结核分枝杆菌rbpa蛋白功能域研究
结核病是由结核分枝杆菌引起的严重危害人类健康的传染病，其死亡率仅次于艾滋病。目前，由于抗生素的长期使用，耐药结核菌株不断出现，寻找新型抗结核药和药物作用新靶点是当前研究热点。RNA聚合酶结合蛋白（RbpA）是包括结核分枝杆菌在内的放线菌属细菌特有的一种蛋白，能与负责看家基因转录的σA相互作用。目前研究已证实RbpA在分枝杆菌中为生长必需蛋白，可能成为抗结核药物潜在靶点，但RbpA的功能域和作用机制还不十分清楚。本论文基于实验室前期研究，利用quickchange基因定点突变技术将筛选到的重要功能域第27位到33位氨基酸逐一进行丙氨酸替换突变，并将突变后的基因回复耻垢分枝杆菌rbpA沉默菌株，通过检测各回复菌株的生长情况来确定各位点对RbpA蛋白功能的影响。本研究还通过细菌双杂交技术检测各突变的蛋白是否影响其与σA互作，以探讨RbpA蛋白的作用机制。结果发现，第32位酪氨酸对维持RbpA功能非常重要，但其突变后又不影响其与σA相互作用，表明RbpA蛋白可能有新的作用机制。键词结核分枝杆菌；RbpA；定点突变；功能域The research on functional domain of Mycobacterium tuberculosis RbpAStudent majoring in Veterinary MedicineZHU YanTutorXU YuanyuanAbstractTuberculosis(TB), an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, is a serious problem to human health. It is reported that the mortality rate induced by TB is second only to AIDS. Chemotherapy for TB cannot reach the purpose of effective treatment, because multidrug-resistant TB (MDR-TB) becomes prevalent. So, we need find new antitubercular agents and new drug targets. The RNA polym *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
erase binding protein RbpA is specific to Actinmycetes. It is essential for mycobacteria growth and can bind to σA, which initiates the transcription of housekeeping genes together with RNA polymerase core enzyme. So, RbpA may be a promising target of anti-tuberculosis molecules. However, the function and mechanism of RbpA has not been clearly clarified. In our previous research, we find the domain Arg 27 to Arg 33 of MtbRbpA is essential for its function. This thesis aims to find out the important locus of the functional domain though quickchange gene site-directed mutation analysis. Our results show that Y32 is required for the function of RbpA, and the affinity of MtbRbpAY32A with σA is similar to that of wild type MtbRbpA and σA. Based on these data, we propose that RbpA may functions through some other novel mechanism in addition to interacting with σA.1 引言1.1 结核分枝杆菌与肺结核肺结核（tuberculosis, TB）是严重危害人类健康的慢性传染病，是世界普遍公认的最古老的疾病之一，在人类历史上曾造成很大破坏，导致数百万人死亡。自1993年世界卫生组织（World Health Organization , WHO）将结核病列为全球公共健康问题以来，世界各国为防治结核病做出了大量努力。据统计，1990~2013年间，结核病的死亡率下降了45%。但目前，结核病仍引起较高的发病率和死亡率，其造成的死亡人数仅次于人类免疫缺陷病毒（the human immunodeficiency virus, HIV），WHO统计2013年结核病的发病人数为900万，死亡人数为150万[1]。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）是肺结核的病原菌，可侵入全身组织器官，但以肺部感染最为多见。结核分枝杆菌的细胞壁脂质含量较高，药物不易透过细胞壁，而且侵入机体后主要寄居在巨噬细胞内，能够长期存活导致潜伏感染。1.2 结核分枝杆菌耐药性耐药结核菌株的出现是结核病难以控制的原因之一，给结核病的防控带来了阻碍，寻找新型抗结核药和药物作用新靶点是当前研究热点。抗生素产生耐药主要有三种机制降低细胞膜的通透性、产生降解或灭活酶类和药物靶位的突变。结核分枝杆菌耐药分子机制主要是耐药相关基因突变，如最主要的一线抗结核药物利福平，其抗菌机制主要是通过结合细菌RNA聚合酶β亚基从而抑制RNA的合成，而耐药相关基因rpoB突变可能导致结核分枝杆菌对利福平产生耐药。大部分结核菌株耐多药的分子机制是染色体上多个相互独立基因各自突变逐步累加。但由于结核分枝杆菌耐药的复杂性，是否存在其他耐药相关基因以及其他耐药机制有待于进一步研究，而对结核分枝杆菌耐药机制进行研究可能进一步指导新型抗结核药和药物作用新靶点的研发[2]。1.3 RbpA的发现与研究概况2001年，RNA聚合酶结合蛋白（RNA polymerase-binding protein, RbpA）是在分离纯化天蓝链霉菌RNA聚合酶时共纯化出的一种14 kDa的新蛋白，序列分析表明RbpA仅存在于放线菌。随后，该实验室对天蓝链霉菌RbpA的功能进行了研究，发现缺失突变rbpA该菌表现出较慢的生长表型，而且对利福平敏感性明显增强，证明RbpA与利福平耐药存在密切关系。另一项研究对耻垢分枝杆菌RbpA的功能进行了探讨，结果显示，过表达RbpA能够增强耻垢分枝杆菌对利福平的耐受，且证明RbpA作用于RNA聚合酶β亚基，而利福平的作用位点同样在β亚基，推测二者的结合位点有重叠。随后该实验室进行了RbpA诱导的利福平耐受现象的分子机制研究，提出当RbpA存在时，利福平从其结合位点释放，从而不能发挥抑制转录的作用，并进一步生物物理学研究揭示RbpA的作用位点在β亚基和β’亚基接合处[6-7]。本实验室与法国国家科研中心合作也对结核分枝杆菌RbpA的功能进行了研究，证实了RbpA与RNA聚合酶的结合位点并不与利福平的结合位点重叠，并提出了RbpA激活转录起始的新机制，即RbpA能够修饰RNA聚合酶核心酶的结构，从而增强核心酶与σA的亲和力，促进转录复合物的组装。进一步的探讨发现，RbpA仅增强σA和RNA聚合酶核心酶的结合，而对σF无明显作用，推测RbpA的这种促进作用具有σ因子特异性[8]。随后检测了RbpA对结核分枝杆菌中报道的13个σ因子（σA-σM）的调节作用，发现RbpA还能够促进RNA聚合酶与σB的结合，促进转录过程中开放复合物RPo的形成[9]。另一项研究证实了RbpA在σA和核心酶结合时发挥重要的促进作用，还通过细菌双杂交试验证明了RbpA与σA相互作用区域位于该蛋白C端[10]。近几年，关于RbpA功能的研究不断推进，其蛋白结构也逐渐被解析[11]。研究者在探讨耻垢分枝杆菌RbpA功能时发现其与RNA聚合酶β亚基相互作用区域位于RbpA蛋白58-73位氨基酸[12]。针对RbpA蛋白的功能区域，本实验室前期已进行了初步的探讨。如构建耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）rbpA基因沉默菌株（MsRbpAm），并构建了能表达RbpA蛋白的回复质粒。因为rbpA基因为生长必需基因，其沉默后MsRbpAm菌株不能正常生长，而转入回复质粒后，质粒上rbpA基因能表达正常的RbpA蛋白，细菌则能表现出正常生长。本实验室前期构建回复质粒上rbpA基因的不同区域缺失突变，通过分析不同突变的RbpA蛋白回复MsRbpAm菌株后的生长情况，发现第27到33位氨基酸区域突变后不能正常回复RbpA的功能，说明该结构域是RbpA作为生长必需蛋白的重要功能域。但是，该结构域影响RbpA作为生长必需蛋白的机制以及具体发挥功能的位点尚不清楚。1.4 本研究使用的技术1.4.1 Quickchange定点突变技术基因定点突变技术是研究蛋白质结构和功能关系的重要手段，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用来研究某特定氨基酸对蛋白质结构、催化活性等的影响，或用来改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体等。目前常采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变[3]。本研究使用QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit实现基因定点突变，该方法是PCR介导的定点突变技术的改造，具有明显的优势，基本原理如图1所示首先将待突变基因克隆入环状质粒，然后设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真Pfu聚合酶循环延伸。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。然后用内切酶DpnI（识别序列为甲基化的GATC）消化延伸产物，由于原来的模板质粒来源于大肠杆菌，是经dam甲基化修饰，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不会被切开，这样即可消化模板质粒。消化产物转化大肠杆菌，利用大肠杆菌自身修复系统可环化缺刻，即可得到突变质粒的克隆。该试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配，得到突变质粒，使得操作简单有效。该技术的关键是设计一对含有预期突变位点的互补引物，引物设计基本原则如下（1）需设计两条均包含突变位点的互补引物；（2）引物长度通常为25~45 bp，Tm值应大于78 ℃；（3）突变点两侧碱基数通常为10~15 bp；（4）两条引物的GC含量应大于40%，且至少以一个G或C终止。图1 Quickchange定点突变技术原理示意图引自Agilent Technologies公司QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit protoco1.4.2 同源重组克隆技术基因克隆技术是将外源DNA片段插入具有复制能力的载体DNA中，使外源DNA 得以复制的过程。目前，研究者使用的克隆方法主要很多，例如酶切-连接经典克隆、位点特异性重组克隆技术、DNA共转化等。其中，同源重组克隆技术是优于其他克隆技术，简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，本研究使用ClonExpress II One Step Cloning Kit来实现目的基因与载体的重组。其基本原理如图2所示首先选择合适的载体与克隆位点，利用限制性内切酶消化或PCR扩增制备线性化载体。然后设计5’包含线性化克隆载体末端同源序列（15 bp~20 bp）的引物，进行插入片段PCR扩增，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列。线性载体和插入片段PCR产物在同源重组酶的催化下，末端序列发生同源重组。该同源重组克隆技术不依赖连接酶进行连接，不需用考虑酶切位点而将插入片段克隆至载体的任何位点。图2 同源重组克隆技术原理示意图引自Vazyme公司ClonExpress II One Step Cloning Kit protocol1.4.3 细菌双杂交系统细菌双杂交系统是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的，用于研究蛋白质相互作用的方法。根据百日咳博代杆菌中cya基因编码的钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，其激活区可分为T18、T25两个相互独立的片段，将这两个片段引入cya基因缺陷型大肠杆菌并进行表达，它们不能相互识别与作用，因此不能互补大肠杆菌cya-缺陷型性状，表现为β-半乳糖苷酶活性很低。如果将T18、T25分别与一对可相互作用的蛋白质融合并进行表达，这两个功能区相互识别后腺苷酸环化酶恢复活性，从而可使菌株表现为cya+表型，如较高的β-半乳糖苷酶活性[16]，如图3所示。图3 细菌双杂交系统原理引自Euromedex公司Bacterial Adenylate Cyclase Two-Hybrid System Kit protocol1.5 本研究主要内容、目的与意义RbpA已被证实在分枝杆菌中为生长必需蛋白，但目前RbpA的功能域和作用机制还不十分清楚，本论文基于实验室前期研究，利用quickchange基因定点突变技术将筛选到的RbpA重要功能域第27-33氨基酸进行丙氨酸替换突变，分析这些突变后的蛋白回复MsRbpAm 生长的情况，来确定该功能域发挥作用的位点，同时，本论文还通过细菌双杂交技术分析各位点突变的RbpA与σA蛋白的相互作用，探讨突变后的蛋白对其功能的影响是否是通过改变与σA互作来实现，从而为进一步阐释RbpA蛋白的作用机制奠定基础。2 材料与方法 2．1 菌株和质粒大肠杆菌DH 5α、BTH101由本实验室保存，耻垢分枝杆菌rbpA沉默菌株（MsRbpAm）由本实验室构建。质粒pKT25b及pBT18a-sigA由本实验保存，质粒pMV261-P-Rv2050由本实验构建保存，载体图谱如图4所示。大肠杆菌DH 5α作为克隆宿主菌，在LB液体或固体培养基中生长，培养温度为37 ℃；BTH101作为细菌双杂交系统报告菌株，在LB液体或固体培养基中生长，培养温度为30 ℃。耻垢分枝杆菌在7H9液体培养基或7H10固体培养基中生长，培养温度为37 ℃。图4 pMV261-P-Rv2050载体图谱2.2 主要试剂 250 bp DNA ladder及Prime STAR Max Premix购自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司；DpnI购至New England Biolabs（NEB）公司；2×Taq Plus Master Mix购至Vazyme公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA小量试剂盒购至Axygen公司；QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit购至Agilent公司。胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl购自英国OXOID公司；商品化7H9培养基、7H10培养基购自美国BD公司；氨苄青霉素、卡那霉素购自上海生工。氨苄青霉素（Amp)储存液称取500 mg氨苄青霉素溶于10 mL水中，过滤除菌，-20 ℃保存备用。卡那霉素(Kan)储存液配制100 mg/mL储存液，-20 ℃保存。ATc储存液配制250 μg/mL储存液， -20 ℃避光保存。2．3 培养基LB培养基将胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，溶于800 mL去离子水中，用5 mol /L NaOH 调pH 值至7. 0，定容至1 L。120 ℃高压灭菌20 min。固体培养基另加15 g琼脂粉。7H9培养基根据商品说明配制并灭菌，使用前每100 mL另加入40%葡萄糖500 μl、10%吐温-80 500 μl、50%甘油400 μl、3M Nacl500 μl。7H10培养基根据商品说明配制并灭菌，使用前每100 mL中50%甘油1 mL。2.4 主要仪器设备 PCR仪（eppendorf）；离心机（eppendorf centrifuge 5424）；电转仪（eppendorf Electroporator 2510）；XMTD-8222型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；THZ-03M2型恒温摇床（上海博彩生物科技有限公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（Gene公司）；GHP-9160型隔水式培养箱（上海圣欣科学仪器有限公司）；酶标仪（Gene公司）。2.5 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的构建2.5.1 引物的设计与合成根据GenBank登陆的rbpA（Rv2050）基因序列以及QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis protocol中引物设计原则，利用Primer5.0软件设计9对含有预期突变位点的互补引物及相关检测引物，并送至天一辉远公司合成。序列如表1所示。表1 引物序列numberMutation sitePrimersSequence( 5→3)E1R27APRbpA-R27A-FCCTGGCGCCGGCCCAGATCGCGCGGTACCGCACCGACAAPRbpA-R27A-RGCGCGATCTGGGCCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGGE2Q28APRbpA-Q28A-FGGCGCCGCGCGCCATCGCGCGGTACCGCACCGACAACGPRbpA-Q28A-RGTACCGCGCGATGGCGCGCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGE3I29APRbpA-I29A-FGCCGCGCCAGGCCGCGCGGTACCGCACCGACAACGGCGAPRbpA-I29A-RGGTACCGCGCGGCCTGGCGCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCE4R31APRbpA-R31A-FCCAGATCGCGGCCTACCGCACCGACAACGGCGAGGAGTTPRbpA-R31A-RCGGTGCGGTAGGCCGCGATCTGGCGCGGCGCCAGGTCGTE5Y32APRbpA-Y32A-FGATCGCGCGGGCCCGCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAPRbpA-Y32A-RGTTGTCGGTGCGGGCCCGCGCGATCTGGCGCGGCGCCAGGE6R33APRbpA-R33A-FCGCGCGGTACGCCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAAGTPRbpA-R33A-RCGTTGTCGGTGGCGTACCGCGCGATCTGGCGCGGCGCCAE7R27A,R31A,R33APRbpA-R27A,R31A,R33A-FCCTGGCGCCGGCCCAGATCGCGGCCTACGCCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAAGTCCPRbpA-R27A,R31A,R33A-RCGTTGTCGGTGGCGTAGGCCGCGATCTGGGCCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGGTCE8Q28A,Y32APRbpA-Q28A,Y32A-FGGCGCCGCGCGCCATCGCGCGGGCCCGCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAAGTCPRbpA-Q28A,Y32A-RGTTGTCGGTGCGGGCCCGCGCGATGGCGCGCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGGPrbpA-PFAAACTGCAGTGGCTGATCGTGTCCTPrbpA-BRTTTGGATCCCAGCCGCGCCGACGTGpKT25-FTAAGTAACTAAGAATTCGGCCGTCGpKT25-RCTGCAGCCCGCCGCGTGCGCGCCAGpKT25-RbpA-FGGCGCGCACGCGGCGGGCTGCAGGGATGGCTGATCGTGTCCTGAGGGGCApKT25-RbpA-RCGACGGCCGAATTCTTAGTTACTTATCAGCCGCGCCGACGTGACCGAATG2.5.2 PCR扩增利用quickchange基因定点突变技术，以构建的野生型质粒pMV261-P-Rv2050为模板，通过合成的引物进行扩增。PCR反应体系为40 μl 2×Prime STAR Max Premix 20 μlddH2O 16.3 μl DMSO 2 μlPRbpA-F（10 μM） 0.8 μlPRbpA-R（10 μM） 0.8 μl pMV261-p-Rv2050 0.1 μl PCR反应程序为（1）98 ℃，1 min。（2）98 ℃，10 s；65 ℃，15 s；72 ℃，5 min。进行20个循环。（3）72 ℃，1 min。PCR反应结束后取20 μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.5.3 DpnI消化取10 μl PCR产物加入0.3 μl DpnI，37 ℃消化1 h。2.5.4 转化感受态取3 μl消化产物加入到大肠杆菌DH 5α感受态中，冰上放置30 min，42℃水浴90 s，立即置于冰上3 min，加入不含有抗菌素的LB液体培养基1 mL，于37℃摇床孵育45 min。5000 rpm离心3 min，弃去900 μl上清后混匀菌体沉淀，涂布LB卡那霉素（50 μg/mL）抗性平板。平板倒置于37 ℃培养箱中过夜。2.5.5 克隆的筛选与鉴定利用引物RbpA上下游引物进行菌落PCR对单克隆进行筛选。PCR体系为20 μl2× Taq Plus Master mix 10 μlPrbpA-PF 0.4 μlPrbpA-BR 0.4 μlddH2O 9.2 μl用枪头挑单菌落在上述体系中混匀。扩增程序为touch down PCR（1）94 ℃，1 min；（2）94 ℃，10 s；60 ℃→50 ℃（每循环降低0.5 ℃），15 s；72 ℃，30 s。共20个循环；（3）94 ℃，10 s；50 ℃，15 s；72 ℃，30 s。共10个循环；（4）72 ℃，1 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。阳性克隆接种LB卡那霉素（50 μg/ml）抗性液体培养基，过夜培养。2.5.6 提取质粒并测序首先取500 μl菌液加入到500 μl 50%甘油中，做好标记，-80 ℃保存。剩余菌液提取质粒，用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒完成。取10 μl质粒送至天一辉远公司测序。2.6 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的回复2.6.1 电转感受态将电转杯放入超净台中灭菌30 min；将质粒加入实验室已经制备好的MsRbpAm电转感受态中，轻微混匀；将感受态细胞加入电转杯电极之间，2500V电转；用制备好的7H9培养基1 ml将感受态细胞从电转杯中洗出；37 ℃复苏3 h，涂7H10平板（含链霉素20 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL）。平板置于37 ℃培养箱，培养两天。2.6.2 接种培养挑单克隆接种到2 ml 7H9培养基（含链霉素10 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL），37 ℃摇床培养两天。2.6.3 质粒鉴定和菌液转接取200 μl菌液，13000 rpm离心1 min，弃培养基。加入氯仿乙醇（2:1）200 μl重悬菌体，13000 rpm离心1 min，弃上清，置80 ℃烘箱晾干，加入30 μl洗脱缓冲液EB，置100 ℃金属加热器10 min后即可作为PCR模板进行鉴定。PCR体系为20 μl2× Taq mix 10 μlPrbpA-PF 0.4 μlPrbpA-BR 0.4 μl质粒 0.1 μlddH2O 9.1 μl 反应程序如下（1）94 ℃，1 min；（2）94 ℃，10 s；60 ℃→50 ℃（每循环降低0.5 ℃），15 s；72 ℃，30 s。共20个循环；（3）94 ℃，10 s；50 ℃，15 s；72 ℃，30 s。共10个循环；（4）72 ℃，1 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。质粒鉴定正确后进行菌液转接。首先每管菌液各取200 μl，测定OD600，选OD600值大于1的菌液进行1:100转接，即取20 μl菌液加入到2 mL7H9（含链霉素10 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL）培养基中，置37 ℃摇床过夜。每组设置两个重复。2.6.4 菌液OD600的测定及点斑试验取过夜菌液200 μl，测定OD600，选OD600值大于1的菌液进行1:100转接到含诱导剂ATc和不含诱导剂ATc的7H9液体培养基中，置37 ℃摇床过夜。每组设置两个重复。第二天测各管菌液OD600值。另取过夜菌液50 μl加入到500 μlPBS中，再依次倍比稀释，取浓度为10-2~10-5的菌液，依次点斑到含诱导剂ATc和不含诱导剂ATc的7H10（含链霉素20 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL）平板中，37 ℃培养箱培养两天，观察菌落生长情况。2.7 同源重组克隆技术构建pKT25b-rbpAm2.7.1 制备载体pKT25b利用Phanta超高保真酶扩增载体。PCR体系为50 μl2×Phanta Max Buffer 25 μlddH2O 21 μldNTP 1 μlpKT25-F 1 μlpKT25-R 1 μlPhanta Max 1 μlpKT25b 0.2 μl 反应程序如下（1）98 ℃，5 min；（2）98 ℃，10 s；58 ℃→48 ℃，15 s（每循环降低0.5 ℃）；72 ℃，2 min。共30个循环；（3）72 ℃，10 min。 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收，测浓度。2.7.2 扩增目的片段rbpAm根据ClonExpress II one step clone protocol引物设计原则，利用Primer5.0软件设计一对5’端含有线性载体末端同源序列的引物，并送至天一辉远公司合成。以E1-E8质粒为模板，扩增目的片段。PCR体系为50 μl2×Prime STAR Max Premix 25 μlddH2O 23 μlpKT25-RbpA-F 1 μlpKT25-RbpA-R 1 μl质粒 0.1 μl反应程序如下（1）98 ℃，5 min；（2）98 ℃，10 s；60 ℃→50 ℃，15 s（每循环降低0.5 ℃）；72 ℃，30 s。共30个循环；（3）72 ℃，10 min。 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收，测浓度。2.7.2 重组克隆构建质粒pKT25b-rbpAm重组反应体系为10 μl，如下 ddH2O up to 20 μl 5× CE II Buffer 2 μl载体pKT25b 50~200 ng片段rbpAm 20~200 ng 重组酶ExnaseII 1 μl在冰上配上述体系，混匀后置于37 ℃反应30 min。反应完成后立即置于冰上5 min。取反应液转化E.coli DH5α感受态，涂布Kan抗性平板。次日，利用2× Taq mix、引物pKT25-F、pKT25-R进行菌落PCR鉴定单克隆。将PCR阳性菌落接种kan抗性LB液体培养基培养过夜，提取质粒后保存备用。2.8 细菌双杂交试验2.8.1 配制反应溶液按下列配方配制溶液，灭菌后使用。Z BufferNa2HPO4·12H2O 100 mM NaH2PO4·2H2O 40 mM KCl 10 mM MgSO4 1 mM β-巯基乙醇 5.4 μl/mL 酶活底物Na2HPO4·12H2O 60 mM NaH2PO4·2H2O 40 mM ONPG 4 mg/mL β-巯基乙醇 2.7 μl/mL酶活终止液Na2CO3: 1 M2.8.2 转化双质粒取大肠杆菌BTH101感受态，冰上放置10min化冻。将质粒pBT18a-SigA和 pKT25a-rbpAm各1 μl均加入到一管感受态中，冰上放置30 min；42 ℃热激90 s，立即置于冰上3 min；加入1 mL无抗LB液体培养基，28 ℃摇床复苏45 min。5000 rpm离心3 min，弃去900 μl上清后混匀菌体沉淀，涂布LB卡那霉素（50 μg/mL）、氨苄青霉素（50 μg/mL）抗性平板。平板倒置于33 ℃培养箱中培养两天。第三天，挑单菌落接种5 mL含卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素50 μg/mL、IPTG1 μM的LB液体培养基，每次挑3个单菌落，每块平板接3管LB液体培养基，180 rpm、30 ℃摇床过夜。2.8.3 酶活性测定取200 μl菌液测定OD600值，取20 μl菌液加入到含有Z buffer450 μl、氯仿20 μl、0.1%SDS10 μl的EP管中，每管菌液设置3个重复。30 min后于每个EP管中加入100 μl酶活底物（含ONPG0.04 g/10 mL），记录加入时间并振荡均匀，待溶液由浅黄变黄时，加入250 μl终止液并记录终止时间。测定OD420及OD550。用下列公式计算酶活性酶活=1000*（OD420-1.75*OD550）/（OD600*加入反应的菌液体积*反应时间）菌液体积以mL为单位，反应时间以min为单位。3 结果与分析 3．1 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的构建 3．1．1 PCR扩增以构建的野生型质粒pMV261-P-Rv2050为模板，设计的含有预期突变位点的引物进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像如图5所示，扩增产物大于4500 bp，与预期相符，初步说明已扩增出目的质粒。图5 PCR扩增M250 bp DNA Ladder；E1-E8突变型pMV261-P-Rv2050质粒扩增结果3．1．2 克隆筛选取经DpnI消化后的PCR产物3 μl转化E.coli DH5α感受态，37 ℃过夜培养后平板上形成数百个单克隆。每块平板挑取5个单克隆，利用Taq酶和RbpA上下游引物PrbpA-PF、PrbpA-BR进行菌落PCR鉴定，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，若克隆正确应有约300 bp大小的条带出现。经鉴定，除E2的第1个单克隆外，其余均确认为阳性克隆，如图6所示。图6 菌落PCRM250 bp DNA Ladder；E1-E8转化突变型pMV261-P-Rv2050质粒的E.coliDH5α菌落PCR产物；C野生型pMV261-P-Rv2050质粒扩增结果3．1．3 序列测定与分析 将克隆筛选鉴定的阳性克隆接种至5 mL Kan抗性LB液体培养基，37 ℃摇床过夜培养。次日，收集4 mL菌液提取质粒送至生工公司测序，利用软件DNAstar 7.1将测序结果与结核分枝杆菌rbpA基因（Rv2050）序列进行比对，结果显示各位点已正确突变，说明已成功构建8株突变型pMV261-P-Rv2050质粒，如图7所示。 图7 序列比对图3．2 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的回复将构建的点突变pMV261-RbpA质粒电转化实验室已制备好的rbpA沉默的耻垢分枝杆菌（MsRbpAm）感受态，涂布7H10抗性平板。经质粒鉴定正确后，将菌液按1:100转接，继续培养以得到生长状态较一致的菌液（OD600值达到1左右），将此时的菌液点斑7H10平板并接种7H9液体培养基，通过添加ATc诱导耻垢分枝杆菌rbpA基因沉默，观察固体平板中菌落生长状况并测定菌液OD，分别与不添加ATc的对照组进行比较，验证突变型质粒回复MsRbpAm后的生长情况。点斑平板如图8所示，在诱导剂ATc存在时，E5、E8的生长菌落与不添加ATc的对照组相比，各浓度组都明显变小，甚至无菌落出现；并与该结构域27到33位氨基酸缺失突变的回复效应较一致。菌液OD值见图9，在ATc存在时，E5、E8的菌液OD600值与不加ATc的对照组相比减小。由此可见，在诱导剂ATc存在时，固体培养与液体培养的E5和E8的生长情况与不添加ATc相比，均受到一定抑制。因此，可得到E5和E8即突变型质粒pMV261-RbpAY32A和pMV261-RbpAQ28A,Y32A不能回复MsRbpAm。质粒pMV261-RbpAY32A突变位点为32位酪氨酸，质粒pMV261-RbpAQ28A,Y32A突变位点为28位谷氨酸和32位酪氨酸，而28位谷氨酸突变的质粒E2能够回复MsRbpAm，这说明RbpA蛋白第28位谷氨酸的突变对耻垢分枝杆菌的正常生长没有影响，而有着重要影响的是E5和E8共同的突变位点32位酪氨酸，因此RbpA蛋白第32位酪氨酸可能对RbpA的功能有着重要影响。图8 点斑试验m-v:阳性对照；m-c:阴性对照；E1-E转化突变型pMV261-P-Rv2050质粒的MsRbpAm生长菌落 图9 菌液OD600的测定M-v:阳性对照;m-c:阴性对照;E1-H1:转化突变型pMV261-P-Rv2050质粒的MsRbpAm菌液OD值E:转化结构域27-33位氨基酸缺失的pMV261-P-Rv2050质粒的MsRbpAm菌液OD值3.3 细菌双杂交试验3.3.1 扩增载体pKT25b以利用pKT25b为模板，Phanta超高保真酶进行PCR扩增制备线性载体。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱如图10所示，扩增出约4500 bp的条带，大小与预期相符且特异性强。利用Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，超微量分光光度计测定浓度为80.1 ng/mL，-20 ℃冻存备用。 图10 PCR扩增载体pKT25bM:200bp DNA Maker;1-2:PCR扩增产物3.3.2 扩增目的片段以构建的突变型质粒pMV261-P-Rv2050为模板，利用设计的5’端包含线性载体两末端序列的上下游引物pKT25-RbpA-F、pKT25-RbpA-R，扩增出包含突变位点的rbpA目的片段（rbpAm）。电泳图谱如图11所示，E2的条带不单一，其余泳道特异性均较高，分别切下大小在300 bp附近的条带，利用Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒回收。超微量分光光度计测定浓度。图11 扩增目的片段rbpAmM:200bp DNA Maker; E1-E8:目的片度rbpAm3.3.3 重组反应根据ClonExpress II One Step Cloning Kit protocol提供的最适载体使用量和最适插入片段使用量的计算公式最适克隆载体使用量 = [0.01×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)最适插入片段使用量 = [0.02×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)以及制备的线性载体pKT25b和目的片段rbpAm的浓度确定各反应成分的体积，配制10 μl反应体系，如下ddH2O 5.7 μl5×CE II Buffer 2 μl线性化克隆载体 0.3 μl插入片段扩增产物 1 μlExnase II重组酶 1 μl 重组反应结束后将10 μl产物全部转化E.coli DH5α，涂布Amp（100 μg/mL）抗性平板。次日，每块平板上均形成数十个至数百个单克隆，每块平板挑5个单克隆利用载体引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱如图12所示，将条带在500 bp附近的克隆确认为阳性克隆，并每组挑两个阳性克隆接种Amp100 LB液体培养基，37 ℃摇床过夜培养后提取质粒，利用细菌双杂交试验检测该质粒与实验室制备好的pBT18-SigA的相互作用。 图12 菌落PCR琼脂糖电泳M250 bp DNA Ladder;C:质粒pKT25b-rbpAWT扩增结果E1-E8转化pKT25b-rbpAm+pBT18a-sigA重组反应产物E.coliDH5α生长菌落PCR鉴定3.3.4 细菌双杂交试验将重组克隆构建的各质粒分别与pBT18a-SigA共转化BTH101感受态，涂布Kan和Amp抗性LB平板（抗生素浓度均为50 μg/mL），30 ℃培养两天后挑单克隆接种Kan和Amp抗性LB液体培养基，30 ℃摇床摇菌约20 h时，测定各组菌液酶活性，通过酶活（U）大小判断各突变的蛋白与σA蛋白的相互作用强度，结果转化突变型质粒E5和E8的BTH101的培养菌液表现出与野生型RbpA相似的β-半乳糖苷酶活性，如图13所示。这说明突变后的蛋白不会影响其与σA的相互作用。 图13 酶活性测定C1:pKT25b+pBT18a;C2:pKT25b-zip+pBT18a-zip;WT:pKT25b-rbpAWT+pBT18a-sigA;E1-E8:pKT25b-rbpAm+pBT18a-sigA;E:C2:pKT25b-rbpA27-33+pBT18a-sigA4 讨论结核病是目前全球范围内对人类威胁最大的致死性传染病之一，近年来由于多种药物的长期使用导致了耐多药结核菌株和广泛耐药菌株出现，因此，急需寻找新型抗结核药物作用靶点。RNA聚合酶结合蛋白RbpA已被证实是结核分枝杆菌生长必需蛋白，它可能作为重要的抗分枝杆菌靶点。本论文基于实验室前期研究工作，利用quickchange基因定点突变技术对结构域第27到33位氨基酸逐一进行丙氨酸替换突变，筛选该结构域发挥作用的位点。结果显示，第32位酪氨酸突变能够明显抑制耻垢分枝杆菌的生长，而细菌双杂交试验结果表明该位点的突变并不影响RbpA蛋白的表达。因此，该32位酪氨酸是影响RbpA蛋白功能的重要位点，但该位点发挥关键作用的机制不同于之前研究报道的与RNA聚合酶β亚基和σ因子相互作用，推测RbpA还存在其他作用机制来影响其作为生长必需蛋白的功能。虽然细菌双杂交表明Y32A突变后表现出野生型RbpA一样的与σA相互作用强度，表明Y32A不会影响其在大肠杆菌中的表达，但该位点突变是否会影响其在分枝杆菌中的表达还不清楚，因此本实验还不能完全排除突变后的蛋白是通过RbpA蛋白的表达来影响分枝杆菌的生长。这些问题还需要实验室进一步研究探讨。在本研究中，利用rbpA沉默的耻垢分枝杆菌回复突变型质粒，主要从以下两个方面考虑一方面，结核分枝杆菌生长速度缓慢并具有致病性，试验周期长且对生物安全性要求较高，而耻垢分枝杆菌是快速生长的非致病性分枝杆菌；另一方面，耻垢分支杆菌与结核分枝杆菌同属分枝杆菌属，遗传背景与结核分枝杆菌相似，在其中表达的蛋白质更接近于天然构象，更利于蛋白质功能的研究，而且耻垢分枝杆菌RbpA与结合分枝杆菌RbpA的同源性很高，保证了回复试验结果的可靠性。该rbpA沉默的耻垢分枝杆菌的构建依据Francesca Boldrin等构建的TetR/Pip off 系统，通过改造目的基因rbpA的启动子，使其表达受Pip I（Pristinomycin I,普那霉素I）受体依赖的Pptr启动子的调控。当诱导剂ATc存在时，ATc结合TetR（Tetracycline receptor，四环素受体），从而Pip表达，抑制Pptr启动子，目的基因rbpA沉默，当诱导剂ATc不存在时，TetR抑制Pip表达，从而目的基因rbpA表达[14]。总结本实验，还应该注意以下几点（1）在quickchange定点突变PCR中，由于结核分枝杆菌的G+C含量较高，故在扩增体系中加入5%的DMSO以提高扩增效率，由于QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit使用的是低次数的循环延伸而并非PCR，所以本研究采用20个循环而非常规的30个循环，以减少引入突变。使用touch down PCR也是提高阳性率的措施。（2）在突变型pMV261-P-Rv2050质粒回复MsRbpAm时，菌液OD值的测定是在接菌培养约28h进行的，时间较长，导致结果不是很理想，因为这些突变型质粒只是抑制耻垢分枝杆菌的生长，长时间培养后这种抑制效应会减弱。实际操作应缩短摇菌时间，在以后实验过程中还应预先了解菌株的生长特性，注意时间的安排。实际操作过程中还发现耻垢分枝杆菌很容易沉淀，因此在取菌液时特别要注意混匀，并观察底部有无白色菌体沉淀，防止所取菌液浓度偏低，造成实验误差。（3）利用同源重组克隆技术制备重组质粒pKT25b-rbpAm时，要注意重组反应体系要在冰上配制，重组酶最后加入，并且应现取现用，不能置室温或冰上时间太长。另外，反应体系线性载体和插入片段的量和浓度需按照protocol的说明正确计算，以免降低重组反应效率。（4）在细菌双杂交试验中，每块平板需挑3个单克隆进行液体培养基接种，并进行3个重复，测定酶活时每个克隆还需3个平行重复，以减少误差，保证实验结果的可靠性。测定酶活时要注意反应时间的控制，计时要精确，操作时防止菌体沉淀，加反应液时注意氯仿需加入到液体底部以防挥发。（5）实验时，平板有其他菌污染的现象出现，因此在细菌接种、涂布平板等操作时要严格进行无菌操作。致谢参考文献[1]WHO. (2014)Global Tuberculosis Report. WHO.[2]Zhang Y, Yew W. 结核分枝杆菌耐药机制[J]. 国际结核病与肺部疾病杂志中文版, 2009, 13(11): 1320–1330.[3]朱玉贤, 李毅, 郑晓峰. 现代分子生物学[M]. 第三版. 北京: 高等教育出版社, 2007: 69-70.[4]Paget MS, Molle V, Aharonowitz Y, et al. Defining the disulphide stress response in Streptomyces coelicolor A3(2): identification of the σR regulon[J]. Molecular Microbiology, 2001, 42(4): 1007–1020. [5]Newell KV, Thomas DP, Brekasis D, et al. The RNA polymerase-binding protein RbpA confers basal levels of rifampicin resistance on Streptomyces coelicolor[J]. Molecular Microbiology, 2006, 60(3): 687–696.[6]Dey A, Verma AK, Chatterji D. Role of an RNA polymerase interacting protein, MsRbpA, from Mycobacterium smegmatis in phenotypic tolerance to rifampicin[J]. Microbiology, 2010, 156: 873–883.[7]Dey A, Verma AK, Chatterji D. Molecular insights into the mechanism of phenotypic tolerance to rifampicin conferred on mycobacterial RNA polymerase by MsRbpA[J]. Microbiology, 2011, 157: 2056–2071.[8]Hu Y, Morichaud Z, Chen S, et al. Mycobacterium tuberculosis RbpA protein is a new type of transcriptional activator that stabilizes the σA-containing RNA polymerase holoenzyme[J]. Nucleic Acids Research, 2012: 1-11.[9]Hu Y, Morichaud Z, Perumal AS, et al. Mycobacterium RbpA cooperates with the stress-response σB subunit of RNA polymerase in promoter DNA unwinding[J]. Nucleic Acids Research, 2014: 10399-10408.[10]Tabib-Salazar A, Liu B, Doughty P, et al. The actinobacterial transcription factor RbpA binds to the principal sigma subunit of RNA polymerase[J]. Nucleic Acids Research, 2013: 41(11): 5679-5691.[11]Bortoluzzi A, Muskett FW, Waters LC, et al. Mycobacterium tuberculosis RNA Polymerase-binding Protein A (RbpA) and Its Interactions with Sigma Factors[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2013, 288: 14438-14450.[12]Verma AK, Chatterji D. Dual role of MsRbpA: transcription activation and rescue of transcription from the inhibitory effect of rifampicin[J]. Microbiology, 2014, 160: 2018-2029.[13]李建华.细菌双杂交系统及其在病原微生物学中的应用[J]. 微生物学免疫学进展,2006,34(3)34-40.[14]Boldrin F, Casonato S, Dainese E, et al. Development of a repressible mycobacterial promoter system based on two transcriptional repressors[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(12): 1-11.
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言1
1.1 结核分枝杆菌与肺结核1
1.2 结核分枝杆菌耐药性2
1.3 RbpA的发现与研究概况2
1.4 本研究使用的技术 2
1.4.1 quickchange基因定点突变技术2
1.4.2 同源重组克隆技术3
1.4.3 细菌双杂交系统4
1.5 本研究的目的与意义5
2 材料与方法5
2.1 菌株和质粒 5
2.2 主要试剂6
2.3 培养基6
2.4 主要仪器设备6
2.5 突变型pMV261PRv2050质粒的构建6
2.6 突变型pMV261PRv2050质粒的回复7
2.7 重组克隆技术构建pKT25brbpAm8
2.8 细菌双杂交试验9
3 结果与分析10
3.1 突变型pMV261PRv2050质粒的构建10
3.2 突变型pMV261PRv2050质粒的回复11
3.3 细菌双杂交试验12
4 讨论14
致谢16
参考文献16
结核分枝杆菌RbpA蛋白功能域研究
引言
erase binding protein RbpA is specific to Actinmycetes. It is essential for mycobacteria growth and can bind to σA, which initiates the transcription of housekeeping genes together with RNA polymerase core enzyme. So, RbpA may be a promising target of anti-tuberculosis molecules. However, the function and mechanism of RbpA has not been clearly clarified. In our previous research, we find the domain Arg 27 to Arg 33 of MtbRbpA is essential for its function. This thesis aims to find out the important locus of the functional domain though quickchange gene site-directed mutation analysis. Our results show that Y32 is required for the function of RbpA, and the affinity of MtbRbpAY32A with σA is similar to that of wild type MtbRbpA and σA. Based on these data, we propose that RbpA may functions through some other novel mechanism in addition to interacting with σA.1 引言1.1 结核分枝杆菌与肺结核肺结核（tuberculosis, TB）是严重危害人类健康的慢性传染病，是世界普遍公认的最古老的疾病之一，在人类历史上曾造成很大破坏，导致数百万人死亡。自1993年世界卫生组织（World Health Organization , WHO）将结核病列为全球公共健康问题以来，世界各国为防治结核病做出了大量努力。据统计，1990~2013年间，结核病的死亡率下降了45%。但目前，结核病仍引起较高的发病率和死亡率，其造成的死亡人数仅次于人类免疫缺陷病毒（the human immunodeficiency virus, HIV），WHO统计2013年结核病的发病人数为900万，死亡人数为150万[1]。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）是肺结核的病原菌，可侵入全身组织器官，但以肺部感染最为多见。结核分枝杆菌的细胞壁脂质含量较高，药物不易透过细胞壁，而且侵入机体后主要寄居在巨噬细胞内，能够长期存活导致潜伏感染。1.2 结核分枝杆菌耐药性耐药结核菌株的出现是结核病难以控制的原因之一，给结核病的防控带来了阻碍，寻找新型抗结核药和药物作用新靶点是当前研究热点。抗生素产生耐药主要有三种机制降低细胞膜的通透性、产生降解或灭活酶类和药物靶位的突变。结核分枝杆菌耐药分子机制主要是耐药相关基因突变，如最主要的一线抗结核药物利福平，其抗菌机制主要是通过结合细菌RNA聚合酶β亚基从而抑制RNA的合成，而耐药相关基因rpoB突变可能导致结核分枝杆菌对利福平产生耐药。大部分结核菌株耐多药的分子机制是染色体上多个相互独立基因各自突变逐步累加。但由于结核分枝杆菌耐药的复杂性，是否存在其他耐药相关基因以及其他耐药机制有待于进一步研究，而对结核分枝杆菌耐药机制进行研究可能进一步指导新型抗结核药和药物作用新靶点的研发[2]。1.3 RbpA的发现与研究概况2001年，RNA聚合酶结合蛋白（RNA polymerase-binding protein, RbpA）是在分离纯化天蓝链霉菌RNA聚合酶时共纯化出的一种14 kDa的新蛋白，序列分析表明RbpA仅存在于放线菌。随后，该实验室对天蓝链霉菌RbpA的功能进行了研究，发现缺失突变rbpA该菌表现出较慢的生长表型，而且对利福平敏感性明显增强，证明RbpA与利福平耐药存在密切关系。另一项研究对耻垢分枝杆菌RbpA的功能进行了探讨，结果显示，过表达RbpA能够增强耻垢分枝杆菌对利福平的耐受，且证明RbpA作用于RNA聚合酶β亚基，而利福平的作用位点同样在β亚基，推测二者的结合位点有重叠。随后该实验室进行了RbpA诱导的利福平耐受现象的分子机制研究，提出当RbpA存在时，利福平从其结合位点释放，从而不能发挥抑制转录的作用，并进一步生物物理学研究揭示RbpA的作用位点在β亚基和β’亚基接合处[6-7]。本实验室与法国国家科研中心合作也对结核分枝杆菌RbpA的功能进行了研究，证实了RbpA与RNA聚合酶的结合位点并不与利福平的结合位点重叠，并提出了RbpA激活转录起始的新机制，即RbpA能够修饰RNA聚合酶核心酶的结构，从而增强核心酶与σA的亲和力，促进转录复合物的组装。进一步的探讨发现，RbpA仅增强σA和RNA聚合酶核心酶的结合，而对σF无明显作用，推测RbpA的这种促进作用具有σ因子特异性[8]。随后检测了RbpA对结核分枝杆菌中报道的13个σ因子（σA-σM）的调节作用，发现RbpA还能够促进RNA聚合酶与σB的结合，促进转录过程中开放复合物RPo的形成[9]。另一项研究证实了RbpA在σA和核心酶结合时发挥重要的促进作用，还通过细菌双杂交试验证明了RbpA与σA相互作用区域位于该蛋白C端[10]。近几年，关于RbpA功能的研究不断推进，其蛋白结构也逐渐被解析[11]。研究者在探讨耻垢分枝杆菌RbpA功能时发现其与RNA聚合酶β亚基相互作用区域位于RbpA蛋白58-73位氨基酸[12]。针对RbpA蛋白的功能区域，本实验室前期已进行了初步的探讨。如构建耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）rbpA基因沉默菌株（MsRbpAm），并构建了能表达RbpA蛋白的回复质粒。因为rbpA基因为生长必需基因，其沉默后MsRbpAm菌株不能正常生长，而转入回复质粒后，质粒上rbpA基因能表达正常的RbpA蛋白，细菌则能表现出正常生长。本实验室前期构建回复质粒上rbpA基因的不同区域缺失突变，通过分析不同突变的RbpA蛋白回复MsRbpAm菌株后的生长情况，发现第27到33位氨基酸区域突变后不能正常回复RbpA的功能，说明该结构域是RbpA作为生长必需蛋白的重要功能域。但是，该结构域影响RbpA作为生长必需蛋白的机制以及具体发挥功能的位点尚不清楚。1.4 本研究使用的技术1.4.1 Quickchange定点突变技术基因定点突变技术是研究蛋白质结构和功能关系的重要手段，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用来研究某特定氨基酸对蛋白质结构、催化活性等的影响，或用来改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体等。目前常采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变[3]。本研究使用QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit实现基因定点突变，该方法是PCR介导的定点突变技术的改造，具有明显的优势，基本原理如图1所示首先将待突变基因克隆入环状质粒，然后设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真Pfu聚合酶循环延伸。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。然后用内切酶DpnI（识别序列为甲基化的GATC）消化延伸产物，由于原来的模板质粒来源于大肠杆菌，是经dam甲基化修饰，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不会被切开，这样即可消化模板质粒。消化产物转化大肠杆菌，利用大肠杆菌自身修复系统可环化缺刻，即可得到突变质粒的克隆。该试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配，得到突变质粒，使得操作简单有效。该技术的关键是设计一对含有预期突变位点的互补引物，引物设计基本原则如下（1）需设计两条均包含突变位点的互补引物；（2）引物长度通常为25~45 bp，Tm值应大于78 ℃；（3）突变点两侧碱基数通常为10~15 bp；（4）两条引物的GC含量应大于40%，且至少以一个G或C终止。图1 Quickchange定点突变技术原理示意图引自Agilent Technologies公司QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit protoco1.4.2 同源重组克隆技术基因克隆技术是将外源DNA片段插入具有复制能力的载体DNA中，使外源DNA 得以复制的过程。目前，研究者使用的克隆方法主要很多，例如酶切-连接经典克隆、位点特异性重组克隆技术、DNA共转化等。其中，同源重组克隆技术是优于其他克隆技术，简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，本研究使用ClonExpress II One Step Cloning Kit来实现目的基因与载体的重组。其基本原理如图2所示首先选择合适的载体与克隆位点，利用限制性内切酶消化或PCR扩增制备线性化载体。然后设计5’包含线性化克隆载体末端同源序列（15 bp~20 bp）的引物，进行插入片段PCR扩增，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列。线性载体和插入片段PCR产物在同源重组酶的催化下，末端序列发生同源重组。该同源重组克隆技术不依赖连接酶进行连接，不需用考虑酶切位点而将插入片段克隆至载体的任何位点。图2 同源重组克隆技术原理示意图引自Vazyme公司ClonExpress II One Step Cloning Kit protocol1.4.3 细菌双杂交系统细菌双杂交系统是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的，用于研究蛋白质相互作用的方法。根据百日咳博代杆菌中cya基因编码的钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，其激活区可分为T18、T25两个相互独立的片段，将这两个片段引入cya基因缺陷型大肠杆菌并进行表达，它们不能相互识别与作用，因此不能互补大肠杆菌cya-缺陷型性状，表现为β-半乳糖苷酶活性很低。如果将T18、T25分别与一对可相互作用的蛋白质融合并进行表达，这两个功能区相互识别后腺苷酸环化酶恢复活性，从而可使菌株表现为cya+表型，如较高的β-半乳糖苷酶活性[16]，如图3所示。图3 细菌双杂交系统原理引自Euromedex公司Bacterial Adenylate Cyclase Two-Hybrid System Kit protocol1.5 本研究主要内容、目的与意义RbpA已被证实在分枝杆菌中为生长必需蛋白，但目前RbpA的功能域和作用机制还不十分清楚，本论文基于实验室前期研究，利用quickchange基因定点突变技术将筛选到的RbpA重要功能域第27-33氨基酸进行丙氨酸替换突变，分析这些突变后的蛋白回复MsRbpAm 生长的情况，来确定该功能域发挥作用的位点，同时，本论文还通过细菌双杂交技术分析各位点突变的RbpA与σA蛋白的相互作用，探讨突变后的蛋白对其功能的影响是否是通过改变与σA互作来实现，从而为进一步阐释RbpA蛋白的作用机制奠定基础。2 材料与方法 2．1 菌株和质粒大肠杆菌DH 5α、BTH101由本实验室保存，耻垢分枝杆菌rbpA沉默菌株（MsRbpAm）由本实验室构建。质粒pKT25b及pBT18a-sigA由本实验保存，质粒pMV261-P-Rv2050由本实验构建保存，载体图谱如图4所示。大肠杆菌DH 5α作为克隆宿主菌，在LB液体或固体培养基中生长，培养温度为37 ℃；BTH101作为细菌双杂交系统报告菌株，在LB液体或固体培养基中生长，培养温度为30 ℃。耻垢分枝杆菌在7H9液体培养基或7H10固体培养基中生长，培养温度为37 ℃。图4 pMV261-P-Rv2050载体图谱2.2 主要试剂 250 bp DNA ladder及Prime STAR Max Premix购自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司；DpnI购至New England Biolabs（NEB）公司；2×Taq Plus Master Mix购至Vazyme公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA小量试剂盒购至Axygen公司；QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit购至Agilent公司。胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl购自英国OXOID公司；商品化7H9培养基、7H10培养基购自美国BD公司；氨苄青霉素、卡那霉素购自上海生工。氨苄青霉素（Amp)储存液称取500 mg氨苄青霉素溶于10 mL水中，过滤除菌，-20 ℃保存备用。卡那霉素(Kan)储存液配制100 mg/mL储存液，-20 ℃保存。ATc储存液配制250 μg/mL储存液， -20 ℃避光保存。2．3 培养基LB培养基将胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，溶于800 mL去离子水中，用5 mol /L NaOH 调pH 值至7. 0，定容至1 L。120 ℃高压灭菌20 min。固体培养基另加15 g琼脂粉。7H9培养基根据商品说明配制并灭菌，使用前每100 mL另加入40%葡萄糖500 μl、10%吐温-80 500 μl、50%甘油400 μl、3M Nacl500 μl。7H10培养基根据商品说明配制并灭菌，使用前每100 mL中50%甘油1 mL。2.4 主要仪器设备 PCR仪（eppendorf）；离心机（eppendorf centrifuge 5424）；电转仪（eppendorf Electroporator 2510）；XMTD-8222型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；THZ-03M2型恒温摇床（上海博彩生物科技有限公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（Gene公司）；GHP-9160型隔水式培养箱（上海圣欣科学仪器有限公司）；酶标仪（Gene公司）。2.5 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的构建2.5.1 引物的设计与合成根据GenBank登陆的rbpA（Rv2050）基因序列以及QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis protocol中引物设计原则，利用Primer5.0软件设计9对含有预期突变位点的互补引物及相关检测引物，并送至天一辉远公司合成。序列如表1所示。表1 引物序列numberMutation sitePrimersSequence( 5→3)E1R27APRbpA-R27A-FCCTGGCGCCGGCCCAGATCGCGCGGTACCGCACCGACAAPRbpA-R27A-RGCGCGATCTGGGCCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGGE2Q28APRbpA-Q28A-FGGCGCCGCGCGCCATCGCGCGGTACCGCACCGACAACGPRbpA-Q28A-RGTACCGCGCGATGGCGCGCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGE3I29APRbpA-I29A-FGCCGCGCCAGGCCGCGCGGTACCGCACCGACAACGGCGAPRbpA-I29A-RGGTACCGCGCGGCCTGGCGCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCE4R31APRbpA-R31A-FCCAGATCGCGGCCTACCGCACCGACAACGGCGAGGAGTTPRbpA-R31A-RCGGTGCGGTAGGCCGCGATCTGGCGCGGCGCCAGGTCGTE5Y32APRbpA-Y32A-FGATCGCGCGGGCCCGCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAPRbpA-Y32A-RGTTGTCGGTGCGGGCCCGCGCGATCTGGCGCGGCGCCAGGE6R33APRbpA-R33A-FCGCGCGGTACGCCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAAGTPRbpA-R33A-RCGTTGTCGGTGGCGTACCGCGCGATCTGGCGCGGCGCCAE7R27A,R31A,R33APRbpA-R27A,R31A,R33A-FCCTGGCGCCGGCCCAGATCGCGGCCTACGCCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAAGTCCPRbpA-R27A,R31A,R33A-RCGTTGTCGGTGGCGTAGGCCGCGATCTGGGCCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGGTCE8Q28A,Y32APRbpA-Q28A,Y32A-FGGCGCCGCGCGCCATCGCGCGGGCCCGCACCGACAACGGCGAGGAGTTCGAAGTCPRbpA-Q28A,Y32A-RGTTGTCGGTGCGGGCCCGCGCGATGGCGCGCGGCGCCAGGTCGTGGTTGCGGTCGGPrbpA-PFAAACTGCAGTGGCTGATCGTGTCCTPrbpA-BRTTTGGATCCCAGCCGCGCCGACGTGpKT25-FTAAGTAACTAAGAATTCGGCCGTCGpKT25-RCTGCAGCCCGCCGCGTGCGCGCCAGpKT25-RbpA-FGGCGCGCACGCGGCGGGCTGCAGGGATGGCTGATCGTGTCCTGAGGGGCApKT25-RbpA-RCGACGGCCGAATTCTTAGTTACTTATCAGCCGCGCCGACGTGACCGAATG2.5.2 PCR扩增利用quickchange基因定点突变技术，以构建的野生型质粒pMV261-P-Rv2050为模板，通过合成的引物进行扩增。PCR反应体系为40 μl 2×Prime STAR Max Premix 20 μlddH2O 16.3 μl DMSO 2 μlPRbpA-F（10 μM） 0.8 μlPRbpA-R（10 μM） 0.8 μl pMV261-p-Rv2050 0.1 μl PCR反应程序为（1）98 ℃，1 min。（2）98 ℃，10 s；65 ℃，15 s；72 ℃，5 min。进行20个循环。（3）72 ℃，1 min。PCR反应结束后取20 μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.5.3 DpnI消化取10 μl PCR产物加入0.3 μl DpnI，37 ℃消化1 h。2.5.4 转化感受态取3 μl消化产物加入到大肠杆菌DH 5α感受态中，冰上放置30 min，42℃水浴90 s，立即置于冰上3 min，加入不含有抗菌素的LB液体培养基1 mL，于37℃摇床孵育45 min。5000 rpm离心3 min，弃去900 μl上清后混匀菌体沉淀，涂布LB卡那霉素（50 μg/mL）抗性平板。平板倒置于37 ℃培养箱中过夜。2.5.5 克隆的筛选与鉴定利用引物RbpA上下游引物进行菌落PCR对单克隆进行筛选。PCR体系为20 μl2× Taq Plus Master mix 10 μlPrbpA-PF 0.4 μlPrbpA-BR 0.4 μlddH2O 9.2 μl用枪头挑单菌落在上述体系中混匀。扩增程序为touch down PCR（1）94 ℃，1 min；（2）94 ℃，10 s；60 ℃→50 ℃（每循环降低0.5 ℃），15 s；72 ℃，30 s。共20个循环；（3）94 ℃，10 s；50 ℃，15 s；72 ℃，30 s。共10个循环；（4）72 ℃，1 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。阳性克隆接种LB卡那霉素（50 μg/ml）抗性液体培养基，过夜培养。2.5.6 提取质粒并测序首先取500 μl菌液加入到500 μl 50%甘油中，做好标记，-80 ℃保存。剩余菌液提取质粒，用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒完成。取10 μl质粒送至天一辉远公司测序。2.6 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的回复2.6.1 电转感受态将电转杯放入超净台中灭菌30 min；将质粒加入实验室已经制备好的MsRbpAm电转感受态中，轻微混匀；将感受态细胞加入电转杯电极之间，2500V电转；用制备好的7H9培养基1 ml将感受态细胞从电转杯中洗出；37 ℃复苏3 h，涂7H10平板（含链霉素20 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL）。平板置于37 ℃培养箱，培养两天。2.6.2 接种培养挑单克隆接种到2 ml 7H9培养基（含链霉素10 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL），37 ℃摇床培养两天。2.6.3 质粒鉴定和菌液转接取200 μl菌液，13000 rpm离心1 min，弃培养基。加入氯仿乙醇（2:1）200 μl重悬菌体，13000 rpm离心1 min，弃上清，置80 ℃烘箱晾干，加入30 μl洗脱缓冲液EB，置100 ℃金属加热器10 min后即可作为PCR模板进行鉴定。PCR体系为20 μl2× Taq mix 10 μlPrbpA-PF 0.4 μlPrbpA-BR 0.4 μl质粒 0.1 μlddH2O 9.1 μl 反应程序如下（1）94 ℃，1 min；（2）94 ℃，10 s；60 ℃→50 ℃（每循环降低0.5 ℃），15 s；72 ℃，30 s。共20个循环；（3）94 ℃，10 s；50 ℃，15 s；72 ℃，30 s。共10个循环；（4）72 ℃，1 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。质粒鉴定正确后进行菌液转接。首先每管菌液各取200 μl，测定OD600，选OD600值大于1的菌液进行1:100转接，即取20 μl菌液加入到2 mL7H9（含链霉素10 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL）培养基中，置37 ℃摇床过夜。每组设置两个重复。2.6.4 菌液OD600的测定及点斑试验取过夜菌液200 μl，测定OD600，选OD600值大于1的菌液进行1:100转接到含诱导剂ATc和不含诱导剂ATc的7H9液体培养基中，置37 ℃摇床过夜。每组设置两个重复。第二天测各管菌液OD600值。另取过夜菌液50 μl加入到500 μlPBS中，再依次倍比稀释，取浓度为10-2~10-5的菌液，依次点斑到含诱导剂ATc和不含诱导剂ATc的7H10（含链霉素20 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL）平板中，37 ℃培养箱培养两天，观察菌落生长情况。2.7 同源重组克隆技术构建pKT25b-rbpAm2.7.1 制备载体pKT25b利用Phanta超高保真酶扩增载体。PCR体系为50 μl2×Phanta Max Buffer 25 μlddH2O 21 μldNTP 1 μlpKT25-F 1 μlpKT25-R 1 μlPhanta Max 1 μlpKT25b 0.2 μl 反应程序如下（1）98 ℃，5 min；（2）98 ℃，10 s；58 ℃→48 ℃，15 s（每循环降低0.5 ℃）；72 ℃，2 min。共30个循环；（3）72 ℃，10 min。 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收，测浓度。2.7.2 扩增目的片段rbpAm根据ClonExpress II one step clone protocol引物设计原则，利用Primer5.0软件设计一对5’端含有线性载体末端同源序列的引物，并送至天一辉远公司合成。以E1-E8质粒为模板，扩增目的片段。PCR体系为50 μl2×Prime STAR Max Premix 25 μlddH2O 23 μlpKT25-RbpA-F 1 μlpKT25-RbpA-R 1 μl质粒 0.1 μl反应程序如下（1）98 ℃，5 min；（2）98 ℃，10 s；60 ℃→50 ℃，15 s（每循环降低0.5 ℃）；72 ℃，30 s。共30个循环；（3）72 ℃，10 min。 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收，测浓度。2.7.2 重组克隆构建质粒pKT25b-rbpAm重组反应体系为10 μl，如下 ddH2O up to 20 μl 5× CE II Buffer 2 μl载体pKT25b 50~200 ng片段rbpAm 20~200 ng 重组酶ExnaseII 1 μl在冰上配上述体系，混匀后置于37 ℃反应30 min。反应完成后立即置于冰上5 min。取反应液转化E.coli DH5α感受态，涂布Kan抗性平板。次日，利用2× Taq mix、引物pKT25-F、pKT25-R进行菌落PCR鉴定单克隆。将PCR阳性菌落接种kan抗性LB液体培养基培养过夜，提取质粒后保存备用。2.8 细菌双杂交试验2.8.1 配制反应溶液按下列配方配制溶液，灭菌后使用。Z BufferNa2HPO4·12H2O 100 mM NaH2PO4·2H2O 40 mM KCl 10 mM MgSO4 1 mM β-巯基乙醇 5.4 μl/mL 酶活底物Na2HPO4·12H2O 60 mM NaH2PO4·2H2O 40 mM ONPG 4 mg/mL β-巯基乙醇 2.7 μl/mL酶活终止液Na2CO3: 1 M2.8.2 转化双质粒取大肠杆菌BTH101感受态，冰上放置10min化冻。将质粒pBT18a-SigA和 pKT25a-rbpAm各1 μl均加入到一管感受态中，冰上放置30 min；42 ℃热激90 s，立即置于冰上3 min；加入1 mL无抗LB液体培养基，28 ℃摇床复苏45 min。5000 rpm离心3 min，弃去900 μl上清后混匀菌体沉淀，涂布LB卡那霉素（50 μg/mL）、氨苄青霉素（50 μg/mL）抗性平板。平板倒置于33 ℃培养箱中培养两天。第三天，挑单菌落接种5 mL含卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素50 μg/mL、IPTG1 μM的LB液体培养基，每次挑3个单菌落，每块平板接3管LB液体培养基，180 rpm、30 ℃摇床过夜。2.8.3 酶活性测定取200 μl菌液测定OD600值，取20 μl菌液加入到含有Z buffer450 μl、氯仿20 μl、0.1%SDS10 μl的EP管中，每管菌液设置3个重复。30 min后于每个EP管中加入100 μl酶活底物（含ONPG0.04 g/10 mL），记录加入时间并振荡均匀，待溶液由浅黄变黄时，加入250 μl终止液并记录终止时间。测定OD420及OD550。用下列公式计算酶活性酶活=1000*（OD420-1.75*OD550）/（OD600*加入反应的菌液体积*反应时间）菌液体积以mL为单位，反应时间以min为单位。3 结果与分析 3．1 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的构建 3．1．1 PCR扩增以构建的野生型质粒pMV261-P-Rv2050为模板，设计的含有预期突变位点的引物进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像如图5所示，扩增产物大于4500 bp，与预期相符，初步说明已扩增出目的质粒。图5 PCR扩增M250 bp DNA Ladder；E1-E8突变型pMV261-P-Rv2050质粒扩增结果3．1．2 克隆筛选取经DpnI消化后的PCR产物3 μl转化E.coli DH5α感受态，37 ℃过夜培养后平板上形成数百个单克隆。每块平板挑取5个单克隆，利用Taq酶和RbpA上下游引物PrbpA-PF、PrbpA-BR进行菌落PCR鉴定，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，若克隆正确应有约300 bp大小的条带出现。经鉴定，除E2的第1个单克隆外，其余均确认为阳性克隆，如图6所示。图6 菌落PCRM250 bp DNA Ladder；E1-E8转化突变型pMV261-P-Rv2050质粒的E.coliDH5α菌落PCR产物；C野生型pMV261-P-Rv2050质粒扩增结果3．1．3 序列测定与分析 将克隆筛选鉴定的阳性克隆接种至5 mL Kan抗性LB液体培养基，37 ℃摇床过夜培养。次日，收集4 mL菌液提取质粒送至生工公司测序，利用软件DNAstar 7.1将测序结果与结核分枝杆菌rbpA基因（Rv2050）序列进行比对，结果显示各位点已正确突变，说明已成功构建8株突变型pMV261-P-Rv2050质粒，如图7所示。 图7 序列比对图3．2 突变型pMV261-P-Rv2050质粒的回复将构建的点突变pMV261-RbpA质粒电转化实验室已制备好的rbpA沉默的耻垢分枝杆菌（MsRbpAm）感受态，涂布7H10抗性平板。经质粒鉴定正确后，将菌液按1:100转接，继续培养以得到生长状态较一致的菌液（OD600值达到1左右），将此时的菌液点斑7H10平板并接种7H9液体培养基，通过添加ATc诱导耻垢分枝杆菌rbpA基因沉默，观察固体平板中菌落生长状况并测定菌液OD，分别与不添加ATc的对照组进行比较，验证突变型质粒回复MsRbpAm后的生长情况。点斑平板如图8所示，在诱导剂ATc存在时，E5、E8的生长菌落与不添加ATc的对照组相比，各浓度组都明显变小，甚至无菌落出现；并与该结构域27到33位氨基酸缺失突变的回复效应较一致。菌液OD值见图9，在ATc存在时，E5、E8的菌液OD600值与不加ATc的对照组相比减小。由此可见，在诱导剂ATc存在时，固体培养与液体培养的E5和E8的生长情况与不添加ATc相比，均受到一定抑制。因此，可得到E5和E8即突变型质粒pMV261-RbpAY32A和pMV261-RbpAQ28A,Y32A不能回复MsRbpAm。质粒pMV261-RbpAY32A突变位点为32位酪氨酸，质粒pMV261-RbpAQ28A,Y32A突变位点为28位谷氨酸和32位酪氨酸，而28位谷氨酸突变的质粒E2能够回复MsRbpAm，这说明RbpA蛋白第28位谷氨酸的突变对耻垢分枝杆菌的正常生长没有影响，而有着重要影响的是E5和E8共同的突变位点32位酪氨酸，因此RbpA蛋白第32位酪氨酸可能对RbpA的功能有着重要影响。图8 点斑试验m-v:阳性对照；m-c:阴性对照；E1-E转化突变型pMV261-P-Rv2050质粒的MsRbpAm生长菌落 图9 菌液OD600的测定M-v:阳性对照;m-c:阴性对照;E1-H1:转化突变型pMV261-P-Rv2050质粒的MsRbpAm菌液OD值E:转化结构域27-33位氨基酸缺失的pMV261-P-Rv2050质粒的MsRbpAm菌液OD值3.3 细菌双杂交试验3.3.1 扩增载体pKT25b以利用pKT25b为模板，Phanta超高保真酶进行PCR扩增制备线性载体。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱如图10所示，扩增出约4500 bp的条带，大小与预期相符且特异性强。利用Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，超微量分光光度计测定浓度为80.1 ng/mL，-20 ℃冻存备用。 图10 PCR扩增载体pKT25bM:200bp DNA Maker;1-2:PCR扩增产物3.3.2 扩增目的片段以构建的突变型质粒pMV261-P-Rv2050为模板，利用设计的5’端包含线性载体两末端序列的上下游引物pKT25-RbpA-F、pKT25-RbpA-R，扩增出包含突变位点的rbpA目的片段（rbpAm）。电泳图谱如图11所示，E2的条带不单一，其余泳道特异性均较高，分别切下大小在300 bp附近的条带，利用Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒回收。超微量分光光度计测定浓度。图11 扩增目的片段rbpAmM:200bp DNA Maker; E1-E8:目的片度rbpAm3.3.3 重组反应根据ClonExpress II One Step Cloning Kit protocol提供的最适载体使用量和最适插入片段使用量的计算公式最适克隆载体使用量 = [0.01×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)最适插入片段使用量 = [0.02×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)以及制备的线性载体pKT25b和目的片段rbpAm的浓度确定各反应成分的体积，配制10 μl反应体系，如下ddH2O 5.7 μl5×CE II Buffer 2 μl线性化克隆载体 0.3 μl插入片段扩增产物 1 μlExnase II重组酶 1 μl 重组反应结束后将10 μl产物全部转化E.coli DH5α，涂布Amp（100 μg/mL）抗性平板。次日，每块平板上均形成数十个至数百个单克隆，每块平板挑5个单克隆利用载体引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱如图12所示，将条带在500 bp附近的克隆确认为阳性克隆，并每组挑两个阳性克隆接种Amp100 LB液体培养基，37 ℃摇床过夜培养后提取质粒，利用细菌双杂交试验检测该质粒与实验室制备好的pBT18-SigA的相互作用。 图12 菌落PCR琼脂糖电泳M250 bp DNA Ladder;C:质粒pKT25b-rbpAWT扩增结果E1-E8转化pKT25b-rbpAm+pBT18a-sigA重组反应产物E.coliDH5α生长菌落PCR鉴定3.3.4 细菌双杂交试验将重组克隆构建的各质粒分别与pBT18a-SigA共转化BTH101感受态，涂布Kan和Amp抗性LB平板（抗生素浓度均为50 μg/mL），30 ℃培养两天后挑单克隆接种Kan和Amp抗性LB液体培养基，30 ℃摇床摇菌约20 h时，测定各组菌液酶活性，通过酶活（U）大小判断各突变的蛋白与σA蛋白的相互作用强度，结果转化突变型质粒E5和E8的BTH101的培养菌液表现出与野生型RbpA相似的β-半乳糖苷酶活性，如图13所示。这说明突变后的蛋白不会影响其与σA的相互作用。 图13 酶活性测定C1:pKT25b+pBT18a;C2:pKT25b-zip+pBT18a-zip;WT:pKT25b-rbpAWT+pBT18a-sigA;E1-E8:pKT25b-rbpAm+pBT18a-sigA;E:C2:pKT25b-rbpA27-33+pBT18a-sigA4 讨论结核病是目前全球范围内对人类威胁最大的致死性传染病之一，近年来由于多种药物的长期使用导致了耐多药结核菌株和广泛耐药菌株出现，因此，急需寻找新型抗结核药物作用靶点。RNA聚合酶结合蛋白RbpA已被证实是结核分枝杆菌生长必需蛋白，它可能作为重要的抗分枝杆菌靶点。本论文基于实验室前期研究工作，利用quickchange基因定点突变技术对结构域第27到33位氨基酸逐一进行丙氨酸替换突变，筛选该结构域发挥作用的位点。结果显示，第32位酪氨酸突变能够明显抑制耻垢分枝杆菌的生长，而细菌双杂交试验结果表明该位点的突变并不影响RbpA蛋白的表达。因此，该32位酪氨酸是影响RbpA蛋白功能的重要位点，但该位点发挥关键作用的机制不同于之前研究报道的与RNA聚合酶β亚基和σ因子相互作用，推测RbpA还存在其他作用机制来影响其作为生长必需蛋白的功能。虽然细菌双杂交表明Y32A突变后表现出野生型RbpA一样的与σA相互作用强度，表明Y32A不会影响其在大肠杆菌中的表达，但该位点突变是否会影响其在分枝杆菌中的表达还不清楚，因此本实验还不能完全排除突变后的蛋白是通过RbpA蛋白的表达来影响分枝杆菌的生长。这些问题还需要实验室进一步研究探讨。在本研究中，利用rbpA沉默的耻垢分枝杆菌回复突变型质粒，主要从以下两个方面考虑一方面，结核分枝杆菌生长速度缓慢并具有致病性，试验周期长且对生物安全性要求较高，而耻垢分枝杆菌是快速生长的非致病性分枝杆菌；另一方面，耻垢分支杆菌与结核分枝杆菌同属分枝杆菌属，遗传背景与结核分枝杆菌相似，在其中表达的蛋白质更接近于天然构象，更利于蛋白质功能的研究，而且耻垢分枝杆菌RbpA与结合分枝杆菌RbpA的同源性很高，保证了回复试验结果的可靠性。该rbpA沉默的耻垢分枝杆菌的构建依据Francesca Boldrin等构建的TetR/Pip off 系统，通过改造目的基因rbpA的启动子，使其表达受Pip I（Pristinomycin I,普那霉素I）受体依赖的Pptr启动子的调控。当诱导剂ATc存在时，ATc结合TetR（Tetracycline receptor，四环素受体），从而Pip表达，抑制Pptr启动子，目的基因rbpA沉默，当诱导剂ATc不存在时，TetR抑制Pip表达，从而目的基因rbpA表达[14]。总结本实验，还应该注意以下几点（1）在quickchange定点突变PCR中，由于结核分枝杆菌的G+C含量较高，故在扩增体系中加入5%的DMSO以提高扩增效率，由于QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit使用的是低次数的循环延伸而并非PCR，所以本研究采用20个循环而非常规的30个循环，以减少引入突变。使用touch down PCR也是提高阳性率的措施。（2）在突变型pMV261-P-Rv2050质粒回复MsRbpAm时，菌液OD值的测定是在接菌培养约28h进行的，时间较长，导致结果不是很理想，因为这些突变型质粒只是抑制耻垢分枝杆菌的生长，长时间培养后这种抑制效应会减弱。实际操作应缩短摇菌时间，在以后实验过程中还应预先了解菌株的生长特性，注意时间的安排。实际操作过程中还发现耻垢分枝杆菌很容易沉淀，因此在取菌液时特别要注意混匀，并观察底部有无白色菌体沉淀，防止所取菌液浓度偏低，造成实验误差。（3）利用同源重组克隆技术制备重组质粒pKT25b-rbpAm时，要注意重组反应体系要在冰上配制，重组酶最后加入，并且应现取现用，不能置室温或冰上时间太长。另外，反应体系线性载体和插入片段的量和浓度需按照protocol的说明正确计算，以免降低重组反应效率。（4）在细菌双杂交试验中，每块平板需挑3个单克隆进行液体培养基接种，并进行3个重复，测定酶活时每个克隆还需3个平行重复，以减少误差，保证实验结果的可靠性。测定酶活时要注意反应时间的控制，计时要精确，操作时防止菌体沉淀，加反应液时注意氯仿需加入到液体底部以防挥发。（5）实验时，平板有其他菌污染的现象出现，因此在细菌接种、涂布平板等操作时要严格进行无菌操作。致谢参考文献[1]WHO. (2014)Global Tuberculosis Report. WHO.[2]Zhang Y, Yew W. 结核分枝杆菌耐药机制[J]. 国际结核病与肺部疾病杂志中文版, 2009, 13(11): 1320–1330.[3]朱玉贤, 李毅, 郑晓峰. 现代分子生物学[M]. 第三版. 北京: 高等教育出版社, 2007: 69-70.[4]Paget MS, Molle V, Aharonowitz Y, et al. Defining the disulphide stress response in Streptomyces coelicolor A3(2): identification of the σR regulon[J]. Molecular Microbiology, 2001, 42(4): 1007–1020. [5]Newell KV, Thomas DP, Brekasis D, et al. The RNA polymerase-binding protein RbpA confers basal levels of rifampicin resistance on Streptomyces coelicolor[J]. Molecular Microbiology, 2006, 60(3): 687–696.[6]Dey A, Verma AK, Chatterji D. Role of an RNA polymerase interacting protein, MsRbpA, from Mycobacterium smegmatis in phenotypic tolerance to rifampicin[J]. Microbiology, 2010, 156: 873–883.[7]Dey A, Verma AK, Chatterji D. Molecular insights into the mechanism of phenotypic tolerance to rifampicin conferred on mycobacterial RNA polymerase by MsRbpA[J]. Microbiology, 2011, 157: 2056–2071.[8]Hu Y, Morichaud Z, Chen S, et al. Mycobacterium tuberculosis RbpA protein is a new type of transcriptional activator that stabilizes the σA-containing RNA polymerase holoenzyme[J]. Nucleic Acids Research, 2012: 1-11.[9]Hu Y, Morichaud Z, Perumal AS, et al. Mycobacterium RbpA cooperates with the stress-response σB subunit of RNA polymerase in promoter DNA unwinding[J]. Nucleic Acids Research, 2014: 10399-10408.[10]Tabib-Salazar A, Liu B, Doughty P, et al. The actinobacterial transcription factor RbpA binds to the principal sigma subunit of RNA polymerase[J]. Nucleic Acids Research, 2013: 41(11): 5679-5691.[11]Bortoluzzi A, Muskett FW, Waters LC, et al. Mycobacterium tuberculosis RNA Polymerase-binding Protein A (RbpA) and Its Interactions with Sigma Factors[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2013, 288: 14438-14450.[12]Verma AK, Chatterji D. Dual role of MsRbpA: transcription activation and rescue of transcription from the inhibitory effect of rifampicin[J]. Microbiology, 2014, 160: 2018-2029.[13]李建华.细菌双杂交系统及其在病原微生物学中的应用[J]. 微生物学免疫学进展,2006,34(3)34-40.[14]Boldrin F, Casonato S, Dainese E, et al. Development of a repressible mycobacterial promoter system based on two transcriptional repressors[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(12): 1-11.
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言1
1.1 结核分枝杆菌与肺结核1
1.2 结核分枝杆菌耐药性2
1.3 RbpA的发现与研究概况2
1.4 本研究使用的技术 2
1.4.1 quickchange基因定点突变技术2
1.4.2 同源重组克隆技术3
1.4.3 细菌双杂交系统4
1.5 本研究的目的与意义5
2 材料与方法5
2.1 菌株和质粒 5
2.2 主要试剂6
2.3 培养基6
2.4 主要仪器设备6
2.5 突变型pMV261PRv2050质粒的构建6
2.6 突变型pMV261PRv2050质粒的回复7
2.7 重组克隆技术构建pKT25brbpAm8
2.8 细菌双杂交试验9
3 结果与分析10
3.1 突变型pMV261PRv2050质粒的构建10
3.2 突变型pMV261PRv2050质粒的回复11
3.3 细菌双杂交试验12
4 讨论14
致谢16
参考文献16
结核分枝杆菌RbpA蛋白功能域研究
引言
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