载锌沸石中锌的解吸规律及其对细菌作用的体外研究
载锌沸石中锌的解吸规律及其对细菌作用的体外研究[20200507190422]
摘要：本文通过体外模拟仔猪胃肠道内环境，分析不同条件下载锌沸石中的锌解吸规律及其对大肠细菌K88的作用，并测定其最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果表明，随着添加量的增加，载锌沸石中锌解吸率逐渐降低，并趋向稳定；随着时间延长，锌解吸率逐渐增加并在30min 时达到最大，之后趋向平稳；不同离子对载锌沸石中锌解吸率的提高程度为NH4+＞Na+。随着时间延长，载锌沸石对细菌吸附率先增加后降低，最后趋于稳定，且载锌沸石的吸附能力明显高于活化沸石；随着载锌沸石浓度的增加，细菌吸附率呈现先增加后平稳的趋势，并在5mg/mL时达到最大值。固相载锌沸石的MIC和MBC分别为3.19、7.8125mg/mL，液相载锌沸石的MIC和MBC分别为25、50mg/mL，说明固相载锌沸石的抑菌、杀菌能力明显强于液相载锌沸石。
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关键字:载锌沸石；体外解析；大肠杆菌K88；吸附规律
目录
摘要 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 主要原料与试剂 2
1.2 载锌沸石的制备 2
1.2.1 固相载锌沸石的制备 2
1.2.2 液相载锌沸石的制备 2
1.3 载锌沸石中锌离子解吸规律 2
1.3.1 不同载锌沸石浓度条件下锌离子解吸规律 2
1.3.2 不同时间条件下锌离子解吸规律 2
1.3.3 不同离子浓度条件下锌离子解吸规律 2
1.4 载锌沸石对大肠杆菌的抑制、吸附作用 2
1.4.1 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC） 3
1.4.2 不同时间载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 3
1.4.3 不同浓度载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 3
2 结果与分析 3
2.1 不同条件下锌离子的解吸规律 3
2.1.1 不同载锌沸石浓度条件下锌离子解吸规律 3
2.1.2 不同时间条件下锌离子解吸规律 4
2.1.3 不同离子浓度条件下锌离子解吸规律 5
2.2 载锌沸石对大肠杆菌的抑制、吸附作用 6
2.2.1 菌量与蛋白质量浓度的关系 6
2.2.2 载锌沸石的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC） 6
2.2.3 不同时间载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 7
2.2.4 不同浓度载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 7
3 讨论 7
3.1 不同条件下锌解吸规律 7
3.2 载锌沸石对大肠 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
杆菌的抑制、吸附作用 8
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
载锌沸石中锌的解吸规律及其对细菌作用的体外研究
引言
仔猪腹泻是养猪生产中最常见的一种多因素疾病，主要原因是仔猪肠道尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较弱，对外界刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响。哺乳仔猪以传染性腹泻较为常见，而仔猪大肠杆菌性腹泻是最常见的疾病之一[1]。断奶仔猪腹泻通常发生在断奶后的3~10d，发生率在70%~80%，死亡率高[2]，严重影响养猪业的发展。抗生素能很好地控制仔猪腹泻，使仔猪的死亡率减少50%，在疾病和应激问题较为严重的猪场，甚至可减少80%以上[1]。鉴于饲用抗生素等药物的确切作用和显著效果，目前，生产上主要使用抗生素防治仔猪腹泻[3]。但长期大量使用抗生素会引起细菌耐药性、药物残留、食品安全等一系列问题[4]。因此，合理开发和应用抗生素替代品已成为亟待解决的问题。
沸石是由硅氧四面体形成的架状含水硅铝酸盐类矿物[5]，具有比表面积大、选择吸附性强及离子交换性强等特点[6]。在猪日粮中添加沸石，可提高饲料中养分的消化率，还具有增强免疫力，预防疾病的功效[7]。沸石应用于仔猪饲料中可提高体增重和饲料利用率，增加经济效益，显著降低仔猪腹泻率[8]。沸石对霉菌毒素具有良好的吸附和固定作用，可降低霉菌毒素对仔猪的毒害作用[9]；此外，沸石对动物肠道内的有害菌群（如大肠杆菌、痢疾杆菌等）有一定的抑制作用，降低肠道微生物产生的有害物质水平，改善肠道健康状况。
锌作为动物必需微量元素之一，对于仔猪的生长、免疫机能、机体酶的结构和功能有重要作用。在饲料中常用的锌源添加剂包括硫酸锌（ZnSO4）、氧化锌（ZnO）、碱式氯化锌（TBZC）、有机复合锌（如氨基酸螯合锌、蛋白螯合锌等）。日粮中添加适量的氧化锌能提高采食量和饲料转化率，并能有效地预防腹泻[10]。
载锌沸石是利用锌盐和沸石通过离子交换法制得的一种无机抗菌材料。目前制备载锌沸石的方法包括液相和固相离子交换法。研究表明，液相法制备的载锌沸石具有提高肉仔鸡生产性能、调节肠道微生物菌群、改善肠道免疫及抗氧化机能的作用[11]；但液相法制备的载锌沸石存在工艺复杂、锌负载量低等缺陷；而固相法制备的载锌抗菌剂具有工艺简单、锌负载量大等优点，更易应用于实际生产。但固相法与液相法制备的载锌沸石在猪肠道环境中的锌解吸规律及其对细菌吸附作用的比较研究未见报道。为此，本试验通过体外模拟猪肠道环境，研究固相法与液相法制备的载锌沸石中锌的解吸规律及其对细菌的吸附作用，以期为载锌沸石的制备及其在仔猪中的合理应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 主要原料与试剂 天然沸石购自镇江丹徒茅山沸石有限公司，经X射线衍射分析得出主要矿物为斜发沸石，含量大于70%，测得吸铵值为175.56 mmol/100g，大肠杆菌K88 购于国家兽医微生物菌种保藏中心，蛋白试剂盒（BCA）购自南京建成生物工程研究所。
1.2 载锌沸石的制备
1.2.1 固相载锌沸石的制备
参照Magdalena等[12]的方法，沸石在300℃马弗炉中活化3h，取出置于干燥器中冷却后与ZnCl2按质量比1:0.2磨碎混匀，置于马弗炉中450℃加热2.5h，然 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
后用双蒸水洗去未负载的Zn2+。将洗净的载锌沸石于105℃烘干后粉碎备用。
1.2.2 液相载锌沸石的制备
参照Magdalena等[12]的方法，沸石在300℃马弗炉中活化3h，取出置于干燥器中冷却后，按固液体积比1:10加入与ZnCl2溶液（1.0mol/L，pH=4.0）中，在磁力搅拌器上70℃搅拌4h，然后用双蒸水洗去未负载的Zn2+。将洗净的载锌沸石于105℃烘干后粉碎备用。
分别称取0.4g固相、液相载锌沸石置于锥形瓶中，取40mL0.1%HNO3浸泡样品，于65℃恒温水浴锅中浸泡24h后，取上清液稀释一定倍数，采用多通道电感耦合等离子体质谱仪（ICP）测定Zn2+浓度。
1.3 载锌沸石中锌离子解吸规律
用0.01mol/L的Na2HPO4溶液和0.01mol/L的NaH2PO4溶液分别配制pH为4.5、6.0和6.5的缓冲溶液来模拟仔猪胃、十二指肠、空肠的内环境[13]，然后在下列不同条件下分析载锌沸石中锌离子解吸规律
1.3.1 不同载锌沸石浓度条件下锌离子解吸规律
添加载锌沸石于40mL pH值分别为4.5、6.0、6.5的三种缓冲溶液中，使Zn2+浓度分别为20、40、80、120mg/L，每个浓度均设3个重复，37℃恒温振荡120 min，取上清液，测定锌离子浓度。
1.3.2 不同时间条件下锌离子解吸规律
添加载锌沸石于40mL pH值分别为4.5、6.0、6.5的三种缓冲溶液中，使Zn2+浓度为80 mg/L的条件下，每个浓度均设3个重复，37℃恒温振荡，分别在0、30、60、90、120、150min时取出，取上清液，测定锌离子浓度。
1.3.3 不同离子浓度条件下锌离子解吸规律
添加载锌沸石40mL pH值分别为4.5、6.0、6.5的三种缓冲溶液中，使Zn2+浓度为80mg/L的条件下，添加NaCl或NH4Cl使Na+浓度分别为0.05、0.10、0.15mol/L，NH4+浓度分别为0.025、0.050、0.075mol/L，每个浓度均设3个重复，37℃恒温振荡120 min，取上清液，测定锌离子浓度。
摘要：本文通过体外模拟仔猪胃肠道内环境，分析不同条件下载锌沸石中的锌解吸规律及其对大肠细菌K88的作用，并测定其最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果表明，随着添加量的增加，载锌沸石中锌解吸率逐渐降低，并趋向稳定；随着时间延长，锌解吸率逐渐增加并在30min 时达到最大，之后趋向平稳；不同离子对载锌沸石中锌解吸率的提高程度为NH4+＞Na+。随着时间延长，载锌沸石对细菌吸附率先增加后降低，最后趋于稳定，且载锌沸石的吸附能力明显高于活化沸石；随着载锌沸石浓度的增加，细菌吸附率呈现先增加后平稳的趋势，并在5mg/mL时达到最大值。固相载锌沸石的MIC和MBC分别为3.19、7.8125mg/mL，液相载锌沸石的MIC和MBC分别为25、50mg/mL，说明固相载锌沸石的抑菌、杀菌能力明显强于液相载锌沸石。
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关键字:载锌沸石；体外解析；大肠杆菌K88；吸附规律
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摘要 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 主要原料与试剂 2
1.2 载锌沸石的制备 2
1.2.1 固相载锌沸石的制备 2
1.2.2 液相载锌沸石的制备 2
1.3 载锌沸石中锌离子解吸规律 2
1.3.1 不同载锌沸石浓度条件下锌离子解吸规律 2
1.3.2 不同时间条件下锌离子解吸规律 2
1.3.3 不同离子浓度条件下锌离子解吸规律 2
1.4 载锌沸石对大肠杆菌的抑制、吸附作用 2
1.4.1 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC） 3
1.4.2 不同时间载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 3
1.4.3 不同浓度载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 3
2 结果与分析 3
2.1 不同条件下锌离子的解吸规律 3
2.1.1 不同载锌沸石浓度条件下锌离子解吸规律 3
2.1.2 不同时间条件下锌离子解吸规律 4
2.1.3 不同离子浓度条件下锌离子解吸规律 5
2.2 载锌沸石对大肠杆菌的抑制、吸附作用 6
2.2.1 菌量与蛋白质量浓度的关系 6
2.2.2 载锌沸石的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC） 6
2.2.3 不同时间载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 7
2.2.4 不同浓度载锌沸石对大肠杆菌的吸附作用 7
3 讨论 7
3.1 不同条件下锌解吸规律 7
3.2 载锌沸石对大肠 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
杆菌的抑制、吸附作用 8
4 结论 8
致谢 8
参考文献 9
载锌沸石中锌的解吸规律及其对细菌作用的体外研究
引言
仔猪腹泻是养猪生产中最常见的一种多因素疾病，主要原因是仔猪肠道尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较弱，对外界刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响。哺乳仔猪以传染性腹泻较为常见，而仔猪大肠杆菌性腹泻是最常见的疾病之一[1]。断奶仔猪腹泻通常发生在断奶后的3~10d，发生率在70%~80%，死亡率高[2]，严重影响养猪业的发展。抗生素能很好地控制仔猪腹泻，使仔猪的死亡率减少50%，在疾病和应激问题较为严重的猪场，甚至可减少80%以上[1]。鉴于饲用抗生素等药物的确切作用和显著效果，目前，生产上主要使用抗生素防治仔猪腹泻[3]。但长期大量使用抗生素会引起细菌耐药性、药物残留、食品安全等一系列问题[4]。因此，合理开发和应用抗生素替代品已成为亟待解决的问题。
沸石是由硅氧四面体形成的架状含水硅铝酸盐类矿物[5]，具有比表面积大、选择吸附性强及离子交换性强等特点[6]。在猪日粮中添加沸石，可提高饲料中养分的消化率，还具有增强免疫力，预防疾病的功效[7]。沸石应用于仔猪饲料中可提高体增重和饲料利用率，增加经济效益，显著降低仔猪腹泻率[8]。沸石对霉菌毒素具有良好的吸附和固定作用，可降低霉菌毒素对仔猪的毒害作用[9]；此外，沸石对动物肠道内的有害菌群（如大肠杆菌、痢疾杆菌等）有一定的抑制作用，降低肠道微生物产生的有害物质水平，改善肠道健康状况。
锌作为动物必需微量元素之一，对于仔猪的生长、免疫机能、机体酶的结构和功能有重要作用。在饲料中常用的锌源添加剂包括硫酸锌（ZnSO4）、氧化锌（ZnO）、碱式氯化锌（TBZC）、有机复合锌（如氨基酸螯合锌、蛋白螯合锌等）。日粮中添加适量的氧化锌能提高采食量和饲料转化率，并能有效地预防腹泻[10]。
载锌沸石是利用锌盐和沸石通过离子交换法制得的一种无机抗菌材料。目前制备载锌沸石的方法包括液相和固相离子交换法。研究表明，液相法制备的载锌沸石具有提高肉仔鸡生产性能、调节肠道微生物菌群、改善肠道免疫及抗氧化机能的作用[11]；但液相法制备的载锌沸石存在工艺复杂、锌负载量低等缺陷；而固相法制备的载锌抗菌剂具有工艺简单、锌负载量大等优点，更易应用于实际生产。但固相法与液相法制备的载锌沸石在猪肠道环境中的锌解吸规律及其对细菌吸附作用的比较研究未见报道。为此，本试验通过体外模拟猪肠道环境，研究固相法与液相法制备的载锌沸石中锌的解吸规律及其对细菌的吸附作用，以期为载锌沸石的制备及其在仔猪中的合理应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 主要原料与试剂 天然沸石购自镇江丹徒茅山沸石有限公司，经X射线衍射分析得出主要矿物为斜发沸石，含量大于70%，测得吸铵值为175.56 mmol/100g，大肠杆菌K88 购于国家兽医微生物菌种保藏中心，蛋白试剂盒（BCA）购自南京建成生物工程研究所。
1.2 载锌沸石的制备
1.2.1 固相载锌沸石的制备
参照Magdalena等[12]的方法，沸石在300℃马弗炉中活化3h，取出置于干燥器中冷却后与ZnCl2按质量比1:0.2磨碎混匀，置于马弗炉中450℃加热2.5h，然 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
后用双蒸水洗去未负载的Zn2+。将洗净的载锌沸石于105℃烘干后粉碎备用。
1.2.2 液相载锌沸石的制备
参照Magdalena等[12]的方法，沸石在300℃马弗炉中活化3h，取出置于干燥器中冷却后，按固液体积比1:10加入与ZnCl2溶液（1.0mol/L，pH=4.0）中，在磁力搅拌器上70℃搅拌4h，然后用双蒸水洗去未负载的Zn2+。将洗净的载锌沸石于105℃烘干后粉碎备用。
分别称取0.4g固相、液相载锌沸石置于锥形瓶中，取40mL0.1%HNO3浸泡样品，于65℃恒温水浴锅中浸泡24h后，取上清液稀释一定倍数，采用多通道电感耦合等离子体质谱仪（ICP）测定Zn2+浓度。
1.3 载锌沸石中锌离子解吸规律
用0.01mol/L的Na2HPO4溶液和0.01mol/L的NaH2PO4溶液分别配制pH为4.5、6.0和6.5的缓冲溶液来模拟仔猪胃、十二指肠、空肠的内环境[13]，然后在下列不同条件下分析载锌沸石中锌离子解吸规律
1.3.1 不同载锌沸石浓度条件下锌离子解吸规律
添加载锌沸石于40mL pH值分别为4.5、6.0、6.5的三种缓冲溶液中，使Zn2+浓度分别为20、40、80、120mg/L，每个浓度均设3个重复，37℃恒温振荡120 min，取上清液，测定锌离子浓度。
1.3.2 不同时间条件下锌离子解吸规律
添加载锌沸石于40mL pH值分别为4.5、6.0、6.5的三种缓冲溶液中，使Zn2+浓度为80 mg/L的条件下，每个浓度均设3个重复，37℃恒温振荡，分别在0、30、60、90、120、150min时取出，取上清液，测定锌离子浓度。
1.3.3 不同离子浓度条件下锌离子解吸规律
添加载锌沸石40mL pH值分别为4.5、6.0、6.5的三种缓冲溶液中，使Zn2+浓度为80mg/L的条件下，添加NaCl或NH4Cl使Na+浓度分别为0.05、0.10、0.15mol/L，NH4+浓度分别为0.025、0.050、0.075mol/L，每个浓度均设3个重复，37℃恒温振荡120 min，取上清液，测定锌离子浓度。
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