山羊体况对卵泡发育相关基因表达影响研究
山羊，繁殖性状遗传力低、繁殖周期长、选育进展慢、且与生长性状之间的复杂关系是制约养羊经济效益的主要原因。为了更好的研究山羊的繁殖性能，有必要探索关于它们的繁殖性能的转录组信息，山羊卵泡转录组的建立将有助于研究卵泡发育的分子机制。肥胖严重影响人类健康，它不仅是代谢综合征表现要素，而且是糖尿病、心血管疾病及脂肪肝等多种疾病发生的独立危险因素。肥胖在发情，卵泡发育，内分泌等方面影响动物的繁殖性能，本实验通过对长江三角洲的山羊2-4mm卵泡基因表达进行RNA测序分析，以确定与肥胖相关的山羊卵泡发育潜在途径和基因。采用实时定量RT-PCR技术对差异表达的基因进行了验证。结果表明，通过KEGG通路分析显示，排列在前20位的途径，包括有关生殖和代谢多种途径，如类固醇激素的生物合成，脂肪的消化和吸收，咖啡因的代谢，吞噬体，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢等。以下9个差异表达基因(PRLR, 3βHSD, Cholesterol, APAF1, PDE5A, FGF9, IGF-I, Apolipoprotein A-I, Leptin-R)和一个参照基因 (GAPDH) 被选定为验证定量RT-PCR。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 实验仪器与化学试剂 3
1．2 样本采集 3
1．3 cDNA建库和Illumina测序 3
1．4 与参考基因组比对 4
1．5 基因表达量分析 4
1. 6 基因的GO分析与KEGG通路分析 4
1. 7 实时荧光定量PCR（RTPCR）验证 4
2 结果与分析 5
2．1 Illumina测序及质量检控 5
2. 2 参考基因组比对结果 6
2. 3 GO分析 6
2. 4 KEGG通路分析 7
2. 5 实时荧光定量PCR（RTPCR）基因表达分析 8
3 讨论 9
3．1 山羊体况对卵泡中繁殖相关基因表达的影响 9
3. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
2 山羊体况对卵泡中生长代谢相关基因表达的影响 10
4 小结 10
致谢 11
参考文献： 11
山羊体况对卵泡发育相关基因表达影响研究
引言
引言 山羊的繁殖性能受体重、年龄、饲养管理条件及营养水平等多种因素的影响。营养通过对动物体细胞、性器官、内外分泌机能和胎儿发育等繁殖机能的影响而发生作用。待产母羊的营养是一个主要影响卵母细胞和胚胎发育能力的因素。严重营养不足时，母羊的排卵和胎儿的发育会受到不同程度的影响，甚至导致胚胎被母体吸收、胚胎早期死亡、流产或弱羔等；营养充足时可能会引起肥胖[1]。肥胖的发生概率在母畜的生长中渐渐被关注。肥胖与最优繁殖性能之间的联系，在人类女性相关研究数据表明，年轻女性的体重指数(BMI或BCS,体况评分)越高，访问辅助生殖治疗(ART)数量越多。肥胖女性促卵泡激素(FSH)明显高于正常BMI女性，但是她们的卵母细胞却明显减少(P < 0.05)。病态肥胖类女性怀孕率显著比正常BMI女性降低(分别为41.7%和30.5%,P < 0.05)。而且体重指数BMI指数与早产率正相关(P < 0.05)。
转录组：指特定组织或细胞在某一环境或生理条件下所转录表达的所有的总和, 既包括编码蛋白的mRNA，也包括了各种非编码RNA，是连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能的纽带[2]。转录组研究作为后基因组时代的重要组学研究，不仅为研究基因表达及调控提供了重要的手段和方法，同时也为发掘功能基因提供了重要路径，是基因功能及结构研究的基础和出发点[3]。大规模转录组学检测技术的发展已有20 多年，从最初的差别杂交、mRNA 差异显示、抑制消减杂交等技术到当前DNA 芯片、基因表达系列分析等技术的广泛应用，转录组学研究技术得到了长足进步。而近年来，随着新一代高通量测序技术的发展，在此基础上产生的转录组测序（RNASeq)技术已渐成为大规模研究RNASeq，即利用高通量测序技术对经RNA反转录及PCR扩增得到的cDNA进行测序分析。该技术能在单核苷酸水平上全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。与其他转录组学技术相比，RNASeq 具有高通量、低成本、高灵敏度等明显的优势，同时可以获得低丰度的表达基因。相对于传统的芯片杂交技术，RNASeq无需预先针对已知序列设计探针，能对基因组未知物种进行全转录组分析，并且不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，大大提高了分辨率[4]。正是基于上述优点，使得RNASeq 技术具有多方面的应用价值。目前RNASeq 技术已广泛应用于基因表达转录水平研究、可变剪接等转录本结构变异研究、非编码 RNA 功能研究以及单核苷酸多态性(SNP) 标记物开发等。同时，近年来RNASeq 技术在进一步完善基因结构信息及挖掘新转录本及新基因方面的功能也逐渐受到关注。
山羊作为单胎动物，是人类繁殖的很好的动物模型。在连续的实验中，我们已经发现肥胖动物的卵泡发育的转录变化，这个数据集可用于研究如何控制肥胖山羊卵泡发育的分子机制，解决了肥胖对卵泡发育的冲突问题，有利于通过调节控制营养水平来提高母羊繁殖能力。
1 材料与方法
1. 1 实验仪器与化学试剂
主要仪器设备：全自动凝胶成像系统、PCR扩增仪、CO2培养箱、电泳仪、超净工作台、倒置显微镜、激光共聚焦显微镜、5417R型台式冷冻高速离心机、NanoDrop 2000微量核酸蛋白检测仪、低温冷冻离心机、数显恒温水浴锅HH6型、80 °C超低温冰箱；20 °C冰箱。
主要试剂：TRIzol、MMLV cDNA 合成试剂盒均购自美国Invitrogen公司、Platinum SYBR Green 定量 PGR SuperMixUDG (含独立包装的ROX染料)试剂盒、无RNase的DNase I美国Promega公司、Xgal和IPTG购自加拿大BBI公司、无RNase的离心管和枪头、无RNase和DNase、其它常规试剂均为国产分析。
1. 2 样本采集
本试验采用24只7月龄大的长江三角洲白山羊。饲料均采用全价颗粒料。喂养2个月，发情的山羊按体况评分被分为两类，BCS≥3.3为肥胖组，BCS=2.8?3.2正常组。屠宰试验母羊后，立即取卵巢，剥离24mm的完整卵泡，采集过程参考 Somchit等人[9]的方法。使用Qiagen公司RNeasy Micro Kit试剂盒提取颗粒细胞RNA，提取过程参考试剂盒使用说明书。紫外分光光度计测定A260/A280的OD值，检测提取RNA的浓度和纯度，比值处于1.82.0之间时，总RNA样本才可用。用1%琼脂糖凝胶检测RNA完整性。提纯的RNA放80℃保存。
1. 3 cDNA建库和Illumina测序
使用SOLi D Whole Transcriptome Analysis Kit(Life technologies，美国)，参照其说明书标准流程构建随机片段测序文库。
1.3. 1 加入打断试剂在恒温振荡孵育器中适温将m RNA 打断成短片段，以打断后的m RNA 为模板反转录合成一链 c DNA。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 实验仪器与化学试剂 3
1．2 样本采集 3
1．3 cDNA建库和Illumina测序 3
1．4 与参考基因组比对 4
1．5 基因表达量分析 4
1. 6 基因的GO分析与KEGG通路分析 4
1. 7 实时荧光定量PCR（RTPCR）验证 4
2 结果与分析 5
2．1 Illumina测序及质量检控 5
2. 2 参考基因组比对结果 6
2. 3 GO分析 6
2. 4 KEGG通路分析 7
2. 5 实时荧光定量PCR（RTPCR）基因表达分析 8
3 讨论 9
3．1 山羊体况对卵泡中繁殖相关基因表达的影响 9
3. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
2 山羊体况对卵泡中生长代谢相关基因表达的影响 10
4 小结 10
致谢 11
参考文献： 11
山羊体况对卵泡发育相关基因表达影响研究
引言
引言 山羊的繁殖性能受体重、年龄、饲养管理条件及营养水平等多种因素的影响。营养通过对动物体细胞、性器官、内外分泌机能和胎儿发育等繁殖机能的影响而发生作用。待产母羊的营养是一个主要影响卵母细胞和胚胎发育能力的因素。严重营养不足时，母羊的排卵和胎儿的发育会受到不同程度的影响，甚至导致胚胎被母体吸收、胚胎早期死亡、流产或弱羔等；营养充足时可能会引起肥胖[1]。肥胖的发生概率在母畜的生长中渐渐被关注。肥胖与最优繁殖性能之间的联系，在人类女性相关研究数据表明，年轻女性的体重指数(BMI或BCS,体况评分)越高，访问辅助生殖治疗(ART)数量越多。肥胖女性促卵泡激素(FSH)明显高于正常BMI女性，但是她们的卵母细胞却明显减少(P < 0.05)。病态肥胖类女性怀孕率显著比正常BMI女性降低(分别为41.7%和30.5%,P < 0.05)。而且体重指数BMI指数与早产率正相关(P < 0.05)。
转录组：指特定组织或细胞在某一环境或生理条件下所转录表达的所有的总和, 既包括编码蛋白的mRNA，也包括了各种非编码RNA，是连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能的纽带[2]。转录组研究作为后基因组时代的重要组学研究，不仅为研究基因表达及调控提供了重要的手段和方法，同时也为发掘功能基因提供了重要路径，是基因功能及结构研究的基础和出发点[3]。大规模转录组学检测技术的发展已有20 多年，从最初的差别杂交、mRNA 差异显示、抑制消减杂交等技术到当前DNA 芯片、基因表达系列分析等技术的广泛应用，转录组学研究技术得到了长足进步。而近年来，随着新一代高通量测序技术的发展，在此基础上产生的转录组测序（RNASeq)技术已渐成为大规模研究RNASeq，即利用高通量测序技术对经RNA反转录及PCR扩增得到的cDNA进行测序分析。该技术能在单核苷酸水平上全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。与其他转录组学技术相比，RNASeq 具有高通量、低成本、高灵敏度等明显的优势，同时可以获得低丰度的表达基因。相对于传统的芯片杂交技术，RNASeq无需预先针对已知序列设计探针，能对基因组未知物种进行全转录组分析，并且不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，大大提高了分辨率[4]。正是基于上述优点，使得RNASeq 技术具有多方面的应用价值。目前RNASeq 技术已广泛应用于基因表达转录水平研究、可变剪接等转录本结构变异研究、非编码 RNA 功能研究以及单核苷酸多态性(SNP) 标记物开发等。同时，近年来RNASeq 技术在进一步完善基因结构信息及挖掘新转录本及新基因方面的功能也逐渐受到关注。
山羊作为单胎动物，是人类繁殖的很好的动物模型。在连续的实验中，我们已经发现肥胖动物的卵泡发育的转录变化，这个数据集可用于研究如何控制肥胖山羊卵泡发育的分子机制，解决了肥胖对卵泡发育的冲突问题，有利于通过调节控制营养水平来提高母羊繁殖能力。
1 材料与方法
1. 1 实验仪器与化学试剂
主要仪器设备：全自动凝胶成像系统、PCR扩增仪、CO2培养箱、电泳仪、超净工作台、倒置显微镜、激光共聚焦显微镜、5417R型台式冷冻高速离心机、NanoDrop 2000微量核酸蛋白检测仪、低温冷冻离心机、数显恒温水浴锅HH6型、80 °C超低温冰箱；20 °C冰箱。
主要试剂：TRIzol、MMLV cDNA 合成试剂盒均购自美国Invitrogen公司、Platinum SYBR Green 定量 PGR SuperMixUDG (含独立包装的ROX染料)试剂盒、无RNase的DNase I美国Promega公司、Xgal和IPTG购自加拿大BBI公司、无RNase的离心管和枪头、无RNase和DNase、其它常规试剂均为国产分析。
1. 2 样本采集
本试验采用24只7月龄大的长江三角洲白山羊。饲料均采用全价颗粒料。喂养2个月，发情的山羊按体况评分被分为两类，BCS≥3.3为肥胖组，BCS=2.8?3.2正常组。屠宰试验母羊后，立即取卵巢，剥离24mm的完整卵泡，采集过程参考 Somchit等人[9]的方法。使用Qiagen公司RNeasy Micro Kit试剂盒提取颗粒细胞RNA，提取过程参考试剂盒使用说明书。紫外分光光度计测定A260/A280的OD值，检测提取RNA的浓度和纯度，比值处于1.82.0之间时，总RNA样本才可用。用1%琼脂糖凝胶检测RNA完整性。提纯的RNA放80℃保存。
1. 3 cDNA建库和Illumina测序
使用SOLi D Whole Transcriptome Analysis Kit(Life technologies，美国)，参照其说明书标准流程构建随机片段测序文库。
1.3. 1 加入打断试剂在恒温振荡孵育器中适温将m RNA 打断成短片段，以打断后的m RNA 为模板反转录合成一链 c DNA。
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