mtor抑制剂rad001对rko细胞凋亡的影响
哺乳动物靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以调节细胞的增殖与凋亡。RAD001是雷帕霉素的衍生物，是一种有效抗肿瘤活性的口服mTOR特异性抑制剂，但其在体外诱导细胞凋亡的机理还不清楚。因此，本研究探讨RAD001对RKO细胞凋亡的影响。首先，用MTS法确定了RAD001作用于RKO细胞的最适浓度是20μM，其次用Hoechst33258染色和流式细胞术检测了20μM RAD001在RKO细胞中诱导的细胞凋亡约为30-50%，并且诱导的细胞凋亡不依赖于p53表达，而是与DR5表达息息相关，另外，在RKO细胞中，Caspase-3/8/9表达上调，RPS磷酸化受到抑制。因此，本研究为RAD001在结肠癌的靶向治疗提供了理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1细胞来源2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器3
1.2实验方法3
1.2.1 细胞培养4
1.2.2细胞生长检测4
1.2.3 对数生长期细胞的检测准备4
1.2.4细胞凋亡检测4
1.2.5 Realtime4
1.2.6 Westernblot5
1.2.7 统计学分析5
2结果与分析5
2.1 RAD001抑制RKO细胞的生长5
2.2 RAD001诱导RKO细胞凋亡6
2.3 RAD001对RKO细胞诱导的细胞凋亡不依赖于p537
2．4 DR5在RAD001诱导凋亡的RKO细胞中表达上调8
3讨论9
致谢10
参考文献11
图11 RAD001的分子结构式2
图12 技术路线3
图13 Realtime PCR程序5
图21 MTS法检测不同浓度RAD001对RKO的生长影响6
图221用Hochest33258荧光染色法检测RKO细胞凋亡6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
图222 用Annexin V/PI流式细胞术检测RKO细胞凋亡7
图231 用Hochest33258荧光染色法检测RKO和p53KO细胞凋亡7
图232 用Annexin V/PI流式细胞术检测RKO和p53KO细胞凋亡7
图233 Westernblot检测Caspase3/8和DR5的表达水平8
图241 Realtime PCR检测DR5表达水平8
图242 Westernblot检测Caspase3/8/9、DR5和RPS6的表达水平8
图31RAD001在mTOR通路中的作用10
表11主要的试剂及试剂盒2
表12 主要的仪器3
表21逆转录第一阶段反应体系4
表22逆转录第二阶段反应体系4
表23 Realtime PCR反应体系5
表24 Realtime PCR所需引物5
mTOR抑制剂RAD001对RKO细胞凋亡的影响
引言
结直肠癌(CRC)严重危害人类的健康，每年都有超过100万新发病例，而且还会有60多万人因此死亡，CRC在美国的恶性肿瘤排行榜上名列“三甲” [1]。由于绝大多数患者确诊时病情已经发展至中晚期或已发生转移，难以进行手术切除，以致结肠癌患者存活率很低。现行标准Gemcitabine疗法和放射疗法仅仅延长患者的生存期几个月，没有显著的疗效，还可能发生介导结肠癌耐药和转移的风险。因此，近几年在癌症研究中，针对癌症的核心通路开发新的靶向治疗药物，已成为提高结肠癌疗效的热门研究话题 [2]。
PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了细胞生长、增殖、发育、分化以及细胞癌变等过程，是迄今研究中最为活跃的通路之一[3]。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)位于其下游部分，是一种在哺乳动物细胞中普遍表达的丝氨酸/苏氨酸激酶。它在基因转录，蛋白质翻译起始，核糖体生物合成，细胞凋亡等多种生物学过程均有参与[4]。mTOR作为许多介导细胞存活及生长的上游信号因子，能刺激下游效应器活化。mTOR分为mTORC1和mTORC2，其中mTORC1响应于PI3K/ AKT信号传导[5]，使主要下游效应蛋白磷酸化，增加蛋白质的合成。目前已有研究在几个人类肿瘤疾病中检测到了mTOR的过度活化[68]，他们表示，mTOR功能失调可能会导致肿瘤的发生，这连同其下游反应将成为肿瘤治疗的一个靶点[9]。有科学家证实，mTOR抑制剂雷帕霉素可在体内诱导肿瘤细胞凋亡，在临床研究中已取得一些成效，最好的治疗结果为预防肾移植免疫排斥和Kaposi肉瘤的治疗[1012]。
雷帕霉素衍生物RAD001(42O(2hydroxyethyl)rapamycin)(图11)是一种美国诺华制药公司开发的口服型mTOR特异性抑制剂[1,2]。2009年以RCC治疗药物在美国上市[13]，之后陆续获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，用于成人的胰腺肿瘤晚期(PNET)、肾血管平滑肌脂肪瘤和结节性硬化症(TSC)以及不适宜手术治疗的TSC相关室管膜下巨细胞星形细胞瘤(SEGA)的治疗。
目前国内关于RAD001的研究还局限于将其用作器官移植方面的免疫抑制剂与靶向治疗肿瘤的一些临床应用中[14]，在细胞体外培养方面还未进行尝试。本研究希望通过实验探索mTOR抑制剂RAD001对体外培养RKO细胞凋亡的影响及内在机理。
图11 RAD001的分子结构式
FIG.11 RAD001 molecular structure
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 细胞来源
RKO细胞(野生型(WT))，p53KO细胞，引进于Manassas，VA，USA。
1．1．2 主要试剂
实验过程中所用到的试剂和试剂盒情况见详表11：
表11主要的试剂及试剂盒
Tab.11The main reagents and test kits
序号
名称
生产厂家
1
RAD001
LC Laboratories
2
McCoy’s5A培养液
Hyclone公司
3
DMSO溶液
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1细胞来源2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器3
1.2实验方法3
1.2.1 细胞培养4
1.2.2细胞生长检测4
1.2.3 对数生长期细胞的检测准备4
1.2.4细胞凋亡检测4
1.2.5 Realtime4
1.2.6 Westernblot5
1.2.7 统计学分析5
2结果与分析5
2.1 RAD001抑制RKO细胞的生长5
2.2 RAD001诱导RKO细胞凋亡6
2.3 RAD001对RKO细胞诱导的细胞凋亡不依赖于p537
2．4 DR5在RAD001诱导凋亡的RKO细胞中表达上调8
3讨论9
致谢10
参考文献11
图11 RAD001的分子结构式2
图12 技术路线3
图13 Realtime PCR程序5
图21 MTS法检测不同浓度RAD001对RKO的生长影响6
图221用Hochest33258荧光染色法检测RKO细胞凋亡6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
图222 用Annexin V/PI流式细胞术检测RKO细胞凋亡7
图231 用Hochest33258荧光染色法检测RKO和p53KO细胞凋亡7
图232 用Annexin V/PI流式细胞术检测RKO和p53KO细胞凋亡7
图233 Westernblot检测Caspase3/8和DR5的表达水平8
图241 Realtime PCR检测DR5表达水平8
图242 Westernblot检测Caspase3/8/9、DR5和RPS6的表达水平8
图31RAD001在mTOR通路中的作用10
表11主要的试剂及试剂盒2
表12 主要的仪器3
表21逆转录第一阶段反应体系4
表22逆转录第二阶段反应体系4
表23 Realtime PCR反应体系5
表24 Realtime PCR所需引物5
mTOR抑制剂RAD001对RKO细胞凋亡的影响
引言
结直肠癌(CRC)严重危害人类的健康，每年都有超过100万新发病例，而且还会有60多万人因此死亡，CRC在美国的恶性肿瘤排行榜上名列“三甲” [1]。由于绝大多数患者确诊时病情已经发展至中晚期或已发生转移，难以进行手术切除，以致结肠癌患者存活率很低。现行标准Gemcitabine疗法和放射疗法仅仅延长患者的生存期几个月，没有显著的疗效，还可能发生介导结肠癌耐药和转移的风险。因此，近几年在癌症研究中，针对癌症的核心通路开发新的靶向治疗药物，已成为提高结肠癌疗效的热门研究话题 [2]。
PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了细胞生长、增殖、发育、分化以及细胞癌变等过程，是迄今研究中最为活跃的通路之一[3]。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)位于其下游部分，是一种在哺乳动物细胞中普遍表达的丝氨酸/苏氨酸激酶。它在基因转录，蛋白质翻译起始，核糖体生物合成，细胞凋亡等多种生物学过程均有参与[4]。mTOR作为许多介导细胞存活及生长的上游信号因子，能刺激下游效应器活化。mTOR分为mTORC1和mTORC2，其中mTORC1响应于PI3K/ AKT信号传导[5]，使主要下游效应蛋白磷酸化，增加蛋白质的合成。目前已有研究在几个人类肿瘤疾病中检测到了mTOR的过度活化[68]，他们表示，mTOR功能失调可能会导致肿瘤的发生，这连同其下游反应将成为肿瘤治疗的一个靶点[9]。有科学家证实，mTOR抑制剂雷帕霉素可在体内诱导肿瘤细胞凋亡，在临床研究中已取得一些成效，最好的治疗结果为预防肾移植免疫排斥和Kaposi肉瘤的治疗[1012]。
雷帕霉素衍生物RAD001(42O(2hydroxyethyl)rapamycin)(图11)是一种美国诺华制药公司开发的口服型mTOR特异性抑制剂[1,2]。2009年以RCC治疗药物在美国上市[13]，之后陆续获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，用于成人的胰腺肿瘤晚期(PNET)、肾血管平滑肌脂肪瘤和结节性硬化症(TSC)以及不适宜手术治疗的TSC相关室管膜下巨细胞星形细胞瘤(SEGA)的治疗。
目前国内关于RAD001的研究还局限于将其用作器官移植方面的免疫抑制剂与靶向治疗肿瘤的一些临床应用中[14]，在细胞体外培养方面还未进行尝试。本研究希望通过实验探索mTOR抑制剂RAD001对体外培养RKO细胞凋亡的影响及内在机理。
图11 RAD001的分子结构式
FIG.11 RAD001 molecular structure
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 细胞来源
RKO细胞(野生型(WT))，p53KO细胞，引进于Manassas，VA，USA。
1．1．2 主要试剂
实验过程中所用到的试剂和试剂盒情况见详表11：
表11主要的试剂及试剂盒
Tab.11The main reagents and test kits
序号
名称
生产厂家
1
RAD001
LC Laboratories
2
McCoy’s5A培养液
Hyclone公司
3
DMSO溶液
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