不同品种猪体细胞系的建立与优化
我国肉类的消耗主要以猪肉为主，所以养猪业的健康发展就显得尤为重要。但是近几年由于外来猪种、杂种改良和生活环境的恶化，我国地方猪的遗传资源的流失愈发严重。本课题研究的目的是建立不同品种猪的细胞系，使猪的遗传资源在基因水平上得以保留，一些濒危的地方猪就可以进行克隆来还原，为以后的畜禽生产做出很大的贡献。本人采集了猪的耳源组织，采用组织块贴壁法培养猪成纤维细胞，继原代培养成功后，进行体外传代培养，成功后进行冷冻。把其冷冻复苏之后，成纤维细胞能进行正常的培养和传代。培养到第四代后，能观察到成纤维细胞形态逐渐统一，多为梭形或不规则三角形。表明是猪的成纤维细胞。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract: 2
Keywords： 2
引言 2
1 实验材料和实验方法 3
1.1动物 3
1.2采样前准备 3
1.3 采样操作 3
1.4实验室准备 4
1.5原代培养 4
1.6传代培养........................................................5
1.7冷冻、复苏......................................................6
1.8存活率..........................................................6
2 实验结果 6
3 讨论 8
致谢 10
参考文献 10
不同品种猪体细胞系的建立与优化
引言
随着改革开放后经济的不断发展，农业类经济展现了其广阔的前景和不可撼动的地位，而畜牧业又是农业经济的重中之重。畜牧业的健康发展，关系到中国经济的发展和农民的生活水平质量。【1】畜牧业的地位和作用不断增强，在中西部地区，其产值已经是农业产值的50%以上，成为农民重要的经济收入。中国有句古话叫“民以食为天”，肉、蛋、奶已经成为人民生活必不可少的物质，它们也是人民生活水平提高的重要指标。其中，猪肉又是中国消费最高的肉类，所以，养猪业的发展 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
关系到整个民族的生活。【2】八十年代以前，我国农业以粮为纲，养猪业始终处于家庭副业和附属农业的地位，多为散户养殖，没有节约化的养殖和管理。随着经济的不断发展，现有的物质已经不能满足人民日益提高的生活水平，肉类已经能广泛的被消费起。而越来越多养猪场的建立，标志着中国养猪业已经从散户养殖向规模化、现代化发展。【3】但是，近些年来随着外来猪种的引进，本地优良的猪种被迫杂交改良，中国人民又喜食瘦肉，所以为数不多的几个瘦肉猪种占据了主导地位，我国地方良种面临着保种和淘汰的选择，不保种就意味着遗传资源的严重损失，所以在基因水平上保留猪种的遗传资源显得愈发重要。自从2001年Bondiol等【4】用四月龄公猪耳部成纤维细胞克隆得到2只活猪，说明用耳部成纤维细胞作核供体移植是可行的，也展示了建立细胞系的广阔前景。
细胞培养是指模拟机体内生存环境，用科学手段将细胞提取出来，并在体外生存、繁殖、传代的过程。Roux【5】让鸡胚的神经板在温热的盐水中存活了若干天，是第一次体外培养。如今，全世界已经建立起了几千种细胞系，在畜禽生产、医学、细胞工程方面做出了巨大的贡献。本实验旨在建立新淮、苏淮、沙乌头三种猪的耳部皮肤成纤维体细胞系，以猪耳为研究材料，应用组织块法培养三种猪的细胞系，保存了三种猪的遗传资源。
1实验材料和实验方法
细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。 也指可长期连续传代的培养细胞。细胞系又可分为有限细胞系和无限细胞系。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。
动物
来自养殖场的、保证生命体健康、饮食正常、没有疾病的新淮、苏淮、沙乌头三种母猪，在不伤害猪体本身的情况下采集猪耳源组织块。
1.2采样前准备
1.准备含有5x(倍)双抗的DMEM培养基15ml（不含血清，从4摄氏度拿出），由100x双抗储液稀释得到。
2.手术刀片（用于刮毛）；75%酒精；一次性手套；剪耳钳。
3．准备冰块，以保持样品低温环境，抑制细菌繁殖，这样3、4个小时，甚至一天都没关系。
1.3 采样操作
1.洗手并带好手套；
2.对耳朵所要采集区域的正反两面进行酒精消毒，并用刀片尽可能将毛刮净，随后用酒精尽力洗净采集区域的赃物；
3.用酒精对采样钳进行消毒，用剪耳钳剪下一小块耳部组织，之后倒一些培养基以冲掉样品上残留的酒精，将样品放入装培养基的15ml管子中，并用一次性手套套住带回实验室。
4，采集样品体积应该要比较大，可以提高细胞的存活率，便于建系
1.4实验室准备
1.四个中号皿
2.一小烧杯75%酒精（使用超纯水并于超净台中配置）
3.用锡纸（180摄氏度干灭）或者牛皮纸（湿灭）包裹的剪子、弯头镊子等器械
4.DPBS（无Ca、Mg）
1.5原代培养
1仔细清洁手和手臂并戴上一次性手套
2点燃酒精灯，所有的操作尽量在酒精灯附近完成
3在皿A中到入酒精，并将器械泡在剩余酒精中，在BCD中分别加入含10x抗生素的DPBS
4配置一管50ml的含2x抗生素的DPBS,配置一管50ml的原代培养基
5器械使用前先在酒精灯上烧一会，浸液冷却后再接触样品
6在皿A的酒精中漂洗样品，随后放入皿B，再额外准备个空皿，并将样品放入空皿中继续刮没有干净的毛，再在皿B中继续刮干净。
7再额外的空皿中揭开样品真皮并去掉中间软骨，随后依次放入皿C D
8在皿D中将组织块剪成小块，随后放入1.5ml管中，向1.5ml管中加入一点血清以免过于干燥，将剪刀涮一下酒精，继续剪碎。见下图。
9将剪刀在酒精中涮一涮，减掉枪头头部后放回酒精，加入DPBS，将样本吹起，呼出放入15ml管中，上下颠倒，静置，指导悬浮物不再下沉，吸取悬浮，重复洗三次。
10将剪刀在酒精上烧一下，减掉枪头头部，并向样品中加入培养基，并将样品全部转移到另一个15ml管中，用完整头部将样品吹起，1200转离心
11用酒精对移液器消毒，吸取上清，加入培养基，随后放入四个培养瓶中，前后左右晃动以铺平组织块
12将瓶子向远离组织平面的一角倾斜，并向每个瓶中加入五倍培养液，随后将培养瓶在培养箱中倒置4h，4h后将瓶子缓慢翻过来，几天后观察铁壁情况。
1.6传代培养
1.当原代培养的细胞已经生长到铺满整个瓶底的时候，用完整的枪头吸去培养液。
2.加入DPBS 3ml，用移液枪吹打漂洗。
3.加入含胰蛋白酶的EDTA 2ml，显微镜下观察，当大多数细胞开始脱落的时候，轻轻敲打瓶壁，让细胞尽快落下；
4.消化时间不能过长，当细胞变成图1状态的时候，立即加入3mlDMEM培养液，并将整个液体准入离心管中，3000r每分钟就行离心3分钟；
5.弃去上清液，加入DPBS清洗两次，根据细胞浓度平均分配到两个培养瓶中，每两天换一次液，然后继续传代或者冷冻。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract: 2
Keywords： 2
引言 2
1 实验材料和实验方法 3
1.1动物 3
1.2采样前准备 3
1.3 采样操作 3
1.4实验室准备 4
1.5原代培养 4
1.6传代培养........................................................5
1.7冷冻、复苏......................................................6
1.8存活率..........................................................6
2 实验结果 6
3 讨论 8
致谢 10
参考文献 10
不同品种猪体细胞系的建立与优化
引言
随着改革开放后经济的不断发展，农业类经济展现了其广阔的前景和不可撼动的地位，而畜牧业又是农业经济的重中之重。畜牧业的健康发展，关系到中国经济的发展和农民的生活水平质量。【1】畜牧业的地位和作用不断增强，在中西部地区，其产值已经是农业产值的50%以上，成为农民重要的经济收入。中国有句古话叫“民以食为天”，肉、蛋、奶已经成为人民生活必不可少的物质，它们也是人民生活水平提高的重要指标。其中，猪肉又是中国消费最高的肉类，所以，养猪业的发展 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
关系到整个民族的生活。【2】八十年代以前，我国农业以粮为纲，养猪业始终处于家庭副业和附属农业的地位，多为散户养殖，没有节约化的养殖和管理。随着经济的不断发展，现有的物质已经不能满足人民日益提高的生活水平，肉类已经能广泛的被消费起。而越来越多养猪场的建立，标志着中国养猪业已经从散户养殖向规模化、现代化发展。【3】但是，近些年来随着外来猪种的引进，本地优良的猪种被迫杂交改良，中国人民又喜食瘦肉，所以为数不多的几个瘦肉猪种占据了主导地位，我国地方良种面临着保种和淘汰的选择，不保种就意味着遗传资源的严重损失，所以在基因水平上保留猪种的遗传资源显得愈发重要。自从2001年Bondiol等【4】用四月龄公猪耳部成纤维细胞克隆得到2只活猪，说明用耳部成纤维细胞作核供体移植是可行的，也展示了建立细胞系的广阔前景。
细胞培养是指模拟机体内生存环境，用科学手段将细胞提取出来，并在体外生存、繁殖、传代的过程。Roux【5】让鸡胚的神经板在温热的盐水中存活了若干天，是第一次体外培养。如今，全世界已经建立起了几千种细胞系，在畜禽生产、医学、细胞工程方面做出了巨大的贡献。本实验旨在建立新淮、苏淮、沙乌头三种猪的耳部皮肤成纤维体细胞系，以猪耳为研究材料，应用组织块法培养三种猪的细胞系，保存了三种猪的遗传资源。
1实验材料和实验方法
细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。 也指可长期连续传代的培养细胞。细胞系又可分为有限细胞系和无限细胞系。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。
动物
来自养殖场的、保证生命体健康、饮食正常、没有疾病的新淮、苏淮、沙乌头三种母猪，在不伤害猪体本身的情况下采集猪耳源组织块。
1.2采样前准备
1.准备含有5x(倍)双抗的DMEM培养基15ml（不含血清，从4摄氏度拿出），由100x双抗储液稀释得到。
2.手术刀片（用于刮毛）；75%酒精；一次性手套；剪耳钳。
3．准备冰块，以保持样品低温环境，抑制细菌繁殖，这样3、4个小时，甚至一天都没关系。
1.3 采样操作
1.洗手并带好手套；
2.对耳朵所要采集区域的正反两面进行酒精消毒，并用刀片尽可能将毛刮净，随后用酒精尽力洗净采集区域的赃物；
3.用酒精对采样钳进行消毒，用剪耳钳剪下一小块耳部组织，之后倒一些培养基以冲掉样品上残留的酒精，将样品放入装培养基的15ml管子中，并用一次性手套套住带回实验室。
4，采集样品体积应该要比较大，可以提高细胞的存活率，便于建系
1.4实验室准备
1.四个中号皿
2.一小烧杯75%酒精（使用超纯水并于超净台中配置）
3.用锡纸（180摄氏度干灭）或者牛皮纸（湿灭）包裹的剪子、弯头镊子等器械
4.DPBS（无Ca、Mg）
1.5原代培养
1仔细清洁手和手臂并戴上一次性手套
2点燃酒精灯，所有的操作尽量在酒精灯附近完成
3在皿A中到入酒精，并将器械泡在剩余酒精中，在BCD中分别加入含10x抗生素的DPBS
4配置一管50ml的含2x抗生素的DPBS,配置一管50ml的原代培养基
5器械使用前先在酒精灯上烧一会，浸液冷却后再接触样品
6在皿A的酒精中漂洗样品，随后放入皿B，再额外准备个空皿，并将样品放入空皿中继续刮没有干净的毛，再在皿B中继续刮干净。
7再额外的空皿中揭开样品真皮并去掉中间软骨，随后依次放入皿C D
8在皿D中将组织块剪成小块，随后放入1.5ml管中，向1.5ml管中加入一点血清以免过于干燥，将剪刀涮一下酒精，继续剪碎。见下图。
9将剪刀在酒精中涮一涮，减掉枪头头部后放回酒精，加入DPBS，将样本吹起，呼出放入15ml管中，上下颠倒，静置，指导悬浮物不再下沉，吸取悬浮，重复洗三次。
10将剪刀在酒精上烧一下，减掉枪头头部，并向样品中加入培养基，并将样品全部转移到另一个15ml管中，用完整头部将样品吹起，1200转离心
11用酒精对移液器消毒，吸取上清，加入培养基，随后放入四个培养瓶中，前后左右晃动以铺平组织块
12将瓶子向远离组织平面的一角倾斜，并向每个瓶中加入五倍培养液，随后将培养瓶在培养箱中倒置4h，4h后将瓶子缓慢翻过来，几天后观察铁壁情况。
1.6传代培养
1.当原代培养的细胞已经生长到铺满整个瓶底的时候，用完整的枪头吸去培养液。
2.加入DPBS 3ml，用移液枪吹打漂洗。
3.加入含胰蛋白酶的EDTA 2ml，显微镜下观察，当大多数细胞开始脱落的时候，轻轻敲打瓶壁，让细胞尽快落下；
4.消化时间不能过长，当细胞变成图1状态的时候，立即加入3mlDMEM培养液，并将整个液体准入离心管中，3000r每分钟就行离心3分钟；
5.弃去上清液，加入DPBS清洗两次，根据细胞浓度平均分配到两个培养瓶中，每两天换一次液，然后继续传代或者冷冻。
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