量的应用[8]。本试验这是基于这一理念，从健康仔猪肠道内的食糜和粪便中分离出产酸特性高以及抑菌效果好的乳酸菌，并通过纯化、鉴定以及筛选具有良好特性的乳酸菌菌株，为进—步研制猪源微生态制剂奠定前期工作基础。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
14、28日龄左右的大白和梅山黑猪仔猪。分别在太仓梅山黑猪种猪场、上海农场安丰养猪场饲养。
1.1.2仪器和设备
ZHWY--2102型全温振荡培养箱，H6000型生物显微镜，HZQ--C型双层空气恒温振荡器，pH213型酸度计，101A-2型电热鼓风干燥箱，UV--4802型紫外可见光光度计，YMQ--L31--400型立式压力蒸汽灭菌锅，JJT-1300型洁净工作台，MDF-382E日本三洋超低温冰箱，发酵罐，厌氧滚管，CO2罐，培养皿。
1.1.3培养基与试剂
改良MRS培养基：蛋白胨l0g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，K2HP042g，吐温(Tween)-80 1.0ml，MgS047H20 0.5g，MnS044H20 0.2g，蒸馏水1000ml，盐酸调pH到6.5，121℃灭菌20min。
试剂：MRS固体培养基、吲哚试剂、硝酸盐还原试剂、双氧水、L.精氨酸液、奈氏试剂、革兰氏染色液、孔雀绿染色液、溴酚蓝指示剂、半胱氨酸盐、乳酸试剂盒。
1.2方法
1.2.1生长曲线的测定
将乳酸菌原液按1％的接种量接种MRS培养基，0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h取样测定发酵液的OD600值，以培养时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘出生长曲线。
1.2.2分离纯化乳酸菌
无菌采集14日龄和28日龄健康仔猪肠道粘膜与食糜（冻存于-20℃条件下或者整肠带回）。新鲜类便或者粘膜0.5 g于4.5 mL灭菌生理盐水中，摇匀。进行梯度稀释，稀释至第7个梯度，吸取10-5、10-6、10-7梯度稀释液100μL于固体MRS(pH5.5-6.2)培养基平板上均匀涂布。每个平板两个平行，将上述平板置于37℃恒温培养箱培养48h。在每个MRS固体培养基培养板上挑取5个左右、活性高、不同菌落形态的菌株（灰白色，乳白色，白色的菌落），并在平板上标明釆样的部位，作好标记、记录，进行MRS平板划线纯化，连续纯化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
2-3次到获得纯菌株为止。（菌落形态与革兰氏染色的菌体形态一致，呈白色或乳白色，还有半透明状，其表面光滑且中央有隆起现象较多，边缘大部分整齐也有少部分放射粗糙型。
1.2.3革兰氏染色
菌体形态的观察取干净载玻片，用接种环取一环无菌生理盐水于玻片，挑取少量细菌，在玻片上涂匀，干燥、固定，再染色，镜检(16×100)。
革兰氏染色:选择革兰氏阳性菌且无芽孢的菌株为后备菌株。将菌液（MRS肉汤）与40%灭菌甘油按1:1混合（甘油终浓度20%）置于-20℃冰箱进行菌株保存。
1.2.4属的鉴定
革兰氏阳性兼性厌氧无芽抱杆菌：作过氧化氢酶试验、哨酸盐还原试验、明胶液化试验、叫垛试验、硫化氢试验，如均为阴性，则可初步定为乳酸杆菌属。革兰氏阳性兼性厌氧球菌：根据细胞形态学、从葡萄糖产酸产气、10℃、45℃生长试验，pH9.6生长试验，4%NaCI、6.5%NaCI生长试验，细胞运动性(半固体穿刺)试验，做初步鉴别。保存在终浓度20%甘油中。
1.2.5酸化试验
酸化能力测定主要包括产酸酸度和产酸量，产酸酸度主要体现在pH降低速度，用溴酚蓝指示剂指示、产酸量主要是乳酸含量测定，取样时间最初是48h终末；厌氧条件下37℃48 h在10mL标准MRS肉汤活化乳酸菌菌株，制成乳酸菌的预先培养物，48h后检查活化的菌的生长情况；包含0.01g/L的溴酚蓝指示剂的改良肉汤，进行厌氧通CO2四小时，灭菌，每个滚管中分装10mL；随后将100μL的乳酸菌菌株的预先培养物接种到每个滚管中。为了调查酸的产生速度 ，改良MRS肉汤包括标准肉汤(pH值6.3)，含有35 g / L麦芽糖和5 g / L果糖 。培养时覆盖着1mL石蜡排除氧气在30℃培养，在4 d内观察培养物的颜色变化，颜色变化的时间即溴苯酚酸碱指示剂变色时间。在90 h，培养物的pH值测量。为测定最大产酸量，100μL升的乳酸菌液体培养基接种在10mL改良肉汤含2%CaCO3(w / v)，在厌氧30℃条件下培养48h。用试剂盒测定乳酸。对乳酸菌产酸性能强的进行初次筛选。乳酸的浓度和乙酸在培养物上清是由高效液相色谱分析，通过离心10min20000g将细菌细胞从液体培养物中剔除，然后又加入800μL0.1M硫酸到1mL的上清液中，除去蛋白是通过加入100μLCarrez l (36g/L FeK3(CN) 6﹒3H2O)和100μL Carrez II ( 72 g / L ZnSO4﹒7 H2O)试剂。5min后，然后悬浊液在20000g离心10min之后，上层清液过滤使用0.45米注射器过滤器(Chromacol有限公司，赫特福德郡，英国)。然后使用高效液相色谱测定。
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