马链球菌兽疫亚种SrtC基因原核表达及缺失株构建
马链球菌兽疫亚种SrtC基因原核表达及缺失株构建[20200507182817]
摘要：马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）是一种重要的人畜共患病病原，能引起多种动物发病。分选酶C（Sortase C, SrtC）与革兰氏阳性菌的菌毛蛋白聚合体锚定在细胞壁的过程有关。本实验将SrtC基因与pET28a载体连接，构成pET28a-SrtC重组质粒，转化进入大肠杆菌BL21中，诱导表达后得到了36 kDa左右的重组融合蛋白。此外，利用同源重组技术构建重组自杀质粒pSET4S-△SrtC，电转化进入SEZ ATCC35246菌株，通过同源重组方法构建了SEZ SrtC基因敲除突变株，并测定了SEZ野生株和SrtC缺失株的生长曲线，为下一步研究SEZ菌毛及分选酶的功能奠定了基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:马链球菌兽疫亚种；分选酶C；原核表达；缺失株
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1材料4
1.1菌株和质粒 5
1.2主要试剂 5
2方法5
2.1原核表达载体构建5
2.1.1 SrtC基因的扩增5
2.1.2 pET28a-SrtC重组质粒构建5
2.2 重组SrtC诱导表达 6
2.2.1 转化到BL216
2.2.2 诱导表达6
2.3 重组SrtC纯化6
2.4△SrtC片段上下游臂的融合6
2.4.1上下游臂扩增6
2.4.2△SrtC片段的融合回收7
2.5 pMD19-T-△SrtC载体的构建7
2.6 pSET4S-△SrtC载体的构建7
2.7电转化到SEZ ATCC35246感受态细胞7
2.8缺失株筛选及鉴定7
2.8.1传代并筛选缺失株8
2.8.2粗提基因组PCR检测8
2.8.3抗性培养8
2.9生长曲线的测定8
3结果8
3.1原核表达载体构建8
3.1.1 SrtC基因的扩增8
3.1.2 pET28a-SrtC重组质粒构建8
3.2诱导表达9
3.3包涵体蛋白纯化9
3.4 △SrtC上下游融合片段的获取10
3.5 pMD19-T-△SrtC载体的构建10
3.6 pSET4S-△SrtC载体的构建11
3.7缺失株筛选及鉴定11 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
r /> 3.8生长曲线12
4讨论12
致谢13
参考文献13图1 SrtC基因片段PCR扩增8
图2 pET28a-SrtC重组质粒PCR检测9
图3 pET28a-SrtC重组质粒双酶切鉴定9
图4 BL21-28a-SrtC重组质粒PCR鉴定9
图5 SDS-PAGE检测10
图6 pMD19-T-△SrtC重组质粒PCR检测10
图7 pMD19-T-△SrtC重组质粒双酶切鉴定11
图8 pSET4S-△SrtC重组质粒PCR鉴定11
图9 pSET4S-△SrtC重组质粒双酶切鉴定11
图10缺失株粗提基因组PCR鉴定12
图11野生株与SrtC缺失株的生长曲线12
马链球菌兽疫亚种SrtC基因原核表达及缺失株构建
引言
马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ)是一种革兰氏阳性菌，能引起多种动物患病，引发败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、乳腺炎等[l,2]。人类通过食物、外伤途径或与发病动物密切接触，亦可引发感染[3-5]，因此SEZ是一种重要的人畜共患病病原[6]。SEZ在我国主要在猪群中流行[7]，1975年四川省曾爆发该菌所致的猪链球菌病，导致大量猪死亡，造成巨大的经济损失。
分选酶（Sortase），是一种抗革兰氏阳性致病菌的新型靶酶。大量的研究报道发现，革兰氏阳性细菌菌毛生物合成过程有共同的机制。菌毛基因群都是由分选酶基因和菌毛蛋白基因组成，由分选酶通过转肽反应将各单体菌毛蛋白连接成聚合体并锚定在细胞壁肽聚糖上，最终形成长丝状菌毛结构[8]。菌毛参与细菌对宿主组织和细胞的黏附，侵袭和定植等重要生理活动[9]，是一种重要的致病因子。由于许多革兰氏阳性菌的表面蛋白是经过分选酶的作用而锚定到细胞壁上，表面蛋白在病原菌的致病性方面又能起关键作用，如果阻断这个由分选酶介导的锚定过程，革兰氏阳性菌就可能无法表现出强烈的致病性并很容易被机体免疫系统识别，分选酶有可能成为降低革兰氏阳性菌致病性的药物靶点，其缺失株有望制成弱毒苗。
本实验将SrtC基因转入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达获得重组SrtC蛋白，并利用同源重组技术构建了SEZ ATCC35246菌株SrtC缺失突变株，测定了SEZ野生株和SrtC缺失株的生长曲线，为下一步研究SEZ菌毛及分选酶的功能奠定了基础。
1材料
1.1菌株和质粒
马链球菌兽疫亚种（SEZ）ATCC35246由本实验室保存，SEZ菌株均用THB培养，大肠杆菌用LB培养，必要时培养基中添加一定浓度的抗生素，抗生素终浓度分别为：壮观霉素（Spc）50 mg/mL，氨苄西林(Amp) 50 mg/mL，卡那霉素(Kan) 50 mg/mL。缺失用自杀质粒pSET4s由日本学者Takamatsu馈赠。
1.2 主要试剂
Primer Start Mix、T4 DNA连接酶、限制性内切酶以及DNA Marker购自大连TaKaRa公司。2×Taq酶、2×Pfu酶购自南京博尔迪生物科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒和质粒DN *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
A小量提取试剂盒购自OMEGA公司。LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。每1 L的LB液体培养基含有10 g胰化蛋白胨、5 g酵母浸出物和10 g NaCl。抗性培养基抗生素终浓度为50 ng/L。固体培养平板为LB或THB液体培养基加入1.5 %琼脂，灭菌后分装到平板。
引物合成由鼎国昌盛生物技术有限公司完成。
2方法
2.1原核表达载体构建
2.1.1 SrtC基因的扩增
SrtC基因的扩增温度检测 体系：以2×Pfu Mix 10 μL，上游引物Pro-up 1 μL，下游引物Pro-down 1 μL，SEZ ATCC35246基因组1 μL，ddH2O 7 μL。条件：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 s，51 °C到55 °C各一个样50 s，72 °C 延伸50 s，从第二步开始共循环35次，72 °C延伸10 min，16 °C保存。反应结束后，经过1 %的琼脂糖凝胶电泳，观察条带位置和亮度确SrtC基因扩增的最适温度。
SrtC基因的扩增 体系：Primer Start Mix 150 μL，上游引物Pro-up 10 μL，上游臂下游引物Pro-down 10 μL，SEZ ATCC35246基因组3 μL，ddH2O 127 μL。条件：95 °C预变性 5 min，95 °C变性30 s，52.9 °C退火50 s，72 °C 延伸50 s，从第二步开始共循环35次，72 °C延伸10 min，16 °C保存。反应结束后，加Loading Buffer，混匀，经过1 %的琼脂糖凝胶电泳，割胶回收。按照试剂盒说明书回收凝胶中的目的片段。
②加入诱导剂IPTG 1 mL，37 °C摇床180转培养4 h；
③将诱导后的菌液于4 °C 10000 rpm离心20 min，弃去上清；
④用1×PBS重悬沉淀，按上述条件离心，弃去上清，重复两遍；
⑤用上清Bingding Buffer 50 mL重悬沉淀；
摘要：马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）是一种重要的人畜共患病病原，能引起多种动物发病。分选酶C（Sortase C, SrtC）与革兰氏阳性菌的菌毛蛋白聚合体锚定在细胞壁的过程有关。本实验将SrtC基因与pET28a载体连接，构成pET28a-SrtC重组质粒，转化进入大肠杆菌BL21中，诱导表达后得到了36 kDa左右的重组融合蛋白。此外，利用同源重组技术构建重组自杀质粒pSET4S-△SrtC，电转化进入SEZ ATCC35246菌株，通过同源重组方法构建了SEZ SrtC基因敲除突变株，并测定了SEZ野生株和SrtC缺失株的生长曲线，为下一步研究SEZ菌毛及分选酶的功能奠定了基础。
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关键字:马链球菌兽疫亚种；分选酶C；原核表达；缺失株
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关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1材料4
1.1菌株和质粒 5
1.2主要试剂 5
2方法5
2.1原核表达载体构建5
2.1.1 SrtC基因的扩增5
2.1.2 pET28a-SrtC重组质粒构建5
2.2 重组SrtC诱导表达 6
2.2.1 转化到BL216
2.2.2 诱导表达6
2.3 重组SrtC纯化6
2.4△SrtC片段上下游臂的融合6
2.4.1上下游臂扩增6
2.4.2△SrtC片段的融合回收7
2.5 pMD19-T-△SrtC载体的构建7
2.6 pSET4S-△SrtC载体的构建7
2.7电转化到SEZ ATCC35246感受态细胞7
2.8缺失株筛选及鉴定7
2.8.1传代并筛选缺失株8
2.8.2粗提基因组PCR检测8
2.8.3抗性培养8
2.9生长曲线的测定8
3结果8
3.1原核表达载体构建8
3.1.1 SrtC基因的扩增8
3.1.2 pET28a-SrtC重组质粒构建8
3.2诱导表达9
3.3包涵体蛋白纯化9
3.4 △SrtC上下游融合片段的获取10
3.5 pMD19-T-△SrtC载体的构建10
3.6 pSET4S-△SrtC载体的构建11
3.7缺失株筛选及鉴定11
r /> 3.8生长曲线12
4讨论12
致谢13
参考文献13图1 SrtC基因片段PCR扩增8
图2 pET28a-SrtC重组质粒PCR检测9
图3 pET28a-SrtC重组质粒双酶切鉴定9
图4 BL21-28a-SrtC重组质粒PCR鉴定9
图5 SDS-PAGE检测10
图6 pMD19-T-△SrtC重组质粒PCR检测10
图7 pMD19-T-△SrtC重组质粒双酶切鉴定11
图8 pSET4S-△SrtC重组质粒PCR鉴定11
图9 pSET4S-△SrtC重组质粒双酶切鉴定11
图10缺失株粗提基因组PCR鉴定12
图11野生株与SrtC缺失株的生长曲线12
马链球菌兽疫亚种SrtC基因原核表达及缺失株构建
引言
马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ)是一种革兰氏阳性菌，能引起多种动物患病，引发败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、乳腺炎等[l,2]。人类通过食物、外伤途径或与发病动物密切接触，亦可引发感染[3-5]，因此SEZ是一种重要的人畜共患病病原[6]。SEZ在我国主要在猪群中流行[7]，1975年四川省曾爆发该菌所致的猪链球菌病，导致大量猪死亡，造成巨大的经济损失。
分选酶（Sortase），是一种抗革兰氏阳性致病菌的新型靶酶。大量的研究报道发现，革兰氏阳性细菌菌毛生物合成过程有共同的机制。菌毛基因群都是由分选酶基因和菌毛蛋白基因组成，由分选酶通过转肽反应将各单体菌毛蛋白连接成聚合体并锚定在细胞壁肽聚糖上，最终形成长丝状菌毛结构[8]。菌毛参与细菌对宿主组织和细胞的黏附，侵袭和定植等重要生理活动[9]，是一种重要的致病因子。由于许多革兰氏阳性菌的表面蛋白是经过分选酶的作用而锚定到细胞壁上，表面蛋白在病原菌的致病性方面又能起关键作用，如果阻断这个由分选酶介导的锚定过程，革兰氏阳性菌就可能无法表现出强烈的致病性并很容易被机体免疫系统识别，分选酶有可能成为降低革兰氏阳性菌致病性的药物靶点，其缺失株有望制成弱毒苗。
本实验将SrtC基因转入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达获得重组SrtC蛋白，并利用同源重组技术构建了SEZ ATCC35246菌株SrtC缺失突变株，测定了SEZ野生株和SrtC缺失株的生长曲线，为下一步研究SEZ菌毛及分选酶的功能奠定了基础。
1材料
1.1菌株和质粒
马链球菌兽疫亚种（SEZ）ATCC35246由本实验室保存，SEZ菌株均用THB培养，大肠杆菌用LB培养，必要时培养基中添加一定浓度的抗生素，抗生素终浓度分别为：壮观霉素（Spc）50 mg/mL，氨苄西林(Amp) 50 mg/mL，卡那霉素(Kan) 50 mg/mL。缺失用自杀质粒pSET4s由日本学者Takamatsu馈赠。
1.2 主要试剂
Primer Start Mix、T4 DNA连接酶、限制性内切酶以及DNA Marker购自大连TaKaRa公司。2×Taq酶、2×Pfu酶购自南京博尔迪生物科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒和质粒DN *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
A小量提取试剂盒购自OMEGA公司。LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。每1 L的LB液体培养基含有10 g胰化蛋白胨、5 g酵母浸出物和10 g NaCl。抗性培养基抗生素终浓度为50 ng/L。固体培养平板为LB或THB液体培养基加入1.5 %琼脂，灭菌后分装到平板。
引物合成由鼎国昌盛生物技术有限公司完成。
2方法
2.1原核表达载体构建
2.1.1 SrtC基因的扩增
SrtC基因的扩增温度检测 体系：以2×Pfu Mix 10 μL，上游引物Pro-up 1 μL，下游引物Pro-down 1 μL，SEZ ATCC35246基因组1 μL，ddH2O 7 μL。条件：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 s，51 °C到55 °C各一个样50 s，72 °C 延伸50 s，从第二步开始共循环35次，72 °C延伸10 min，16 °C保存。反应结束后，经过1 %的琼脂糖凝胶电泳，观察条带位置和亮度确SrtC基因扩增的最适温度。
SrtC基因的扩增 体系：Primer Start Mix 150 μL，上游引物Pro-up 10 μL，上游臂下游引物Pro-down 10 μL，SEZ ATCC35246基因组3 μL，ddH2O 127 μL。条件：95 °C预变性 5 min，95 °C变性30 s，52.9 °C退火50 s，72 °C 延伸50 s，从第二步开始共循环35次，72 °C延伸10 min，16 °C保存。反应结束后，加Loading Buffer，混匀，经过1 %的琼脂糖凝胶电泳，割胶回收。按照试剂盒说明书回收凝胶中的目的片段。
②加入诱导剂IPTG 1 mL，37 °C摇床180转培养4 h；
③将诱导后的菌液于4 °C 10000 rpm离心20 min，弃去上清；
④用1×PBS重悬沉淀，按上述条件离心，弃去上清，重复两遍；
⑤用上清Bingding Buffer 50 mL重悬沉淀；
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