hl60细胞体外培养及接种nsg小鼠肿瘤模型的建立
[目的]建立便于进行早期观察及测量的小鼠白血病移植瘤动物模型。[方法]通过对HL-60细胞进行体外培养,将处于对数生长期的不同数量的HL-60细胞株接种于小鼠腹部皮下,建立小鼠白血病肿瘤模型。观察小鼠肿瘤的生长特点,测量其体重及肿瘤的长短径,计算肿瘤生长体积。应用组织学和病理学方法进行鉴定,总结归纳细胞接种数量与肿瘤生长的关系及肿瘤对小鼠生活状态的影响。[结果]低浓度组（1x106）小鼠在接种第15天陆续有肿瘤长出；中浓度组（5x106）和高浓度组（1x107）NSG小鼠全部建模成功。[结论]HL-60 细胞接种于NSG小鼠的肿瘤模型成功率与接种细胞数成正比, 它具有建立肿瘤模型成功率高, 观察及测量方便等优点, 接种部位以近腹部皮下为宜。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 材料2
1．1 试验材料2
1.1.1 试验动物2
1.1.2 细胞培养材料2
1.1.3主要仪器及试剂 2
1.2方法 2
1.2.1试剂配制 2
1.2.2细胞培养 2
1.2.3动物试验 3
1.2.4 NSG鼠移植瘤模型的建立3
1.2.5动物模型的鉴定 3
1.2.6统计方法4
2 结果与分析4
2.1 NSG鼠生存情况 4
2.2移植瘤小鼠体重生长曲线4
2.3动物模型的建立及移植瘤的生长情况4
2．4移植瘤组织学观察5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
HL60细胞体外培养及接种NSG小鼠肿瘤模型的建立
引言
肿瘤是以机体中的一些细胞基因发生突变为特征的一种全身性疾病,它的危害不仅在于身体的各组织脏器受到损伤,更有各种并发症如转移、疼痛、积水等,最终导致身体各器官的极度衰竭并危害人类健康。而肿瘤细胞HL60细胞是人类急性骨髓性白血病细胞,这个细胞株是美国国家癌症研究所（National Cancer *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
Institute）从一个36岁患有急性早幼粒细胞白血病的女性血液中分离得到的[1],HL60细胞的大量增殖会引起人类急性髓性白血病的发生。急性髓性白血病多见发生在成年人,以髓细胞定向造血干细胞早起生成阶段分化受阻为主要特征,丧失了凋亡和向终末分化的能力,在骨髓组织中提前成熟并释放到外周组织,幼稚细胞增殖增加,并向骨髓组织渗透侵袭,而导致了白血病的发生[2]。而白血病作为临床上一种常见的恶性造血系统疾病,死亡率极高,可达70%,每年新增病例大约有30万,而且发病人数逐年递增。在我国,因白血病而死亡的人数在所有疾病中占有较大比例,死亡率在男性和女性中分别位于第6位和第8位,而在儿童中其死亡率居于首位[3]。2008年在世界范围内,约25.8 万人因为白血病致死,对人们的健康造成了严重的危害[4]。随着对肿瘤细胞生长规律的认识逐渐深入以及肿瘤患者对治疗的迫切要求, 肿瘤的实验治疗日益蓬勃发展, 动物肿瘤模型是肿瘤实验研究的重要手段之一。
据报道,国内外学者先后建立了鼠源性肿瘤细胞的荷瘤鼠模型[5],但毕竟鼠与人类之间有种族差异,免疫缺陷小鼠为建立人源性肿瘤细胞模型提供了可能。NSG或?NOD scid gamma?(NOD.CgPrkdcscid?Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠是一种具有免疫缺陷的近交系实验室小鼠[6],缺乏成熟的T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞[7]及其他一些细胞因子信号通路。NSG重度联合免疫缺陷小鼠适合广泛的人体细胞移植,大量应用于复杂的人类生物学研究并在其他一些人性化模型及传染性疾病方面建模成功。SimpsonAbelson MR[8]等2008年在NSG小鼠肺部移植肿瘤成功,Ishikawa F,Giassi LJ[9][10]等用NSG小鼠成功建立了人类造血干细胞免疫系统动物模型。同时,NSG小鼠人性化模型还用于研究人类特有的传染性疾病比如HIV（艾滋病病毒）[11]、爱博斯坦巴尔病毒[12]、疟疾[13]和登革热[14][15],人性化模型在测试新药的治疗方面也有帮助[11]。本实验通过给NSG小鼠皮下接种不同浓度的HL60细胞,建立了便于早期观察的白血病肿瘤动物模型,为进行体内肿瘤耐药机制的研究和逆转药物的筛选提供了实验模型和实验基础[16]。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物
取SPF级近交系NSG小鼠,由实习单位（南京大学南京生物医药研究院）提供,雌性,4周龄,体重17~19g,于实验动物房适应一周后开始移植。
1．1．2 细胞培养材料
人急性早幼粒白血病细胞株（HL60）购自美国标准细胞库ATCC（American Tissue Culture Collection）。
RPMI1640培养基(购自ATCC)。
5%CO2细胞培养箱（购自赛默飞世尔科技公司Thermo Fisher Scientific）。
1．1．3 主要仪器及试剂
1．1．3．1 主要仪器
组织脱水机（莱卡）、石蜡包埋机（型号：EG1150H,莱卡）、电子数显卡尺（德国伍尔特）、电子天平、倒置显微镜、细胞计数板和电子细胞计数仪、1640体视显微镜、液氮生物容器、微量移液器、离心机及离心管、1ml注射器等。
1．1．3．2 主要试剂
20%胎牛血清(美国Invitrogen Gibco)、100U/ml青霉素钠、100U/ml 链霉素(美国Invitrogen Gibco)、PBS缓冲液、10%中性甲醛、苏木精伊红染液。
1．2 试验方法
1．2．1 试剂配制
10%中性甲醛：准确量取甲醛溶液100ml,称取磷酸二氢钠6.5g,再加蒸馏水900ml,配置成10%中性甲醛,待用；
PBS 缓冲液：分别称取 0.2g 氯化钾,1.44g 磷酸氢二钠,8.0g 氯化钠,0.24g磷酸二氢钾,加适量双蒸水配至总体积为 1.0L。调节PH值到 7.4,用盐水瓶分装后高压消毒。降至室温后保存于 4°C冰箱。
1．2．2 细胞培养
1．2．2．1 原代培养
HL60细胞株购自ATCC,原代细胞由ATCC培养。
1．2．2．2 传代培养
HL60细胞培养条件采用含20%胎牛血清、双抗（100U/ml青霉素钠、100U/ml 链霉素）的RPMI1640完全培养液中,置37℃、5% CO2细胞培养箱中悬浮培养。每2~3天换液传代一次。取对数生长期细胞进行实验,细胞成悬浮状态,生长良好,成活率>95%。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 材料2
1．1 试验材料2
1.1.1 试验动物2
1.1.2 细胞培养材料2
1.1.3主要仪器及试剂 2
1.2方法 2
1.2.1试剂配制 2
1.2.2细胞培养 2
1.2.3动物试验 3
1.2.4 NSG鼠移植瘤模型的建立3
1.2.5动物模型的鉴定 3
1.2.6统计方法4
2 结果与分析4
2.1 NSG鼠生存情况 4
2.2移植瘤小鼠体重生长曲线4
2.3动物模型的建立及移植瘤的生长情况4
2．4移植瘤组织学观察5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
HL60细胞体外培养及接种NSG小鼠肿瘤模型的建立
引言
肿瘤是以机体中的一些细胞基因发生突变为特征的一种全身性疾病,它的危害不仅在于身体的各组织脏器受到损伤,更有各种并发症如转移、疼痛、积水等,最终导致身体各器官的极度衰竭并危害人类健康。而肿瘤细胞HL60细胞是人类急性骨髓性白血病细胞,这个细胞株是美国国家癌症研究所（National Cancer *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
Institute）从一个36岁患有急性早幼粒细胞白血病的女性血液中分离得到的[1],HL60细胞的大量增殖会引起人类急性髓性白血病的发生。急性髓性白血病多见发生在成年人,以髓细胞定向造血干细胞早起生成阶段分化受阻为主要特征,丧失了凋亡和向终末分化的能力,在骨髓组织中提前成熟并释放到外周组织,幼稚细胞增殖增加,并向骨髓组织渗透侵袭,而导致了白血病的发生[2]。而白血病作为临床上一种常见的恶性造血系统疾病,死亡率极高,可达70%,每年新增病例大约有30万,而且发病人数逐年递增。在我国,因白血病而死亡的人数在所有疾病中占有较大比例,死亡率在男性和女性中分别位于第6位和第8位,而在儿童中其死亡率居于首位[3]。2008年在世界范围内,约25.8 万人因为白血病致死,对人们的健康造成了严重的危害[4]。随着对肿瘤细胞生长规律的认识逐渐深入以及肿瘤患者对治疗的迫切要求, 肿瘤的实验治疗日益蓬勃发展, 动物肿瘤模型是肿瘤实验研究的重要手段之一。
据报道,国内外学者先后建立了鼠源性肿瘤细胞的荷瘤鼠模型[5],但毕竟鼠与人类之间有种族差异,免疫缺陷小鼠为建立人源性肿瘤细胞模型提供了可能。NSG或?NOD scid gamma?(NOD.CgPrkdcscid?Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠是一种具有免疫缺陷的近交系实验室小鼠[6],缺乏成熟的T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞[7]及其他一些细胞因子信号通路。NSG重度联合免疫缺陷小鼠适合广泛的人体细胞移植,大量应用于复杂的人类生物学研究并在其他一些人性化模型及传染性疾病方面建模成功。SimpsonAbelson MR[8]等2008年在NSG小鼠肺部移植肿瘤成功,Ishikawa F,Giassi LJ[9][10]等用NSG小鼠成功建立了人类造血干细胞免疫系统动物模型。同时,NSG小鼠人性化模型还用于研究人类特有的传染性疾病比如HIV（艾滋病病毒）[11]、爱博斯坦巴尔病毒[12]、疟疾[13]和登革热[14][15],人性化模型在测试新药的治疗方面也有帮助[11]。本实验通过给NSG小鼠皮下接种不同浓度的HL60细胞,建立了便于早期观察的白血病肿瘤动物模型,为进行体内肿瘤耐药机制的研究和逆转药物的筛选提供了实验模型和实验基础[16]。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物
取SPF级近交系NSG小鼠,由实习单位（南京大学南京生物医药研究院）提供,雌性,4周龄,体重17~19g,于实验动物房适应一周后开始移植。
1．1．2 细胞培养材料
人急性早幼粒白血病细胞株（HL60）购自美国标准细胞库ATCC（American Tissue Culture Collection）。
RPMI1640培养基(购自ATCC)。
5%CO2细胞培养箱（购自赛默飞世尔科技公司Thermo Fisher Scientific）。
1．1．3 主要仪器及试剂
1．1．3．1 主要仪器
组织脱水机（莱卡）、石蜡包埋机（型号：EG1150H,莱卡）、电子数显卡尺（德国伍尔特）、电子天平、倒置显微镜、细胞计数板和电子细胞计数仪、1640体视显微镜、液氮生物容器、微量移液器、离心机及离心管、1ml注射器等。
1．1．3．2 主要试剂
20%胎牛血清(美国Invitrogen Gibco)、100U/ml青霉素钠、100U/ml 链霉素(美国Invitrogen Gibco)、PBS缓冲液、10%中性甲醛、苏木精伊红染液。
1．2 试验方法
1．2．1 试剂配制
10%中性甲醛：准确量取甲醛溶液100ml,称取磷酸二氢钠6.5g,再加蒸馏水900ml,配置成10%中性甲醛,待用；
PBS 缓冲液：分别称取 0.2g 氯化钾,1.44g 磷酸氢二钠,8.0g 氯化钠,0.24g磷酸二氢钾,加适量双蒸水配至总体积为 1.0L。调节PH值到 7.4,用盐水瓶分装后高压消毒。降至室温后保存于 4°C冰箱。
1．2．2 细胞培养
1．2．2．1 原代培养
HL60细胞株购自ATCC,原代细胞由ATCC培养。
1．2．2．2 传代培养
HL60细胞培养条件采用含20%胎牛血清、双抗（100U/ml青霉素钠、100U/ml 链霉素）的RPMI1640完全培养液中,置37℃、5% CO2细胞培养箱中悬浮培养。每2~3天换液传代一次。取对数生长期细胞进行实验,细胞成悬浮状态,生长良好,成活率>95%。
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