盐酸替洛隆对新城疫lasota株疫苗免疫效果的影响研究
盐酸替洛隆是一种常用的干扰素诱导剂，而新城疫是目前我国分布最广、危害最严重的禽病之一。本文章旨在研究盐酸替洛隆对新城疫LaSota株疫苗免疫效果的影响。本实验是通过设置不同剂量的实验组并利用微量血凝-血凝抑制法研究给予盐酸替洛隆这一药物对于同时接种新城疫疫苗的鸡产生的抗体水平的影响，结果发现在疫苗免疫的同时根据雏鸡体重以30mg/kg的剂量给予盐酸替洛隆是可以提高雏鸡体内的新城疫抗体水平。这一结果表明盐酸替洛隆在未来的养鸡业中具有良好的应用前景。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试剂与仪器2
1.1.1 实验动物与药品2
1.1.2 实验器材与仪器2
1.2 实验步骤与方法2
1.2.1 试剂的配制2
1.2.2 雏鸡分组与滴鼻免疫3
1.2.3 鸡翅静脉采血3
1.2.4 采血分离血清3
1.2.5 鸡胚接种与病毒收获3
1.2.6 血凝实验4
1.2.7 血凝抑制实验4
2 结果与分析4
2.1 体重与抗体4
2.1.1 分析体重数据4
2.1.2 分析血清抗体效价5
3 讨论5
3.1 鸡的饲养6
3.2 滴鼻免疫6
3.3 分离血清6
3.4 鸡胚接种6
3.5 测定抗体效价6
致谢6
参考文献7
附录一7
盐酸替洛隆对新城疫LaSota株疫苗免疫效果的影响研究
引言
替洛隆（Tilorone）又称乙氨芴酮或梯洛龙，是一种使用较多的干扰素诱导剂[1]，分子量较小，而用于临床应用的主要是其盐酸盐即盐酸替洛隆（Tilorone dihydrochloride）,该药物在体内游离出替洛隆而起作用。1970年，盐酸替洛隆首次被报道在小鼠上应用具有抗病毒活性[2]。目前其已经逐渐被证明具有广泛的药理活性，如增强自然杀伤细胞的吞噬功能[3
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]、抗炎症[4]、抗病毒[5]、抗纤维化及抗肿瘤[6]等作用。此外，经实验发现该药物对大鼠实验性矽肺具有明显的疗效[7]，对人的黑色素瘤和食管增生也具有一定疗效[8]。利用传统的合成方法合成盐酸替洛隆因获得的化学合成中间体纯度低、能源消耗大和易发生爆炸等问题不适合大规模的生产，但是在新的改进合成方法中利用甲醇来合成酯可以以较低的成本获得大量的纯净的化学合成中间体，适宜于工业化生产[9]，为盐酸替洛隆更加广泛的应用于临床实际奠定了基础。
新城疫(Newcastle Disease）是一种由新城疫病毒所引起的危害许多禽类动物的急性及高度接触性传染病。患病动物的临床症状有高热、呼吸急促、下痢、黏膜及浆膜的出血，而且该病具有很高的发病率和死亡率， 故而该病被OIE组织列为A类传染病，同时在我国也被列为一类传染病。新城疫于1926年首次在印尼的爪哇爆发，并在同一年发现于英国的新城，故而得名新城疫，是我国分布最广、危害最严重的禽病之一。控制新城疫的措施，发达国家以捕杀强毒感染的种群为主，同时注重疫苗接种；而在大多数的发展中国家，由于淘汰感染种群的成本太大，故采取疫苗接种仍是防控该病的主要手段。近年来虽然随着养殖技术的提升和相关疫苗接种措施的应用，该病的发生得到了明显控制，但是由于新城疫病毒株的不断变异和免疫程序、免疫质量等因素所造成的免疫失败，给该病的防控工作带来新的挑战，故如何充分发挥疫苗的免疫效果则成为新城疫防控领域的研究热点。目前有很多中药成分已被研究过其对新城疫疫苗的免疫效果的影响，而且实验结果较好[1013]。而鸡的养殖过程中常用的新城疫疫苗为新城疫低毒力活疫苗（LaSota株），故本课题旨在研究盐酸替洛隆对于新城疫LaSota株疫苗的免疫效果的影响，若该药物具有明显的增强疫苗免疫效果的作用，将对疫苗更有效的应用于生产养殖产生重大的实际意义，从而促进养鸡业的长远发展。
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
1．1．1 实验动物与药品
1日龄海兰褐雏鸡25只（购自南京市汤泉农场）；10日龄SPF鸡胚（购自南京天邦生物科技有限公司）；华畜特级雏鸡饲料（购自新乡市八牧科技有限公司）；盐酸替洛隆（南京美智德合成材料有限公司）；鸡新城疫低毒力LaSota株活疫苗（生产批号149119，南京天邦生物科技有限公司）。
1．1．2 实验器材与仪器
饲料盘、饮水盘（购自石家庄冠江畜牧设备厂）；200 μL枪头、1000 μL枪头、2 mL注射器、1 mL注射器、96孔V型血凝板、一次性塑料滴管、1.5 mL离心管、双面板、枪头盒、10 mL离心管、眼科镊、手术剪（均购自南京寿德试验器材有限公司）；200 μL移液枪、1000 μL移液枪、医用灭菌手套、100 mL量筒、玻璃棒、500 mL试剂瓶、50 mL离心管、酒精灯、打火机、蛋托、照蛋器、鸡胚打孔器、石蜡、三脚架、棉棒、西林瓶、1000 mL烧杯、桌布、白胶带、养鸡笼、粪盘、大功率照灯、湿温度计（得力9013型）、称量天平、 电子天平（型号sartorius BSA224S，赛多利斯仪器有限公司）、超净工作台（苏净安泰）、隔水式恒温培养箱（GRP9050型，上海森信实验仪器有限公司 ）、冰箱（海尔）、电热恒温鼓风干燥箱（DGG9240型，上海森信实验仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌器（LSB50L型，上海华线医用核子仪器有限公司）、高速离心机（3K15型，德国SIGMA）
1．2 实验步骤与方法
1．2．1 试剂的配制
PBS：取磷酸二氢钾（广东汕头市西陇化工厂）0.135 g、磷酸氢二钠（上海凌峰化学试剂有限公司）0.710 g、氯化钠（南京寿德试验器材有限公司）4.00 g、氯化钾（批号20100112，上海凌峰化学试剂有限公司）0.100 g，加入去离子水约400 mL搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节pH至7.4，最后定容到500 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌1520 min后备用。
阿氏液：取葡萄糖（批号20141008,南京寿德试验器材有限公司）2.05 g、柠檬酸钠（上海凌峰化学试剂有限公司）0.800 g、柠檬酸（批号030480015， 南京化学试剂一厂）0.055 g、氯化钠（南京寿德试验器材有限公司）0.420 g，加入去离子水搅拌溶解后调节pH值至6.1，再定容至100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌1520 min后备用。
1 %鸡红细胞悬液：采集3只SPF公鸡血液各1 mL，并于采血前向注射器中加入等体积的阿氏液，采完后将二者轻轻摇匀，再注入10 mL离心管中，加入PBS洗涤，之后以2000 r/min离心5 min，吸取离心管上层的淡黄色血浆层弃掉后再加入PBS洗涤，洗涤后继续以2000 r/min离心5 min，弃去上层液体，洗涤23次直至上清液澄清，吸取沉积在离心管底部的红细胞适量并按比例加入灭菌后的PBS配成1 %鸡红细胞悬液，置于4 ℃冰箱中保存备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试剂与仪器2
1.1.1 实验动物与药品2
1.1.2 实验器材与仪器2
1.2 实验步骤与方法2
1.2.1 试剂的配制2
1.2.2 雏鸡分组与滴鼻免疫3
1.2.3 鸡翅静脉采血3
1.2.4 采血分离血清3
1.2.5 鸡胚接种与病毒收获3
1.2.6 血凝实验4
1.2.7 血凝抑制实验4
2 结果与分析4
2.1 体重与抗体4
2.1.1 分析体重数据4
2.1.2 分析血清抗体效价5
3 讨论5
3.1 鸡的饲养6
3.2 滴鼻免疫6
3.3 分离血清6
3.4 鸡胚接种6
3.5 测定抗体效价6
致谢6
参考文献7
附录一7
盐酸替洛隆对新城疫LaSota株疫苗免疫效果的影响研究
引言
替洛隆（Tilorone）又称乙氨芴酮或梯洛龙，是一种使用较多的干扰素诱导剂[1]，分子量较小，而用于临床应用的主要是其盐酸盐即盐酸替洛隆（Tilorone dihydrochloride）,该药物在体内游离出替洛隆而起作用。1970年，盐酸替洛隆首次被报道在小鼠上应用具有抗病毒活性[2]。目前其已经逐渐被证明具有广泛的药理活性，如增强自然杀伤细胞的吞噬功能[3
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]、抗炎症[4]、抗病毒[5]、抗纤维化及抗肿瘤[6]等作用。此外，经实验发现该药物对大鼠实验性矽肺具有明显的疗效[7]，对人的黑色素瘤和食管增生也具有一定疗效[8]。利用传统的合成方法合成盐酸替洛隆因获得的化学合成中间体纯度低、能源消耗大和易发生爆炸等问题不适合大规模的生产，但是在新的改进合成方法中利用甲醇来合成酯可以以较低的成本获得大量的纯净的化学合成中间体，适宜于工业化生产[9]，为盐酸替洛隆更加广泛的应用于临床实际奠定了基础。
新城疫(Newcastle Disease）是一种由新城疫病毒所引起的危害许多禽类动物的急性及高度接触性传染病。患病动物的临床症状有高热、呼吸急促、下痢、黏膜及浆膜的出血，而且该病具有很高的发病率和死亡率， 故而该病被OIE组织列为A类传染病，同时在我国也被列为一类传染病。新城疫于1926年首次在印尼的爪哇爆发，并在同一年发现于英国的新城，故而得名新城疫，是我国分布最广、危害最严重的禽病之一。控制新城疫的措施，发达国家以捕杀强毒感染的种群为主，同时注重疫苗接种；而在大多数的发展中国家，由于淘汰感染种群的成本太大，故采取疫苗接种仍是防控该病的主要手段。近年来虽然随着养殖技术的提升和相关疫苗接种措施的应用，该病的发生得到了明显控制，但是由于新城疫病毒株的不断变异和免疫程序、免疫质量等因素所造成的免疫失败，给该病的防控工作带来新的挑战，故如何充分发挥疫苗的免疫效果则成为新城疫防控领域的研究热点。目前有很多中药成分已被研究过其对新城疫疫苗的免疫效果的影响，而且实验结果较好[1013]。而鸡的养殖过程中常用的新城疫疫苗为新城疫低毒力活疫苗（LaSota株），故本课题旨在研究盐酸替洛隆对于新城疫LaSota株疫苗的免疫效果的影响，若该药物具有明显的增强疫苗免疫效果的作用，将对疫苗更有效的应用于生产养殖产生重大的实际意义，从而促进养鸡业的长远发展。
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
1．1．1 实验动物与药品
1日龄海兰褐雏鸡25只（购自南京市汤泉农场）；10日龄SPF鸡胚（购自南京天邦生物科技有限公司）；华畜特级雏鸡饲料（购自新乡市八牧科技有限公司）；盐酸替洛隆（南京美智德合成材料有限公司）；鸡新城疫低毒力LaSota株活疫苗（生产批号149119，南京天邦生物科技有限公司）。
1．1．2 实验器材与仪器
饲料盘、饮水盘（购自石家庄冠江畜牧设备厂）；200 μL枪头、1000 μL枪头、2 mL注射器、1 mL注射器、96孔V型血凝板、一次性塑料滴管、1.5 mL离心管、双面板、枪头盒、10 mL离心管、眼科镊、手术剪（均购自南京寿德试验器材有限公司）；200 μL移液枪、1000 μL移液枪、医用灭菌手套、100 mL量筒、玻璃棒、500 mL试剂瓶、50 mL离心管、酒精灯、打火机、蛋托、照蛋器、鸡胚打孔器、石蜡、三脚架、棉棒、西林瓶、1000 mL烧杯、桌布、白胶带、养鸡笼、粪盘、大功率照灯、湿温度计（得力9013型）、称量天平、 电子天平（型号sartorius BSA224S，赛多利斯仪器有限公司）、超净工作台（苏净安泰）、隔水式恒温培养箱（GRP9050型，上海森信实验仪器有限公司 ）、冰箱（海尔）、电热恒温鼓风干燥箱（DGG9240型，上海森信实验仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌器（LSB50L型，上海华线医用核子仪器有限公司）、高速离心机（3K15型，德国SIGMA）
1．2 实验步骤与方法
1．2．1 试剂的配制
PBS：取磷酸二氢钾（广东汕头市西陇化工厂）0.135 g、磷酸氢二钠（上海凌峰化学试剂有限公司）0.710 g、氯化钠（南京寿德试验器材有限公司）4.00 g、氯化钾（批号20100112，上海凌峰化学试剂有限公司）0.100 g，加入去离子水约400 mL搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节pH至7.4，最后定容到500 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌1520 min后备用。
阿氏液：取葡萄糖（批号20141008,南京寿德试验器材有限公司）2.05 g、柠檬酸钠（上海凌峰化学试剂有限公司）0.800 g、柠檬酸（批号030480015， 南京化学试剂一厂）0.055 g、氯化钠（南京寿德试验器材有限公司）0.420 g，加入去离子水搅拌溶解后调节pH值至6.1，再定容至100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌1520 min后备用。
1 %鸡红细胞悬液：采集3只SPF公鸡血液各1 mL，并于采血前向注射器中加入等体积的阿氏液，采完后将二者轻轻摇匀，再注入10 mL离心管中，加入PBS洗涤，之后以2000 r/min离心5 min，吸取离心管上层的淡黄色血浆层弃掉后再加入PBS洗涤，洗涤后继续以2000 r/min离心5 min，弃去上层液体，洗涤23次直至上清液澄清，吸取沉积在离心管底部的红细胞适量并按比例加入灭菌后的PBS配成1 %鸡红细胞悬液，置于4 ℃冰箱中保存备用。
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