4个热应激奶牛血清差异表达miRNA的验证
4个热应激奶牛血清差异表达miRNA的验证[20200510205650]
摘要：【目的】通过分析热应激荷斯坦奶牛和正常荷斯坦奶牛血清中差异表达miRNAs，验证经由高通量测序筛选出的4个miRNA是否与奶牛热应激相关，以期为提前预防奶牛热应激做好防范措施，同时在分子水平调控奶牛热应激反应奠定理论基础。【方法】通过高通量测序技术对血清中差异表达的miRNA进行测序筛选，荧光定量（RT-qPCR）验证高通量结果。【结果】高通量测序筛选出差异表达miRNA共52个，本研究所选择4个miRNA在两种血清中差异表达显著，且分析发现这4个miRNA与热应激密切相关。【结论】miRNA通过多种途径调控应激以及免疫反应，这也预示了其功能的多样性与复杂性。本研究所筛选出的4个miRNA可以作为有力的理论基础，以用于miRNA调控对奶牛热应激发生的调控机制的深入研究。
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关键字:热应激；荷斯坦奶牛；miRNAs；靶基因
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1．1 主要试剂与材料 2
1．2 方法 2
1．2．1 总RNA提取及质量鉴定 2
1．2．2 miRNA高通量测序试验 2
1．2．3 Real time quantitative PCR（RT-qPCR）验证 2
2 结果与分析 3
2．1 总RNA的质量 3
2．2 高通量测序结果 3
2．3 RT-qPCR 验证结果 3
3 讨论 4
3．1 热应激对奶牛的影响 4
3．2 miRNA功能的研究进展 4
3．3 热应激奶牛血清差异表达miRNA的结果分析 5
4 结论 5
致谢 5
参考文献： 6
4个热应激奶牛血清差异表达miRNA的验证
引言
引言
畜牧生产中，奶牛对外界环境温度有极明显的反应，荷斯坦牛要求最适宜的外界温度为10- 16℃[1]，高于或低于这个临界温度，生理上将发生一系列变化。夏季高温的条件下，我国大部分的养殖场均采取人工措施来对奶牛进行防暑降温工作，但很难使奶牛完全适应环境，从而影响着奶牛的生产生殖等方面。因而对于热应激对荷斯坦奶牛产奶量、乳品质、生理指标、采食量、消化率、血液激素水平、繁殖性能方面的研究成为近年来的研究热点。
自第一个miRNA lin-4由线虫中发现至今，对miRNA的生物学已有比较系统的研究。MicroRNA(m *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
iRNA)为19～22个核苷酸（nt），对基因表达进行转录后调控的非编码小RNA[2]。随着国内外对miRNA不断的探索，逐步证明miRNA参与动物细胞的增殖、分化、凋亡和应激反应等许多生命过程。但有关热应激对奶牛血清中差异表达的所有miRNA尚无确定。本课题的意义在于寻找出标志奶牛发生热应激的重要标志物，进而将筛选出的miRNA作为奶牛热应激的重要标志因子，以助于对奶牛发生热应激之前做好更加充分的防御工作。
本研究以热应激奶牛血清和正常奶牛血清为试验材料，采用高通量测序技术筛选出两种不同血清中差异表达miRNA，选择4个在热应激血清中差异表达显著的miRNAs进一步验证。通过数据对比和功能分析，筛选出可能对热应激起重要调控作用的miRNAs。通过分析热应激荷斯坦奶牛和正常荷斯坦奶牛血清中差异表达miRNAs，验证经由高通量测序筛选出的4个miRNA是否与奶牛热应激相关，以期为提前预防奶牛热应激做好防范措施，同时在分子水平调控奶牛热应激反应奠定理论基础。
1 材料与方法
1．1 主要试剂与材料
试验所用动物为6头成年荷斯坦奶牛（南京西岗奶牛场）。正常奶牛血液样本采集于4月常温天气，热应激奶牛血液样本采集于7月高温天气。采用尾静脉采血方法，分别在4月抽取正常奶牛血液和7月抽取热应激奶牛血液（跟踪采血，两次采血为同样的6头奶牛），20 min 内采集完毕，并迅速离心收集血清，血清保存于-80℃。Trizol购自Invitrogen公司；One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Ki（TaKaRa）、SYBR Premix Ex Taq TM II（TaKaRa）、ABI 7300 Real-Time PCR；ND-1000紫外分光光度计（NanoDrop）；高通量测序由LC science 公司提供技术服务。本研究所有试验均于2013年3月到2014年12 月在大学动物科技学院实验中心完成。（其中高通量测序由联川生物技术有限公司完成）。
1．2 方法
1．2．1 总RNA提取及质量鉴定 用Trizol试剂盒进行热应激奶牛血清和正常奶牛血清总RNA抽提，总RNA完整性由1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测定光密度，计算D260/280（代表RNA的浓度）和D260/230（代表RNA的纯度）。分别将6头热应激奶牛和6头正常奶牛血清总RNA进行混合，混合后的样品用于以下试验，试验重复3次。
1．2．2 miRNA高通量测序试验 试验由LC Sciences公司进行。10 μg总RNA混合样品经过基因组测序分析仪GA-I （Illumina公司，美国）。15％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化分离出10-40个核苷酸的长度的RNA。连接5 和3接头后进一步纯化，合成第一链和第二链cDNA。原始序列首先通过基因组测序分析仪处理，过滤掉接头序列，低质量和低拷贝序列，然后将提取的长度在15-26个核苷酸序列的小分子RNA过滤掉mRNA，tRNA，sRNA。最后，将剩下的序列与miRBase 20.0数据库进行了比较，以确定是否是牛这一物种中保守的miRNA。基础数据统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计测定的序列（Reads）长度、序列数量。根据序列数量分析比较两 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
个样本中差异表达的miRNAs，对不同样本中miRNA表达谱进行分析。
1．2．3 Real time quantitative PCR（RT-qPCR）验证 采用SYBR green法检测成熟miRNA的表达水平。miRNA引物由特异性引物及通用引物构成，其中miRNA特异性引物由南京鼎国生物技术有限公司合成（表1），通用引物为One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)自带。选用bta-5sRNA 作为内参，采用2-△△Ct法计算血清中miRNA相对表达量。miRNA逆转录采用One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit。在PCR管中加入2 μL 10×miRNA Reaction Buffer，2 μL 0.1% BSA，2 μL miRNA PrimeScript?RT Enzyme Mix，2 μL总RNA (10 pg?μL-1—1 μg?μL-1), 用RNase-Free dH2O补充至体积20 μL。逆转录反应：37℃60 min，85℃5 s。产物-20℃保存。利用ABI 7300 Real-Time PCR仪进行PCR反应, 试剂盒采用SYBR Premix Ex TaqTMII（Takara）。反应体系: 10 μL 2×SYBR?Premix Ex Taq?，0.8 μL PCR 上游引物，0.8 μL通用下游引物，0.4 μL 50×ROX Reference Dye，2 μL cDNA, 补充dH2O至20 μL。反应条件: 95 ℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，共40个循环。
图1：总RNA提取琼脂糖凝胶电泳结果
2．2 高通量测序结果
测序试验后对所测得序列进行归一化分析，经过筛选，将核苷酸序列在16-28nt的小RNA与牛miRNA数据库进行对比，测序分析结果提供了血清中有486个与牛已知miRNA序列完全匹配的表达谱。对测序结果的数据分析表明：在热应激奶牛和正常奶牛血清中均有不同程度的表达，其中有52个miRNA在血清中表达差异显著（P<0.001）。在这52个差异表达的miRNAs中，有22个miRNAs在正常奶牛血清中高表达，有30个miRNAs在热应激血清中高表达，其中差异表达情况是miR-19a、miR-19b、miR-1246在热应激血清中分别上调4.07倍、6.79倍、3.00倍，miR-181a下调3.49倍（表2）。
摘要：【目的】通过分析热应激荷斯坦奶牛和正常荷斯坦奶牛血清中差异表达miRNAs，验证经由高通量测序筛选出的4个miRNA是否与奶牛热应激相关，以期为提前预防奶牛热应激做好防范措施，同时在分子水平调控奶牛热应激反应奠定理论基础。【方法】通过高通量测序技术对血清中差异表达的miRNA进行测序筛选，荧光定量（RT-qPCR）验证高通量结果。【结果】高通量测序筛选出差异表达miRNA共52个，本研究所选择4个miRNA在两种血清中差异表达显著，且分析发现这4个miRNA与热应激密切相关。【结论】miRNA通过多种途径调控应激以及免疫反应，这也预示了其功能的多样性与复杂性。本研究所筛选出的4个miRNA可以作为有力的理论基础，以用于miRNA调控对奶牛热应激发生的调控机制的深入研究。
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关键字:热应激；荷斯坦奶牛；miRNAs；靶基因
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1．1 主要试剂与材料 2
1．2 方法 2
1．2．1 总RNA提取及质量鉴定 2
1．2．2 miRNA高通量测序试验 2
1．2．3 Real time quantitative PCR（RT-qPCR）验证 2
2 结果与分析 3
2．1 总RNA的质量 3
2．2 高通量测序结果 3
2．3 RT-qPCR 验证结果 3
3 讨论 4
3．1 热应激对奶牛的影响 4
3．2 miRNA功能的研究进展 4
3．3 热应激奶牛血清差异表达miRNA的结果分析 5
4 结论 5
致谢 5
参考文献： 6
4个热应激奶牛血清差异表达miRNA的验证
引言
引言
畜牧生产中，奶牛对外界环境温度有极明显的反应，荷斯坦牛要求最适宜的外界温度为10- 16℃[1]，高于或低于这个临界温度，生理上将发生一系列变化。夏季高温的条件下，我国大部分的养殖场均采取人工措施来对奶牛进行防暑降温工作，但很难使奶牛完全适应环境，从而影响着奶牛的生产生殖等方面。因而对于热应激对荷斯坦奶牛产奶量、乳品质、生理指标、采食量、消化率、血液激素水平、繁殖性能方面的研究成为近年来的研究热点。
自第一个miRNA lin-4由线虫中发现至今，对miRNA的生物学已有比较系统的研究。MicroRNA(m *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
iRNA)为19～22个核苷酸（nt），对基因表达进行转录后调控的非编码小RNA[2]。随着国内外对miRNA不断的探索，逐步证明miRNA参与动物细胞的增殖、分化、凋亡和应激反应等许多生命过程。但有关热应激对奶牛血清中差异表达的所有miRNA尚无确定。本课题的意义在于寻找出标志奶牛发生热应激的重要标志物，进而将筛选出的miRNA作为奶牛热应激的重要标志因子，以助于对奶牛发生热应激之前做好更加充分的防御工作。
本研究以热应激奶牛血清和正常奶牛血清为试验材料，采用高通量测序技术筛选出两种不同血清中差异表达miRNA，选择4个在热应激血清中差异表达显著的miRNAs进一步验证。通过数据对比和功能分析，筛选出可能对热应激起重要调控作用的miRNAs。通过分析热应激荷斯坦奶牛和正常荷斯坦奶牛血清中差异表达miRNAs，验证经由高通量测序筛选出的4个miRNA是否与奶牛热应激相关，以期为提前预防奶牛热应激做好防范措施，同时在分子水平调控奶牛热应激反应奠定理论基础。
1 材料与方法
1．1 主要试剂与材料
试验所用动物为6头成年荷斯坦奶牛（南京西岗奶牛场）。正常奶牛血液样本采集于4月常温天气，热应激奶牛血液样本采集于7月高温天气。采用尾静脉采血方法，分别在4月抽取正常奶牛血液和7月抽取热应激奶牛血液（跟踪采血，两次采血为同样的6头奶牛），20 min 内采集完毕，并迅速离心收集血清，血清保存于-80℃。Trizol购自Invitrogen公司；One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Ki（TaKaRa）、SYBR Premix Ex Taq TM II（TaKaRa）、ABI 7300 Real-Time PCR；ND-1000紫外分光光度计（NanoDrop）；高通量测序由LC science 公司提供技术服务。本研究所有试验均于2013年3月到2014年12 月在大学动物科技学院实验中心完成。（其中高通量测序由联川生物技术有限公司完成）。
1．2 方法
1．2．1 总RNA提取及质量鉴定 用Trizol试剂盒进行热应激奶牛血清和正常奶牛血清总RNA抽提，总RNA完整性由1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测定光密度，计算D260/280（代表RNA的浓度）和D260/230（代表RNA的纯度）。分别将6头热应激奶牛和6头正常奶牛血清总RNA进行混合，混合后的样品用于以下试验，试验重复3次。
1．2．2 miRNA高通量测序试验 试验由LC Sciences公司进行。10 μg总RNA混合样品经过基因组测序分析仪GA-I （Illumina公司，美国）。15％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化分离出10-40个核苷酸的长度的RNA。连接5 和3接头后进一步纯化，合成第一链和第二链cDNA。原始序列首先通过基因组测序分析仪处理，过滤掉接头序列，低质量和低拷贝序列，然后将提取的长度在15-26个核苷酸序列的小分子RNA过滤掉mRNA，tRNA，sRNA。最后，将剩下的序列与miRBase 20.0数据库进行了比较，以确定是否是牛这一物种中保守的miRNA。基础数据统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计测定的序列（Reads）长度、序列数量。根据序列数量分析比较两 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
个样本中差异表达的miRNAs，对不同样本中miRNA表达谱进行分析。
1．2．3 Real time quantitative PCR（RT-qPCR）验证 采用SYBR green法检测成熟miRNA的表达水平。miRNA引物由特异性引物及通用引物构成，其中miRNA特异性引物由南京鼎国生物技术有限公司合成（表1），通用引物为One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)自带。选用bta-5sRNA 作为内参，采用2-△△Ct法计算血清中miRNA相对表达量。miRNA逆转录采用One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit。在PCR管中加入2 μL 10×miRNA Reaction Buffer，2 μL 0.1% BSA，2 μL miRNA PrimeScript?RT Enzyme Mix，2 μL总RNA (10 pg?μL-1—1 μg?μL-1), 用RNase-Free dH2O补充至体积20 μL。逆转录反应：37℃60 min，85℃5 s。产物-20℃保存。利用ABI 7300 Real-Time PCR仪进行PCR反应, 试剂盒采用SYBR Premix Ex TaqTMII（Takara）。反应体系: 10 μL 2×SYBR?Premix Ex Taq?，0.8 μL PCR 上游引物，0.8 μL通用下游引物，0.4 μL 50×ROX Reference Dye，2 μL cDNA, 补充dH2O至20 μL。反应条件: 95 ℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，共40个循环。
图1：总RNA提取琼脂糖凝胶电泳结果
2．2 高通量测序结果
测序试验后对所测得序列进行归一化分析，经过筛选，将核苷酸序列在16-28nt的小RNA与牛miRNA数据库进行对比，测序分析结果提供了血清中有486个与牛已知miRNA序列完全匹配的表达谱。对测序结果的数据分析表明：在热应激奶牛和正常奶牛血清中均有不同程度的表达，其中有52个miRNA在血清中表达差异显著（P<0.001）。在这52个差异表达的miRNAs中，有22个miRNAs在正常奶牛血清中高表达，有30个miRNAs在热应激血清中高表达，其中差异表达情况是miR-19a、miR-19b、miR-1246在热应激血清中分别上调4.07倍、6.79倍、3.00倍，miR-181a下调3.49倍（表2）。
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