乙型脑炎病毒NS1`蛋白单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
乙型脑炎病毒NS1`蛋白单克隆抗体识别抗原表位的鉴定[20200507191652]
摘要：日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种单股正链RNA病毒，可以引起公猪睾丸炎和母猪流产，是一种人畜共患病病毒，蚊子叮咬带毒猪后可将病毒传播给人。JEV主要蛋白有核心蛋白C，膜蛋白PrM/M和囊膜蛋白E，以及（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）七个非结构蛋白。NS2A基因在翻译过程中会因为核糖体-1移码产生衍生物，与NS1蛋白C端融合，产生NS1’蛋白。JEV致弱株SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G变为A，无法形成核糖体移码所需的结构，因此失去了产生NS1’的能力。理论上NS1’抗体是JEV野毒感染的特征指标。本实验选取NS1`序列上3个片段分别进行原核表达，用Western-blot方法与6株JEV单克隆抗体反应，鉴定其抗原表位，并用该表位表达的融合蛋白作为抗原，与野毒感染的3份猪阳性血清和3份小鼠阳性进行ELISA检测。检测发现6株单抗均与该表位反应，且该表位可与野毒感染的阳性血清反应，该结果表明R1片段为NS1`蛋白中的免疫优势决定区，对后期亚单位疫苗的制备有着借鉴的作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:乙型脑炎病毒;NS1`；原核表达；Western-blot；间接ELISA;
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）3
1．材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1重组质粒构建5
1.2.2链接产物转化6
1.2.3重组质粒小量诱导表达7
1.2.4 Western-blot方法定位NS1`抗原表位7
1.2.5重组质粒6p-1-R1蛋白的大量诱导及纯化8
1.2.6 ElISA方法建立8
2.结果与分析9
2．1 PCR产物回收鉴定结果9
2.2 酶切产物回收鉴定结果9
2.3 转化后质粒测序结果10
2.4 Western-blot结果10
2.5重组质粒PGEX-6p-1-R1小量诱导鉴定结果11
2.6蛋白纯化鉴定结果11
2.7 ELISA结果12
3讨论 13
致谢14
参考文献14
乙型脑炎病毒NS1`蛋白单克隆抗体识别抗
原表位的鉴定
引言
流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起，主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患虫媒病毒性疾病。[1]人感染后死亡率高，常留有神经-精神后遗症。流行性乙型脑炎由蚊虫传播，对猪可引起繁殖障碍，猪患流行性乙型脑炎后主要表现为怀孕母猪流产、产死胎、弱仔,公猪表现为睾丸炎,少数仔猪呈神经症状,给养猪业造 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
成了巨大的经济损失[6]，同时，猪也是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。我国农业部1999年将猪流行性乙型脑炎归为二类动物疫病。
JEV在外界环境中的抵抗力不强，碘酊、来苏尔、甲醛等常用消毒药都具有迅速灭活作用。对热抵抗力弱，在56℃，30min或100℃，2min可被灭活，在-20℃可保存一年，可降低毒价，故一般在-70℃条件下保存毒株。若将感染病毒的脑组织加入50%甘油缓冲盐水中贮存在4℃，其病毒活力可维持数月。病毒的存活时间与稀释剂的种类和稀释程度有很大的关系，病毒的稀释度越高，病毒死亡越快。
JEV属黄病毒科黄病毒属其基因组为单股、正链RNA分子。其长度约为11kb,从 5`端96位ATG起始,至3`端10393位终止,仅形成1个长约10.3kb的开放读码框架(ORF),编码1个长为3432个氨基酸残基的蛋白前体。在宿主细胞内蛋白酶和病毒蛋白酶的切割下,它产生3种结构蛋白(c蛋白、PrM/M7和E蛋白),以及7种非结构蛋NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。[2-3]
ＮＳ1蛋白免疫动物能抵抗病毒的攻击,但比Ｅ蛋白诱导的保护力低。ＮＳ1是糖基化蛋白,是乙脑病毒的保护性抗原。ＮＳ1蛋白为可溶性补体固定抗原,主要通过补体介导的细胞融合而获得中和病毒的能力。我国目前广泛使用乙型脑炎弱毒疫苗预防猪的乙型脑炎,ＮＳ1是乙脑病毒的非结构蛋白,因此,在病毒复制时期可以通过ＮＳ1有效检测抗体。Mason等(]989)用E.eoli来表达JEV抗原,证实在JEV感染的细胞中NS1蛋白以NSI和NSI2种形式存在,NSI和NSI在N末端具有相同的序列,N引在C末端还存在一段高度疏水的氨基酸序列,该段序列由基因组的NS2A基因编码。[4] NS2A基因在翻译过程中会因为核糖体-1移码产生衍生物，与NS1蛋白C端融合，产生NS1’蛋白。JEV致弱株SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G变为A，无法形成核糖体移码所需的结构，因此失去了产生NS1’的能力。理论上NS1’抗体是JEV野毒感染的特征指标。
实验室的前期研究将JEV DNS1`单克隆抗体（2E10、3B2、4G9、5E6等）识别表位初步定位在10GHPGGPSQEVDGQID23。本研究的目的是进一步精细定位单抗识别的抗原表位。”。
1 材料与方法
1．1 材料
本次毕业设计所用材料均由农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室提供。
1．1．1 实验材料
PGEX-6p-1原核表达载体
DH5α大肠杆菌
猪乙型脑炎病毒NS1`单克隆抗体6株
猪乙脑病毒阳性血清及阴性血清各3份
鼠乙脑病毒阳性血清及阴性血清各3份
1．1．2主要试剂与工具酶
TaKaRa LA TaqTM, pMD18-T simple载体试剂盒、M-MLV反转录酶、蛋白质分子量标准（低）、PrimeScript? RT Marster Mix(Perfect RealTime), SYBR? Premix Ex Taq?II等均购自TaKaRa(大连)公司；
BstBⅠ, XhoⅠ限制性内切酶 (New England Biolabs, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
NEB, 英国)；
孔径0.45μm的NC膜（南京鼎国生物技术有限公司，中国）；
Gene ray公司质粒DNA小量制备试剂盒
Gene ray公司Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；
封闭蛋白干粉（武汉博士德生物工程有限公司，中国）
预染蛋白质分子量标准（Fermentas，立陶宛）；
羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz, 美国）；
DAPI染色液（碧云天生物技术研究所，中国）；
West Pico化学发光试剂盒（Thermo scientific, 德国）；
LB液体培养基
LB固体培养基（氨苄抗性）
1．1．3 主要仪器设备
PCR仪(TAKARA, 日本)
恒温培养摇床（江苏太仓华利达实验设备有限公司，中国）
HH一60型快速恒温循环水浴锅（重庆科学仪器厂，中国）
生物洁净工作台BCM-1000A（苏州安泰空气技术有限公司，中国）
NS1`-F：GCTGACAATGTTCGAAGATC BstBI
GHPGGPSQE
NS1`-R1-9A：5`-CAGCTCGAGCTCTTGCGAAGGACCTCCTGGGTGGCCGAATTCCGGGGATC-3` Xho I
GGPSQEVDGQID
NS1`-R2-12A: 5`-GATCTCGAGGTCAATCTGGCCGTCCACCTCTTGCGAAGGACCTCCGAATTCCGGGGATC-3`
摘要：日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种单股正链RNA病毒，可以引起公猪睾丸炎和母猪流产，是一种人畜共患病病毒，蚊子叮咬带毒猪后可将病毒传播给人。JEV主要蛋白有核心蛋白C，膜蛋白PrM/M和囊膜蛋白E，以及（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）七个非结构蛋白。NS2A基因在翻译过程中会因为核糖体-1移码产生衍生物，与NS1蛋白C端融合，产生NS1’蛋白。JEV致弱株SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G变为A，无法形成核糖体移码所需的结构，因此失去了产生NS1’的能力。理论上NS1’抗体是JEV野毒感染的特征指标。本实验选取NS1`序列上3个片段分别进行原核表达，用Western-blot方法与6株JEV单克隆抗体反应，鉴定其抗原表位，并用该表位表达的融合蛋白作为抗原，与野毒感染的3份猪阳性血清和3份小鼠阳性进行ELISA检测。检测发现6株单抗均与该表位反应，且该表位可与野毒感染的阳性血清反应，该结果表明R1片段为NS1`蛋白中的免疫优势决定区，对后期亚单位疫苗的制备有着借鉴的作用。
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关键字:乙型脑炎病毒;NS1`；原核表达；Western-blot；间接ELISA;
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）3
1．材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1重组质粒构建5
1.2.2链接产物转化6
1.2.3重组质粒小量诱导表达7
1.2.4 Western-blot方法定位NS1`抗原表位7
1.2.5重组质粒6p-1-R1蛋白的大量诱导及纯化8
1.2.6 ElISA方法建立8
2.结果与分析9
2．1 PCR产物回收鉴定结果9
2.2 酶切产物回收鉴定结果9
2.3 转化后质粒测序结果10
2.4 Western-blot结果10
2.5重组质粒PGEX-6p-1-R1小量诱导鉴定结果11
2.6蛋白纯化鉴定结果11
2.7 ELISA结果12
3讨论 13
致谢14
参考文献14
乙型脑炎病毒NS1`蛋白单克隆抗体识别抗
原表位的鉴定
引言
流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起，主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患虫媒病毒性疾病。[1]人感染后死亡率高，常留有神经-精神后遗症。流行性乙型脑炎由蚊虫传播，对猪可引起繁殖障碍，猪患流行性乙型脑炎后主要表现为怀孕母猪流产、产死胎、弱仔,公猪表现为睾丸炎,少数仔猪呈神经症状,给养猪业造 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
成了巨大的经济损失[6]，同时，猪也是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。我国农业部1999年将猪流行性乙型脑炎归为二类动物疫病。
JEV在外界环境中的抵抗力不强，碘酊、来苏尔、甲醛等常用消毒药都具有迅速灭活作用。对热抵抗力弱，在56℃，30min或100℃，2min可被灭活，在-20℃可保存一年，可降低毒价，故一般在-70℃条件下保存毒株。若将感染病毒的脑组织加入50%甘油缓冲盐水中贮存在4℃，其病毒活力可维持数月。病毒的存活时间与稀释剂的种类和稀释程度有很大的关系，病毒的稀释度越高，病毒死亡越快。
JEV属黄病毒科黄病毒属其基因组为单股、正链RNA分子。其长度约为11kb,从 5`端96位ATG起始,至3`端10393位终止,仅形成1个长约10.3kb的开放读码框架(ORF),编码1个长为3432个氨基酸残基的蛋白前体。在宿主细胞内蛋白酶和病毒蛋白酶的切割下,它产生3种结构蛋白(c蛋白、PrM/M7和E蛋白),以及7种非结构蛋NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。[2-3]
ＮＳ1蛋白免疫动物能抵抗病毒的攻击,但比Ｅ蛋白诱导的保护力低。ＮＳ1是糖基化蛋白,是乙脑病毒的保护性抗原。ＮＳ1蛋白为可溶性补体固定抗原,主要通过补体介导的细胞融合而获得中和病毒的能力。我国目前广泛使用乙型脑炎弱毒疫苗预防猪的乙型脑炎,ＮＳ1是乙脑病毒的非结构蛋白,因此,在病毒复制时期可以通过ＮＳ1有效检测抗体。Mason等(]989)用E.eoli来表达JEV抗原,证实在JEV感染的细胞中NS1蛋白以NSI和NSI2种形式存在,NSI和NSI在N末端具有相同的序列,N引在C末端还存在一段高度疏水的氨基酸序列,该段序列由基因组的NS2A基因编码。[4] NS2A基因在翻译过程中会因为核糖体-1移码产生衍生物，与NS1蛋白C端融合，产生NS1’蛋白。JEV致弱株SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G变为A，无法形成核糖体移码所需的结构，因此失去了产生NS1’的能力。理论上NS1’抗体是JEV野毒感染的特征指标。
实验室的前期研究将JEV DNS1`单克隆抗体（2E10、3B2、4G9、5E6等）识别表位初步定位在10GHPGGPSQEVDGQID23。本研究的目的是进一步精细定位单抗识别的抗原表位。”。
1 材料与方法
1．1 材料
本次毕业设计所用材料均由农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室提供。
1．1．1 实验材料
PGEX-6p-1原核表达载体
DH5α大肠杆菌
猪乙型脑炎病毒NS1`单克隆抗体6株
猪乙脑病毒阳性血清及阴性血清各3份
鼠乙脑病毒阳性血清及阴性血清各3份
1．1．2主要试剂与工具酶
TaKaRa LA TaqTM, pMD18-T simple载体试剂盒、M-MLV反转录酶、蛋白质分子量标准（低）、PrimeScript? RT Marster Mix(Perfect RealTime), SYBR? Premix Ex Taq?II等均购自TaKaRa(大连)公司；
BstBⅠ, XhoⅠ限制性内切酶 (New England Biolabs, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
NEB, 英国)；
孔径0.45μm的NC膜（南京鼎国生物技术有限公司，中国）；
Gene ray公司质粒DNA小量制备试剂盒
Gene ray公司Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；
封闭蛋白干粉（武汉博士德生物工程有限公司，中国）
预染蛋白质分子量标准（Fermentas，立陶宛）；
羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz, 美国）；
DAPI染色液（碧云天生物技术研究所，中国）；
West Pico化学发光试剂盒（Thermo scientific, 德国）；
LB液体培养基
LB固体培养基（氨苄抗性）
1．1．3 主要仪器设备
PCR仪(TAKARA, 日本)
恒温培养摇床（江苏太仓华利达实验设备有限公司，中国）
HH一60型快速恒温循环水浴锅（重庆科学仪器厂，中国）
生物洁净工作台BCM-1000A（苏州安泰空气技术有限公司，中国）
NS1`-F：GCTGACAATGTTCGAAGATC BstBI
GHPGGPSQE
NS1`-R1-9A：5`-CAGCTCGAGCTCTTGCGAAGGACCTCCTGGGTGGCCGAATTCCGGGGATC-3` Xho I
GGPSQEVDGQID
NS1`-R2-12A: 5`-GATCTCGAGGTCAATCTGGCCGTCCACCTCTTGCGAAGGACCTCCGAATTCCGGGGATC-3`
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