假孕大鼠黄体退化过程中ATF3的表达研究
假孕大鼠黄体退化过程中ATF3的表达研究[20200510204750]
摘要：【目的】研究转录激活因子ATF3在假孕SD大鼠经由PGF诱导的黄体退化过程中的表达定位。【方法】联合应用PMSG和hCG诱导假孕大鼠黄体模型，以PGF处理不同时间以诱导黄体退化，免疫组织化学检测ATF3的表达模式。【结果】ATF3蛋白主要表达于大、小黄体细胞的细胞核中，而在其余黄体细胞中不则发生表达，且PGF处理使表达水平上升到一定程度后开始下降。【结论】PGF能够诱导假孕SD大鼠黄体退化过程中ATF3蛋白的表达，为黄体溶解机制的研究提供试验依据。
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关键字:黄体退化；PGF；ATF3
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料 2
1．1．1 试验动物 2
1．1．2 试验试剂 2
1．1．3 试验器材 2
1．2 试验方法 2
1．2．1 假孕大鼠模型诱导 2
1．2．2 样品处理 3
1．2．3 HE染色 3
1．2．4 免疫组织化学 3
2 结果与分析 4
2．1 假孕大鼠黄体的组织学形态结构 4
2．2 3-βHSD免疫组化技术检测结果 5
2．3 ATF3 免疫组化技术检测结果 5
3 讨论 6
3．1 大鼠黄体的结构与概述 6
3．2 PGF处理诱导ATF3在大、小黄体中的表达 6
3．3 PGF处理诱导ATF3在细胞核中表达 7
3．4 ATF3的表达水平在峰值后发生下降 7
4 结论 7
致谢 7
参考文献 8
假孕大鼠黄体退化过程中ATF3的表达研究
引言
黄体是哺乳动物卵巢内暂时性的内泌器官，主要功能是分泌支持胚泡着床并维持妊娠的类固醇激素孕酮。它是由卵泡成熟破裂排出卵子后，剩余的卵泡细胞转变而成的含有黄色颗粒的细胞群体[1]。在排卵前促黄体激素峰的作用下，颗粒细胞和膜细胞发生一系列由基因调控引起的黄体化过程，即两种细胞分别转变为大黄体细胞（LLC）和小黄体细胞（SLC），两者的形 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
态差异较大。黄体的主要功能是分泌孕酮，其来源为大、小黄体细胞。合成类固醇激素的黄体细胞是黄体实质的主要部分，约占90%体积，其余是10%的支持细胞。支持细胞包括血管成分、巨噬细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等[2,3]。黄体的形成与退化具有周期性，在卵正常受精时，黄体分泌的孕酮参与到受精卵着床和妊娠维持的调节。而在卵未被受精时，黄体必须正常退化以为下一轮生殖周期做准备[4]。黄体退化即黄体发生功能与形态上的退化，包括孕酮分泌的下降和黄体体积的缩小[5]。
前列腺素PGF作为哺乳动物主要的溶黄因子，与多种因子共同作用，导致大鼠黄体的退化过程。此外，肿瘤坏死因子、干扰素、金属蛋白酶、单核细胞趋化蛋白、Fas抗原等多种因子也都起精确调节这一过程的作用，使黄体发生功能性和结构性退化。PGF能引起黄体中数条信号通路的激活，并最终引起黄体细胞中包括Fos、Jun、ERK1/2和ATF3等在内的多种基因表达模式的改变[6]。
ATF3作为转录激活因子ATF/CERB家族成员之一，最初是从HeLa细胞中分离出来的[7]，在细胞的分化、凋亡、代谢等方面起到重要作用。ATF3可以抑制或激活众多与代谢、分化和凋亡等过程相关的基因发生表达，影响哺乳动物的神经、生殖等系统的生理过程。ATF3基因的分子量为21kD，含4有个外显子，编码含181个氨基酸的蛋白质，是含亮氨酸拉链基序结构的转录因子。ATF3基因的启动子中有多个转录因子结合位点，包括诱导位点ATF/CRE、AP1和NF-JB等，还有与细胞周期调节相关位点包括Myc/Max和E2F等[8]。ATF3是一种应激反应基因，参与细胞自身对细胞内外环境变化的适应过程，激活信号转导受体或抑制基因的表达。ATF3能与多种包括c-JUN在内的转录因子互相作用生成复合体，并激活多种基因[9]。ATF3一般经由转录水平调控，在不同细胞中的效应显著不同[10]。ATF3不仅在调控免疫反应、控制癌症、诱导细胞凋亡[11]中起到重要作用，亦与神经损伤后的修复密切相关[12]。
Mondal[13]等人发现PGF能诱导母牛黄体中ATF3蛋白的表达增加，这一发现提示了ATF3可能与黄体溶解过程有关。本实验将探寻PGF诱导黄体细胞发生退化这一过程中ATF3作用机制。研究将联合应用PMSG和hcG诱导假孕大鼠模型，以PGF处理不同的时间长度以诱导黄体发生退化。利用免疫组织化学技术检测ATF3的表达模式，为一些卵巢疾病的临床治疗提供重要的理论基础，对丰富哺乳动物生殖生物学内容具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物 清洁型健康28日龄雌性SD大鼠35只，购自南京栖霞利民科研动物养殖场。
1．1．2 试验试剂 注射用血促性素（宁波第二激素厂）、注射用绒促性素（宁波第二激素厂）、氯前列烯醇（丹东绿丹和华动药有限公司）、甲醛（南京寿德药剂有限公司）、无水乙醇（南京寿德药剂有限公司）、二甲苯（南京寿德药剂有限公司）、甲醇（南京寿德药剂有限公司）、石蜡（国药集团化学试剂有限公司）、苏木精（南京建成科技有限公司）、伊红Y（天津市科密欧化学试剂开发中心）、中性树胶（中国上海标本模型厂）、ATF3克隆抗体（Santa Cruz生物公司, 美国)，类固醇脱氢酶3βHSD克隆抗体（Santa Cruz生物公司, 美国), *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
二抗(辣根酶标记羊抗兔IgG)、二氨基联苯胺DAB显色试剂盒（北京中山生物技术公司）、生理盐水、柠檬酸三钠缓冲液、1%伊红染液 PBS 1%牛血清白蛋白溶液、正常羊血清、专用抗体稀释液、其他免疫组织化学与HE染色相关试剂。
1．1．3 试验器材 切片机（LEICA RM2235型）、KD-P摊片机及KD-H烘片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）、光学显微镜（SZX12，OLYMPUS）、DZF-6020型真空干燥箱（上海新苖医疗器械制造有限公司）、电子天平（型号ALC-1100.2、出产厂家赛多利斯）、通风橱、载玻片（26×76mm，1mm~1.2mm）、盖玻片（18×18mm，0.13~0.17mm）、眼科剪、镊子、注射器、广口瓶、烧杯、量筒、酒精灯、试管架、染色缸、染色架（30齿格）、定时器、切片盒（50片装）。
1．2 试验方法
1．2．1 假孕大鼠模型诱导
对28日龄SD大鼠注射25IU注射用血促性素(PMSG) ，48h后注射25IU的注射用绒促性素(hCG)（D0）建立假孕模型，D7实验组注射0.3ml PGF类似物氯前列烯醇，分别在10min、30min、1h、2h、4h采血并麻醉处死大鼠，对照组(0h)注射相同剂量的生理盐水。收集卵巢黄体，剪掉系膜和脂肪组织并置于4%多聚甲醛中固定24h。
1．2．2 样品处理
（1）脱水 70%乙醇 1 h→ 85%乙醇 1 h →95%乙醇 1 h →100%乙醇Ⅰ 30 min→100%乙醇Ⅱ，过夜→100%乙醇Ⅲ 30 min
（2）透明 50%乙醇+50%二甲苯混合液 30 min→二甲苯Ⅰ30 min→二甲苯Ⅱ 40 min
（3）透蜡 50%二甲苯+50%石蜡混合液 30 min→石蜡Ⅰ，真空过夜→石蜡Ⅱ 1 h
（4）包埋 将预先融化好的石蜡注入金属框，待底面石蜡稍微凝固时，用温镊子夹取卵巢组织块放入金属框的中央，待稍凝，放入预备好的标签纸，然后将金属框快速全部浸入冰水中，待石蜡全部变硬后即取出，剥出蜡块。
摘要：【目的】研究转录激活因子ATF3在假孕SD大鼠经由PGF诱导的黄体退化过程中的表达定位。【方法】联合应用PMSG和hCG诱导假孕大鼠黄体模型，以PGF处理不同时间以诱导黄体退化，免疫组织化学检测ATF3的表达模式。【结果】ATF3蛋白主要表达于大、小黄体细胞的细胞核中，而在其余黄体细胞中不则发生表达，且PGF处理使表达水平上升到一定程度后开始下降。【结论】PGF能够诱导假孕SD大鼠黄体退化过程中ATF3蛋白的表达，为黄体溶解机制的研究提供试验依据。
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关键字:黄体退化；PGF；ATF3
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料 2
1．1．1 试验动物 2
1．1．2 试验试剂 2
1．1．3 试验器材 2
1．2 试验方法 2
1．2．1 假孕大鼠模型诱导 2
1．2．2 样品处理 3
1．2．3 HE染色 3
1．2．4 免疫组织化学 3
2 结果与分析 4
2．1 假孕大鼠黄体的组织学形态结构 4
2．2 3-βHSD免疫组化技术检测结果 5
2．3 ATF3 免疫组化技术检测结果 5
3 讨论 6
3．1 大鼠黄体的结构与概述 6
3．2 PGF处理诱导ATF3在大、小黄体中的表达 6
3．3 PGF处理诱导ATF3在细胞核中表达 7
3．4 ATF3的表达水平在峰值后发生下降 7
4 结论 7
致谢 7
参考文献 8
假孕大鼠黄体退化过程中ATF3的表达研究
引言
黄体是哺乳动物卵巢内暂时性的内泌器官，主要功能是分泌支持胚泡着床并维持妊娠的类固醇激素孕酮。它是由卵泡成熟破裂排出卵子后，剩余的卵泡细胞转变而成的含有黄色颗粒的细胞群体[1]。在排卵前促黄体激素峰的作用下，颗粒细胞和膜细胞发生一系列由基因调控引起的黄体化过程，即两种细胞分别转变为大黄体细胞（LLC）和小黄体细胞（SLC），两者的形 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
态差异较大。黄体的主要功能是分泌孕酮，其来源为大、小黄体细胞。合成类固醇激素的黄体细胞是黄体实质的主要部分，约占90%体积，其余是10%的支持细胞。支持细胞包括血管成分、巨噬细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等[2,3]。黄体的形成与退化具有周期性，在卵正常受精时，黄体分泌的孕酮参与到受精卵着床和妊娠维持的调节。而在卵未被受精时，黄体必须正常退化以为下一轮生殖周期做准备[4]。黄体退化即黄体发生功能与形态上的退化，包括孕酮分泌的下降和黄体体积的缩小[5]。
前列腺素PGF作为哺乳动物主要的溶黄因子，与多种因子共同作用，导致大鼠黄体的退化过程。此外，肿瘤坏死因子、干扰素、金属蛋白酶、单核细胞趋化蛋白、Fas抗原等多种因子也都起精确调节这一过程的作用，使黄体发生功能性和结构性退化。PGF能引起黄体中数条信号通路的激活，并最终引起黄体细胞中包括Fos、Jun、ERK1/2和ATF3等在内的多种基因表达模式的改变[6]。
ATF3作为转录激活因子ATF/CERB家族成员之一，最初是从HeLa细胞中分离出来的[7]，在细胞的分化、凋亡、代谢等方面起到重要作用。ATF3可以抑制或激活众多与代谢、分化和凋亡等过程相关的基因发生表达，影响哺乳动物的神经、生殖等系统的生理过程。ATF3基因的分子量为21kD，含4有个外显子，编码含181个氨基酸的蛋白质，是含亮氨酸拉链基序结构的转录因子。ATF3基因的启动子中有多个转录因子结合位点，包括诱导位点ATF/CRE、AP1和NF-JB等，还有与细胞周期调节相关位点包括Myc/Max和E2F等[8]。ATF3是一种应激反应基因，参与细胞自身对细胞内外环境变化的适应过程，激活信号转导受体或抑制基因的表达。ATF3能与多种包括c-JUN在内的转录因子互相作用生成复合体，并激活多种基因[9]。ATF3一般经由转录水平调控，在不同细胞中的效应显著不同[10]。ATF3不仅在调控免疫反应、控制癌症、诱导细胞凋亡[11]中起到重要作用，亦与神经损伤后的修复密切相关[12]。
Mondal[13]等人发现PGF能诱导母牛黄体中ATF3蛋白的表达增加，这一发现提示了ATF3可能与黄体溶解过程有关。本实验将探寻PGF诱导黄体细胞发生退化这一过程中ATF3作用机制。研究将联合应用PMSG和hcG诱导假孕大鼠模型，以PGF处理不同的时间长度以诱导黄体发生退化。利用免疫组织化学技术检测ATF3的表达模式，为一些卵巢疾病的临床治疗提供重要的理论基础，对丰富哺乳动物生殖生物学内容具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物 清洁型健康28日龄雌性SD大鼠35只，购自南京栖霞利民科研动物养殖场。
1．1．2 试验试剂 注射用血促性素（宁波第二激素厂）、注射用绒促性素（宁波第二激素厂）、氯前列烯醇（丹东绿丹和华动药有限公司）、甲醛（南京寿德药剂有限公司）、无水乙醇（南京寿德药剂有限公司）、二甲苯（南京寿德药剂有限公司）、甲醇（南京寿德药剂有限公司）、石蜡（国药集团化学试剂有限公司）、苏木精（南京建成科技有限公司）、伊红Y（天津市科密欧化学试剂开发中心）、中性树胶（中国上海标本模型厂）、ATF3克隆抗体（Santa Cruz生物公司, 美国)，类固醇脱氢酶3βHSD克隆抗体（Santa Cruz生物公司, 美国), *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
二抗(辣根酶标记羊抗兔IgG)、二氨基联苯胺DAB显色试剂盒（北京中山生物技术公司）、生理盐水、柠檬酸三钠缓冲液、1%伊红染液 PBS 1%牛血清白蛋白溶液、正常羊血清、专用抗体稀释液、其他免疫组织化学与HE染色相关试剂。
1．1．3 试验器材 切片机（LEICA RM2235型）、KD-P摊片机及KD-H烘片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）、光学显微镜（SZX12，OLYMPUS）、DZF-6020型真空干燥箱（上海新苖医疗器械制造有限公司）、电子天平（型号ALC-1100.2、出产厂家赛多利斯）、通风橱、载玻片（26×76mm，1mm~1.2mm）、盖玻片（18×18mm，0.13~0.17mm）、眼科剪、镊子、注射器、广口瓶、烧杯、量筒、酒精灯、试管架、染色缸、染色架（30齿格）、定时器、切片盒（50片装）。
1．2 试验方法
1．2．1 假孕大鼠模型诱导
对28日龄SD大鼠注射25IU注射用血促性素(PMSG) ，48h后注射25IU的注射用绒促性素(hCG)（D0）建立假孕模型，D7实验组注射0.3ml PGF类似物氯前列烯醇，分别在10min、30min、1h、2h、4h采血并麻醉处死大鼠，对照组(0h)注射相同剂量的生理盐水。收集卵巢黄体，剪掉系膜和脂肪组织并置于4%多聚甲醛中固定24h。
1．2．2 样品处理
（1）脱水 70%乙醇 1 h→ 85%乙醇 1 h →95%乙醇 1 h →100%乙醇Ⅰ 30 min→100%乙醇Ⅱ，过夜→100%乙醇Ⅲ 30 min
（2）透明 50%乙醇+50%二甲苯混合液 30 min→二甲苯Ⅰ30 min→二甲苯Ⅱ 40 min
（3）透蜡 50%二甲苯+50%石蜡混合液 30 min→石蜡Ⅰ，真空过夜→石蜡Ⅱ 1 h
（4）包埋 将预先融化好的石蜡注入金属框，待底面石蜡稍微凝固时，用温镊子夹取卵巢组织块放入金属框的中央，待稍凝，放入预备好的标签纸，然后将金属框快速全部浸入冰水中，待石蜡全部变硬后即取出，剥出蜡块。
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