ttp在小鼠卵母细胞成熟中的作用
卵母细胞发育是雌性生殖过程的最重要环节之一。以RNA 代谢为主体的基因表达，特别是mRNA 的合成、储存和降解，是决定卵母细胞质量的关键因素。TTP是参与调控mRNA稳定性的一种锌指蛋白。本实验通过体外敲减TTP的方法发现，TTP的减少没有影响小鼠卵母细胞的GVBD率，而是降低了极体的排出率。免疫荧光染色发现TTP还导致了高频率的纺锤体组装缺陷和染色体排列异常现象的发生，核型分析发现卵子非整倍率也升高，以及受精之后发育至囊胚的能力显著下降。这些都是导致缺失TTP小鼠不孕现象的生殖生物学原因，其分子生物学机制的挖掘，特别是下游mRNA靶标的鉴定，对于剖析TTP介导的生物学事件和相关的机制，以及全面了解卵母细胞发育调控网络和改善卵子质量提供了新的思路和途径。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 抗体和试剂4
1.1.1 实验动物4
1.2方法 4
1.2.1卵母细胞的收集与培养 4
1.2.2 TTP siRNA显微注射4
1.2.3免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测5
1.2.4染色体延展5
1.2.5 数据分析5
2结果5
2.1 TTP敲减影响卵母细胞成熟的进程5
2.2 TTP敲减影响卵母细胞纺锤体组装和染色体排列6
2.3 TTP 敲减导致非整倍型卵母细胞的出现7
2.4 TTP敲减影响卵母细胞的囊胚发育率8
3讨论8
致谢9
参考文献9
TTP在小鼠卵母细胞成熟中的作用
引言
卵母细胞发育是雌性生殖过程的最重要环节之一。在人类，卵母细胞质量低下会导致女性不孕不育、自发流产及出生缺陷等重大生殖疾病。在农业领域，卵母细胞质量也与多精受精及胚胎发育潜能等直接相关，决定了动物繁殖率的高低及由此而产生的畜牧业经济效益。因此，深入研究卵母细胞发育调控的分子机制，对于改善人类生殖健康状况以及提高家畜繁殖力均有重要意义， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
为当前我国经济和社会发展战略的迫切需求。
卵母细胞发育是一个历经形成、生长和成熟的漫长且复杂的过程。卵母细胞形成于胚胎时期的卵巢，在那里卵原细胞进入减数分裂而分化成为卵母细胞。在出生前后，卵母细胞进入并停滞在第一次减数分裂前期的双线期，也称为生发泡期（geiminal vesicle,GV期）。在促黄体素（luteinizing hormone,LH）峰作用下，充分生长的卵母细胞恢复减数分裂，经过核膜消失和生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD），微管开始组装并形成纺锤体，染色体整齐排列在赤道板上，卵母细胞进入第一次减数分裂中期（MI）。伴随着第一极体的排出，卵母细胞到达第二次减数分裂的中期（MII）等待受精，此过程称为核成熟。与此同时，卵母细胞的胞质中也发生着一系列变化（如mRNA、蛋白质及细胞器等的合成和累积等）。其中以RNA代谢为主体的基因表达，特别是mRNA的合成、储存和降解，是决定卵母细胞发育质量的一个关键因素，对于受精及之后的胚胎发育和后代健康至关重要[1]。生长中的卵母细胞具有较强的转录活性，一方面，生长卵母细胞中合成的许多重要母源mRNA被储存下来且相对稳定存在以供其本身及早期胚胎后续发育所需。另一方面，伴随着卵母细胞的成熟，大量mRNA被有规律选择性地降解[2,3]。早期研究发现，充分生长的卵母细胞中有大约总量一半的mRNA在成熟过程中发生脱腺苷化或者降解[4]。上述结果清楚地表明大量mRNA在卵母细胞生长过程中保持稳定和多聚腺苷酸化，而在成熟过程中迅速的脱腺苷并降解。因此，mRNA的转录后调控对于卵母细胞的基因表达模式及功能维持尤为重要。然而到目前为止，人们对于卵母细胞成熟过程中调控mRNA稳定性的关键分子及其相关作用知之甚少。
研究较为清楚的调节转录后控制的顺式元件是AU富集区（AUenrich element, ARE），该序列位于大部分不稳定mRNA的3’端非翻译区（3’UTR）[5]。TTP(Tristetraprolin)又称锌指蛋白36(Zfp36)，以两个串联的CCCH锌指(TZF)结构域为特征，是目前研究最为深入的ARE结合蛋白。它可与mRNA 3’UTR上的ARE相结合，导致poly(A)从mRNA上脱离，进而使整个mRNA降解[6,7]。有文献报道，锌指蛋白Zfp36样蛋白2（Zfp36 like 2，Zfp36l2）突变会影响mRNA的稳定性，并导致早期胚胎发育阻滞及雌性小鼠完全不育[8,9]。尽管TTP在小鼠卵母细胞的各个阶段均有表达[10]，但是，人们对于其在卵母细胞发育成熟过程中的作用及潜在机制却一无所知。
本研究通过体外敲减TTP的方法，结合遗传学和细胞生物学等学科手段，拟对上述设想予以验证。这对深入挖掘卵母细胞中TTP的mRNA靶标、剖析其介导的生物学事件并阐明相关的分子机制，全面了解卵母细胞发育调控网络和改善卵子质量提供新的思路和途径。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 抗体和试剂
兔多克隆抗体antiTristetraprolin（cat.no.ABE285）购自Millipore公司；小鼠单克隆抗体antiɑtubulinFITC购自sigma公司；FITC偶联山羊抗兔二抗IgG购自Thermo Fisher scientific（Rockford，TL，USA）；其它所有化学试剂盒、培养液均购自sigma公司（St.Louis，MO，USA）。
1．1．2 试验动物
本试验选用3～4周ICR雌性小鼠，用于获取GV期卵母细胞。所有试验经大学动物保护与使用委员会批准。
1．2 方法
1．2．1 卵母细胞的收集与培养
从34周ICR雌性小鼠卵巢中取出停留在减数第一次分裂间期的充分生长的GV期卵母细胞，通过反复移液，移除卵母细胞周围的颗粒细胞。将GV期卵母细胞置于M2中，覆盖一层石蜡油，放入37℃含5% CO2的培养箱中培养。培养不同时间以获得不同时期的卵用于免疫荧光染色。
1．2．2 TTP siRNA显微注射
取GV期卵母细胞，将其置于含有2.5mM米力农的M2培养液中，使卵母细胞停滞在GV期，通过显微注射仪向卵母细胞中注射5～10pl 20μM TTP siRNA，对照组注射5～10pl水。培养20h后，用不含米力农的M2清洗三次，再将卵移入M2中，覆盖石蜡油，于37℃含5% CO2的培养箱中培养。培养不同时间以统计减数分裂恢复和成熟情况。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 抗体和试剂4
1.1.1 实验动物4
1.2方法 4
1.2.1卵母细胞的收集与培养 4
1.2.2 TTP siRNA显微注射4
1.2.3免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测5
1.2.4染色体延展5
1.2.5 数据分析5
2结果5
2.1 TTP敲减影响卵母细胞成熟的进程5
2.2 TTP敲减影响卵母细胞纺锤体组装和染色体排列6
2.3 TTP 敲减导致非整倍型卵母细胞的出现7
2.4 TTP敲减影响卵母细胞的囊胚发育率8
3讨论8
致谢9
参考文献9
TTP在小鼠卵母细胞成熟中的作用
引言
卵母细胞发育是雌性生殖过程的最重要环节之一。在人类，卵母细胞质量低下会导致女性不孕不育、自发流产及出生缺陷等重大生殖疾病。在农业领域，卵母细胞质量也与多精受精及胚胎发育潜能等直接相关，决定了动物繁殖率的高低及由此而产生的畜牧业经济效益。因此，深入研究卵母细胞发育调控的分子机制，对于改善人类生殖健康状况以及提高家畜繁殖力均有重要意义， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
为当前我国经济和社会发展战略的迫切需求。
卵母细胞发育是一个历经形成、生长和成熟的漫长且复杂的过程。卵母细胞形成于胚胎时期的卵巢，在那里卵原细胞进入减数分裂而分化成为卵母细胞。在出生前后，卵母细胞进入并停滞在第一次减数分裂前期的双线期，也称为生发泡期（geiminal vesicle,GV期）。在促黄体素（luteinizing hormone,LH）峰作用下，充分生长的卵母细胞恢复减数分裂，经过核膜消失和生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD），微管开始组装并形成纺锤体，染色体整齐排列在赤道板上，卵母细胞进入第一次减数分裂中期（MI）。伴随着第一极体的排出，卵母细胞到达第二次减数分裂的中期（MII）等待受精，此过程称为核成熟。与此同时，卵母细胞的胞质中也发生着一系列变化（如mRNA、蛋白质及细胞器等的合成和累积等）。其中以RNA代谢为主体的基因表达，特别是mRNA的合成、储存和降解，是决定卵母细胞发育质量的一个关键因素，对于受精及之后的胚胎发育和后代健康至关重要[1]。生长中的卵母细胞具有较强的转录活性，一方面，生长卵母细胞中合成的许多重要母源mRNA被储存下来且相对稳定存在以供其本身及早期胚胎后续发育所需。另一方面，伴随着卵母细胞的成熟，大量mRNA被有规律选择性地降解[2,3]。早期研究发现，充分生长的卵母细胞中有大约总量一半的mRNA在成熟过程中发生脱腺苷化或者降解[4]。上述结果清楚地表明大量mRNA在卵母细胞生长过程中保持稳定和多聚腺苷酸化，而在成熟过程中迅速的脱腺苷并降解。因此，mRNA的转录后调控对于卵母细胞的基因表达模式及功能维持尤为重要。然而到目前为止，人们对于卵母细胞成熟过程中调控mRNA稳定性的关键分子及其相关作用知之甚少。
研究较为清楚的调节转录后控制的顺式元件是AU富集区（AUenrich element, ARE），该序列位于大部分不稳定mRNA的3’端非翻译区（3’UTR）[5]。TTP(Tristetraprolin)又称锌指蛋白36(Zfp36)，以两个串联的CCCH锌指(TZF)结构域为特征，是目前研究最为深入的ARE结合蛋白。它可与mRNA 3’UTR上的ARE相结合，导致poly(A)从mRNA上脱离，进而使整个mRNA降解[6,7]。有文献报道，锌指蛋白Zfp36样蛋白2（Zfp36 like 2，Zfp36l2）突变会影响mRNA的稳定性，并导致早期胚胎发育阻滞及雌性小鼠完全不育[8,9]。尽管TTP在小鼠卵母细胞的各个阶段均有表达[10]，但是，人们对于其在卵母细胞发育成熟过程中的作用及潜在机制却一无所知。
本研究通过体外敲减TTP的方法，结合遗传学和细胞生物学等学科手段，拟对上述设想予以验证。这对深入挖掘卵母细胞中TTP的mRNA靶标、剖析其介导的生物学事件并阐明相关的分子机制，全面了解卵母细胞发育调控网络和改善卵子质量提供新的思路和途径。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 抗体和试剂
兔多克隆抗体antiTristetraprolin（cat.no.ABE285）购自Millipore公司；小鼠单克隆抗体antiɑtubulinFITC购自sigma公司；FITC偶联山羊抗兔二抗IgG购自Thermo Fisher scientific（Rockford，TL，USA）；其它所有化学试剂盒、培养液均购自sigma公司（St.Louis，MO，USA）。
1．1．2 试验动物
本试验选用3～4周ICR雌性小鼠，用于获取GV期卵母细胞。所有试验经大学动物保护与使用委员会批准。
1．2 方法
1．2．1 卵母细胞的收集与培养
从34周ICR雌性小鼠卵巢中取出停留在减数第一次分裂间期的充分生长的GV期卵母细胞，通过反复移液，移除卵母细胞周围的颗粒细胞。将GV期卵母细胞置于M2中，覆盖一层石蜡油，放入37℃含5% CO2的培养箱中培养。培养不同时间以获得不同时期的卵用于免疫荧光染色。
1．2．2 TTP siRNA显微注射
取GV期卵母细胞，将其置于含有2.5mM米力农的M2培养液中，使卵母细胞停滞在GV期，通过显微注射仪向卵母细胞中注射5～10pl 20μM TTP siRNA，对照组注射5～10pl水。培养20h后，用不含米力农的M2清洗三次，再将卵移入M2中，覆盖石蜡油，于37℃含5% CO2的培养箱中培养。培养不同时间以统计减数分裂恢复和成熟情况。
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