非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排分析
非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排分析[20200507190931]
摘要：目的 建立准确可靠、操作性强、适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链( immunoglobulin heavy chain, IgH) 基因单克隆重排检测方法，用于B 细胞性非霍奇金淋巴瘤( B－cell non－Hodgkin lymphoma, B－NHL) 的辅助诊断。 方法 选取IgH 3个骨架区(framework region, FR) 引物（FR1、FR2、FR3 区各3条）和重链连接区 ( joining region of heavy chain, JH ) 引物。采用实时荧光PCR法对非霍奇金淋巴瘤基因重排36份石蜡组织标本进行 IgH 基因单克隆重排检测，通过融解曲线分析可以确定 IgH 基因重排产物的特异性。结果 实时荧光PCR检测 IgH基因重排的检出率为94%(34/36)，与琼脂糖凝胶电泳结果一致。结论 应用实时荧光PCR 法进行基因单克隆重排检测，简单易行，结果准确可靠，阳性率较高，可用于临床 B－NHL 的辅助诊断。
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关键字:淋巴瘤；免疫球蛋白；基因重排
目录
摘要4
关键词4
Abstract 4
Key words4
引言5
1 材料与方法5
1.1实验材料与仪器5
1.1.1 实验材料5
1.1.2 仪器与设备5
1.1.3试剂6
1.1.4 主要试剂的配方6
1.2实验方法6
1.2.1 基因组DNA的提取及质量控制6
1.2.1.1石蜡包埋组织块 DNA 的提取6
1.2.1.2基因组DNA质量控制6
1.2.1.3 DNA纯度7
1.2.2 引物设计及合成7
1.2.2.1引物设计的原则7
1.2.2.2引物设计的主要步骤7
1.2.3 引物的考察7
1.2.4 引物组合的确定7
1.2.5 检测体系的建立与考察8
1.2.6 检测体系的评价8
1.2.6.1灵敏度考察8
1.2.6.2选择性考察8
1.2.6.3 临床标本的检测8
2 实验结果8
2.1 DNA提取及质量控制8
2.2引物组合的确定9
2.3 多重实时荧光PCR检测体系的建立与考察10
2.4灵敏度考察.12
2.5 选择性考察.13
2.6 临床标本的检测.14
3 讨论16
致谢19
参考文献.19
表1多重实时荧光PCR检测五种基因重排阳性质粒灵敏度实验.13
表2多重实时荧光PCR检测五种基因重排阳性质粒选择性实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
验14
表3多重实时荧光PCR检测38份临床标本的结果15
图1 DNA浓度及纯度检测8
图2 镁离子浓度分析结果......10
图3特异引物与通用引物比例分析结果...10
图4引物用量优化结果10
图5染料用量优化结果11
图6酶用量优化结果11
图7 多重实时荧光PCR对五种基因重排阳性质粒灵敏度考察.12
图8 多重实时荧光PCR对五种基因重排阳性质粒选择性考察.14
图9 琼脂糖凝胶电泳检测36份B-NHL石蜡标本结果16
非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排分析
引言
恶性淋巴瘤（malignant lymphoma) 又称“淋巴癌”，是原发于淋巴器官和淋巴组织的恶性肿瘤。可见于任何年龄，是全球增长最迅速的恶性肿瘤之一。近年来我国淋巴瘤发病率逐年上升，为十大高发肿瘤之一。根据肿瘤的组织结构及细胞学特征分为霍奇金淋巴瘤(Hodginps malignant lymphoma, HL)及非霍奇金淋巴瘤(non-Hodginps malignant lymphoma, NHL) 两大类。
恶性淋巴瘤( ML)的诊断是一直是肿瘤病理学上的一个难题。淋巴结内的细胞增生十分活跃，各种分化阶段的细胞混杂在一起，反应性淋巴结增生还是淋巴瘤容易混淆。单凭形态学分析常常难以区分淋巴细胞良性反应性增生和恶性淋巴瘤。其中，非霍奇金淋巴瘤的诊断及鉴别诊断比较复杂，误诊率较高，其诊断主要靠组织病理学检查，而治疗效果评价主要靠影像学检测，因而对此疾病的认识较为局限，常与炎性增生难于区别而延误诊断及治疗[1]。部分 B-NHL 单纯通过 HE 染色和免疫组化分析很难明确其性质，另外该病种类繁多，分类复杂，组织形态复杂多变，给临床病理诊断工作带来了一定的困难[2]。
NHL 是一类具有很强异质性的淋巴瘤，从免疫学角度分 T 细胞和 B 细胞两型。NHL 组织学形态多样，形态学结合免疫组化能确诊 70%～80% 的病例，其余 20%～ 30% 常与反应性病变难以区别[3]。近年来随着分子免疫学研究的不断深入及 PCR 技术在肿瘤研究中的应用，除形态学和免疫组织化学外，分子水平的诊断已日益显示出重要作用，国内外也有用分子生物学技术证实细胞的单克隆性增殖可协助NHL的诊断。本研究应用实时荧光 PCR 方法检测非霍奇金淋巴瘤中的 IgH 基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。
1 材料和方法
1.1实验材料与仪器
1.1.1实验材料
PMD18-T载体 （TaKaRa，大连）
DH5α感受态细胞 实验室制备
胶回收试剂盒 （OMEGA，美国）
Taq HS （TaKaRa，大连）
DAUDI基因重排阳性细胞 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
（迪澳生物科技有限公司，广州）
1.1.2 仪器与设备
荧光定量PCR仪（Rotor-Gene 6000） （Corbett Research，澳大利亚）
SLAN-96P实时荧光定量PCR仪 上海宏时医疗科技有限公司
Bio-Rad CFX96 （Bio-Rad，美国）
LightCycler? 480II 实时荧光定量PCR系统 罗氏（Roche）中国公司
BIO – RAD DNA Engine PCR仪 伯乐（Bio - Rad）中国公司
AIRTECN BHC – 1300 II A/B3生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司
1.1.3 试剂
PCR用水为经高压灭菌的Milli-Q超纯水；Taq酶（5U/μL）、Taq热启动酶（5U/μL）购自宝生物工程（大连）有限公司；dNTP（25mmol/L）购自上海生工；SYTO9（5mmol/L）饱和荧光染料购自美国Invitrogen公司；MgCl2为国产AR级分析纯试剂；Tris（Ultra Pure）购自 BIO BASIC INC（上海）；引物设计后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
B管
C管
以A管IGHV1的灵敏度考察为例说明。在熔解曲线（如图6）中，前4个浓度（10 0ng/μL~100 pg/μL）即图中红、蓝、橙、绿峰，呈良好的梯度关系；当模板浓度稀释至100pg/μl时，即图中玫红色峰，峰高较低，无法和野生峰（灰色峰）区分开。A管IGHV1灵敏度线性范围10 0ng/μL~100 pg/μL。
摘要：目的 建立准确可靠、操作性强、适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链( immunoglobulin heavy chain, IgH) 基因单克隆重排检测方法，用于B 细胞性非霍奇金淋巴瘤( B－cell non－Hodgkin lymphoma, B－NHL) 的辅助诊断。 方法 选取IgH 3个骨架区(framework region, FR) 引物（FR1、FR2、FR3 区各3条）和重链连接区 ( joining region of heavy chain, JH ) 引物。采用实时荧光PCR法对非霍奇金淋巴瘤基因重排36份石蜡组织标本进行 IgH 基因单克隆重排检测，通过融解曲线分析可以确定 IgH 基因重排产物的特异性。结果 实时荧光PCR检测 IgH基因重排的检出率为94%(34/36)，与琼脂糖凝胶电泳结果一致。结论 应用实时荧光PCR 法进行基因单克隆重排检测，简单易行，结果准确可靠，阳性率较高，可用于临床 B－NHL 的辅助诊断。
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关键字:淋巴瘤；免疫球蛋白；基因重排
目录
摘要4
关键词4
Abstract 4
Key words4
引言5
1 材料与方法5
1.1实验材料与仪器5
1.1.1 实验材料5
1.1.2 仪器与设备5
1.1.3试剂6
1.1.4 主要试剂的配方6
1.2实验方法6
1.2.1 基因组DNA的提取及质量控制6
1.2.1.1石蜡包埋组织块 DNA 的提取6
1.2.1.2基因组DNA质量控制6
1.2.1.3 DNA纯度7
1.2.2 引物设计及合成7
1.2.2.1引物设计的原则7
1.2.2.2引物设计的主要步骤7
1.2.3 引物的考察7
1.2.4 引物组合的确定7
1.2.5 检测体系的建立与考察8
1.2.6 检测体系的评价8
1.2.6.1灵敏度考察8
1.2.6.2选择性考察8
1.2.6.3 临床标本的检测8
2 实验结果8
2.1 DNA提取及质量控制8
2.2引物组合的确定9
2.3 多重实时荧光PCR检测体系的建立与考察10
2.4灵敏度考察.12
2.5 选择性考察.13
2.6 临床标本的检测.14
3 讨论16
致谢19
参考文献.19
表1多重实时荧光PCR检测五种基因重排阳性质粒灵敏度实验.13
表2多重实时荧光PCR检测五种基因重排阳性质粒选择性实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
验14
表3多重实时荧光PCR检测38份临床标本的结果15
图1 DNA浓度及纯度检测8
图2 镁离子浓度分析结果......10
图3特异引物与通用引物比例分析结果...10
图4引物用量优化结果10
图5染料用量优化结果11
图6酶用量优化结果11
图7 多重实时荧光PCR对五种基因重排阳性质粒灵敏度考察.12
图8 多重实时荧光PCR对五种基因重排阳性质粒选择性考察.14
图9 琼脂糖凝胶电泳检测36份B-NHL石蜡标本结果16
非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排分析
引言
恶性淋巴瘤（malignant lymphoma) 又称“淋巴癌”，是原发于淋巴器官和淋巴组织的恶性肿瘤。可见于任何年龄，是全球增长最迅速的恶性肿瘤之一。近年来我国淋巴瘤发病率逐年上升，为十大高发肿瘤之一。根据肿瘤的组织结构及细胞学特征分为霍奇金淋巴瘤(Hodginps malignant lymphoma, HL)及非霍奇金淋巴瘤(non-Hodginps malignant lymphoma, NHL) 两大类。
恶性淋巴瘤( ML)的诊断是一直是肿瘤病理学上的一个难题。淋巴结内的细胞增生十分活跃，各种分化阶段的细胞混杂在一起，反应性淋巴结增生还是淋巴瘤容易混淆。单凭形态学分析常常难以区分淋巴细胞良性反应性增生和恶性淋巴瘤。其中，非霍奇金淋巴瘤的诊断及鉴别诊断比较复杂，误诊率较高，其诊断主要靠组织病理学检查，而治疗效果评价主要靠影像学检测，因而对此疾病的认识较为局限，常与炎性增生难于区别而延误诊断及治疗[1]。部分 B-NHL 单纯通过 HE 染色和免疫组化分析很难明确其性质，另外该病种类繁多，分类复杂，组织形态复杂多变，给临床病理诊断工作带来了一定的困难[2]。
NHL 是一类具有很强异质性的淋巴瘤，从免疫学角度分 T 细胞和 B 细胞两型。NHL 组织学形态多样，形态学结合免疫组化能确诊 70%～80% 的病例，其余 20%～ 30% 常与反应性病变难以区别[3]。近年来随着分子免疫学研究的不断深入及 PCR 技术在肿瘤研究中的应用，除形态学和免疫组织化学外，分子水平的诊断已日益显示出重要作用，国内外也有用分子生物学技术证实细胞的单克隆性增殖可协助NHL的诊断。本研究应用实时荧光 PCR 方法检测非霍奇金淋巴瘤中的 IgH 基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。
1 材料和方法
1.1实验材料与仪器
1.1.1实验材料
PMD18-T载体 （TaKaRa，大连）
DH5α感受态细胞 实验室制备
胶回收试剂盒 （OMEGA，美国）
Taq HS （TaKaRa，大连）
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1.1.2 仪器与设备
荧光定量PCR仪（Rotor-Gene 6000） （Corbett Research，澳大利亚）
SLAN-96P实时荧光定量PCR仪 上海宏时医疗科技有限公司
Bio-Rad CFX96 （Bio-Rad，美国）
LightCycler? 480II 实时荧光定量PCR系统 罗氏（Roche）中国公司
BIO – RAD DNA Engine PCR仪 伯乐（Bio - Rad）中国公司
AIRTECN BHC – 1300 II A/B3生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司
1.1.3 试剂
PCR用水为经高压灭菌的Milli-Q超纯水；Taq酶（5U/μL）、Taq热启动酶（5U/μL）购自宝生物工程（大连）有限公司；dNTP（25mmol/L）购自上海生工；SYTO9（5mmol/L）饱和荧光染料购自美国Invitrogen公司；MgCl2为国产AR级分析纯试剂；Tris（Ultra Pure）购自 BIO BASIC INC（上海）；引物设计后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
B管
C管
以A管IGHV1的灵敏度考察为例说明。在熔解曲线（如图6）中，前4个浓度（10 0ng/μL~100 pg/μL）即图中红、蓝、橙、绿峰，呈良好的梯度关系；当模板浓度稀释至100pg/μl时，即图中玫红色峰，峰高较低，无法和野生峰（灰色峰）区分开。A管IGHV1灵敏度线性范围10 0ng/μL~100 pg/μL。
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