规模化猪场流行性腹泻病毒的核酸检测
：猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引起全球范围内猪腹泻的重要病原之一，可引起猪腹泻、呕吐及脱水，造成养猪行业的巨大损失。针对安徽各地6个规模化猪场存在腹泻症状的病猪的粪便及肠道组织样本，利用RT-PCR方法进行病毒核酸检测，有50%的猪场样品PCR结果为阳性。对阳性的PCR扩增产物进行基因测序，并与GenBank上PEDV经典株CV777比对，相似度为97%~98%，说明该病毒自首次发现到现在存在变异。此结果可用于监测猪场流行性腹泻病毒的流行情况，为猪场兽医采取相应措施提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1病毒与病料2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器2
1.1.4主要溶液配方2
1.2方法2
1.2.1引物合成2
1.2.2病料的处理2
1.2.3 RNA的提取3
1.2.4普通PCR3
1.2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳3
1.2.6结果判定3
1.2.7基因测序3
2结果与分析4
2.1样品RTPCR检测结果4
2.2猪场PEDV阳性率4
2.3目的基因序列分析4
3讨论5
3.1 PEDV流行情况5
3.2 PEDV变异情况6
3.3 PEDV检测技术6
3.4 PEDV防控6
3.5小结7
致谢7
参考文献7
规模化猪场流行性腹泻病毒的核酸检测
引言
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）属于冠状病毒科（Coronmaviridae）冠状病毒属（Coronabirus），是线性单股正链RNA病毒。基因组大小为28kb，有6个主要的开放阅读框（ORF），主要编码结构蛋白S（spike）、E（envelope）N（nucleocap
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
sid）和M（membrane），其中M基因为PEDV的保守基因，常作为分子生物学检测的靶向基因。猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea, PED）即是由该病毒引起的高度接触性肠道传染病[1]，以水样腹泻、呕吐、脱水及食欲下降为主要特征。PEDV于1971年在英国首次发现，当时主要引起架子猪和育肥猪的急性腹泻，由粪便分离到的PEDV经典毒株命名为“CV777”。1977年有报道的疫病流行，症状与猪传染性胃肠炎（TGE）十分类似，可侵害哺乳仔猪，造成急性腹泻，被称为Ⅱ型，以区别于70年代早期的Ⅰ型。1982年将该病统一命名为“猪流行性腹泻”。近年来，该病在许多国家和地区都曾暴发或流行，可造成巨大影响。各种年龄的猪群均易感，并可在猪群中持续存在，年龄越小，发病率和死亡率越高。冬季多发，夏季也可发生。病猪和带毒猪为主要传染源，传播途径为消化道，运输车、饲养员的鞋和其他带病毒动物均可作为传播媒介。含有PEDV的饲料添加剂血浆蛋白粉（spraydried porcine plasma, SDPP）的使用可造成感染，可能是该病在多个国家间传播并暴发的原因[2]。因此，对该病的有效防控越来越引起人们的重视。目前该病的疫苗保护力都不高，有研究表明通过科学的“返饲”方法能达到有效的控制作用[3]。由于PED在流行病学、临床症状上与猪传染性胃肠炎非常相似，在诊断时需结合实验室诊断技术来进行确诊。许多实验室诊断方法正在发展和应用，病原学检测包括病毒的分离培养、免疫电镜等；血清学检测包括血清中和试验、免疫荧光、ELISA、免疫胶体金技术等；分子生物学检测包括RTPCR、荧光定量PCR、RTLAMP等。本课题利用的RTPCR方法，是现今应用最为广泛的检测病毒核酸的分子生物学检测方法。样品来自安徽各地6个规模化猪场，对有腹泻症状的病猪采粪便或组织样本进行RTPCR检测，并对阳性的PCR扩增产物进行基因测序。由此可监测猪场PED的感染及发病情况，为猪场兽医采取相应措施提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1病毒与病料
PEDV细胞毒由江苏检验检疫局动检实验室保存。174份样本包括各猪场腹泻猪的粪便及病死猪的肠道内容物和肠道组织样本，于2015年9月到12月间分批采集自安徽宣城、池州、和县等6个规模化猪场。
1.1.2主要试剂
琼脂糖、无水乙醇（分析纯）、Trizol试剂、三氯甲醛、异丙醇等试剂均购买自南京生物工程有限公司；电泳过程使用GENEray公司的5×Loading buffer和250 bp1 DNA Ladder；PCR试剂（包括2×buffer, Mix及RNasefree水）使用TaKaRa公司的一步法试剂盒。
1.1.3主要仪器
PCR仪5331型，Eppendorf公司产品；核酸电泳仪，BIORAD公司产品；全自动凝胶成像系统，英国Syngene公司产品；高速离心机，Thermo公司产品；电子分析天平BP211型。
1.1.4主要溶液配方
1）50×TAE（Tris乙酸）：242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 500 mmol/L EDTA （pH8.0），加蒸馏水至1000 mL，4℃保存备用，用时需将其稀释到1×TAE的溶液。
2）1.1~1.2%琼脂糖凝胶：称取1.1~1.2 g琼脂糖溶于100 mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热2 min左右至沸腾，浇注成1.1~1.2%琼脂糖凝胶板。
3）75%酒精：75 mL无水乙醇（分析纯）加入25 mL蒸馏水，4℃保存备用。
1.2方法
1.2.1引物合成
引物选择所在实验室建立的多重PCR检测方法中用于特异性扩增PEDV的一对引物，是根据PEDV 的保守区M基因所设计的[4]。引物序列为M1：5’GTCTAACGGTTCTATTCCC3’，M2：5’TTATAGCCCTCTACAAGC3’，特异性扩增出的目的条带大小为462 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
1.2.2病料的处理
拭子样本：加入尽可能少的无菌生理盐水或10 mmol/L的PBS缓冲液，充分冲洗拭子后，取冲洗液200 μL备用。
粪便样本：用10 mmol/L的PBS缓冲液将粪便样稀释10倍，在涡旋仪上震荡混匀后，于70℃反复冻融3次。12000 r/min离心5 min，取上清液200 μL备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1病毒与病料2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器2
1.1.4主要溶液配方2
1.2方法2
1.2.1引物合成2
1.2.2病料的处理2
1.2.3 RNA的提取3
1.2.4普通PCR3
1.2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳3
1.2.6结果判定3
1.2.7基因测序3
2结果与分析4
2.1样品RTPCR检测结果4
2.2猪场PEDV阳性率4
2.3目的基因序列分析4
3讨论5
3.1 PEDV流行情况5
3.2 PEDV变异情况6
3.3 PEDV检测技术6
3.4 PEDV防控6
3.5小结7
致谢7
参考文献7
规模化猪场流行性腹泻病毒的核酸检测
引言
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）属于冠状病毒科（Coronmaviridae）冠状病毒属（Coronabirus），是线性单股正链RNA病毒。基因组大小为28kb，有6个主要的开放阅读框（ORF），主要编码结构蛋白S（spike）、E（envelope）N（nucleocap
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
sid）和M（membrane），其中M基因为PEDV的保守基因，常作为分子生物学检测的靶向基因。猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea, PED）即是由该病毒引起的高度接触性肠道传染病[1]，以水样腹泻、呕吐、脱水及食欲下降为主要特征。PEDV于1971年在英国首次发现，当时主要引起架子猪和育肥猪的急性腹泻，由粪便分离到的PEDV经典毒株命名为“CV777”。1977年有报道的疫病流行，症状与猪传染性胃肠炎（TGE）十分类似，可侵害哺乳仔猪，造成急性腹泻，被称为Ⅱ型，以区别于70年代早期的Ⅰ型。1982年将该病统一命名为“猪流行性腹泻”。近年来，该病在许多国家和地区都曾暴发或流行，可造成巨大影响。各种年龄的猪群均易感，并可在猪群中持续存在，年龄越小，发病率和死亡率越高。冬季多发，夏季也可发生。病猪和带毒猪为主要传染源，传播途径为消化道，运输车、饲养员的鞋和其他带病毒动物均可作为传播媒介。含有PEDV的饲料添加剂血浆蛋白粉（spraydried porcine plasma, SDPP）的使用可造成感染，可能是该病在多个国家间传播并暴发的原因[2]。因此，对该病的有效防控越来越引起人们的重视。目前该病的疫苗保护力都不高，有研究表明通过科学的“返饲”方法能达到有效的控制作用[3]。由于PED在流行病学、临床症状上与猪传染性胃肠炎非常相似，在诊断时需结合实验室诊断技术来进行确诊。许多实验室诊断方法正在发展和应用，病原学检测包括病毒的分离培养、免疫电镜等；血清学检测包括血清中和试验、免疫荧光、ELISA、免疫胶体金技术等；分子生物学检测包括RTPCR、荧光定量PCR、RTLAMP等。本课题利用的RTPCR方法，是现今应用最为广泛的检测病毒核酸的分子生物学检测方法。样品来自安徽各地6个规模化猪场，对有腹泻症状的病猪采粪便或组织样本进行RTPCR检测，并对阳性的PCR扩增产物进行基因测序。由此可监测猪场PED的感染及发病情况，为猪场兽医采取相应措施提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1病毒与病料
PEDV细胞毒由江苏检验检疫局动检实验室保存。174份样本包括各猪场腹泻猪的粪便及病死猪的肠道内容物和肠道组织样本，于2015年9月到12月间分批采集自安徽宣城、池州、和县等6个规模化猪场。
1.1.2主要试剂
琼脂糖、无水乙醇（分析纯）、Trizol试剂、三氯甲醛、异丙醇等试剂均购买自南京生物工程有限公司；电泳过程使用GENEray公司的5×Loading buffer和250 bp1 DNA Ladder；PCR试剂（包括2×buffer, Mix及RNasefree水）使用TaKaRa公司的一步法试剂盒。
1.1.3主要仪器
PCR仪5331型，Eppendorf公司产品；核酸电泳仪，BIORAD公司产品；全自动凝胶成像系统，英国Syngene公司产品；高速离心机，Thermo公司产品；电子分析天平BP211型。
1.1.4主要溶液配方
1）50×TAE（Tris乙酸）：242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 500 mmol/L EDTA （pH8.0），加蒸馏水至1000 mL，4℃保存备用，用时需将其稀释到1×TAE的溶液。
2）1.1~1.2%琼脂糖凝胶：称取1.1~1.2 g琼脂糖溶于100 mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热2 min左右至沸腾，浇注成1.1~1.2%琼脂糖凝胶板。
3）75%酒精：75 mL无水乙醇（分析纯）加入25 mL蒸馏水，4℃保存备用。
1.2方法
1.2.1引物合成
引物选择所在实验室建立的多重PCR检测方法中用于特异性扩增PEDV的一对引物，是根据PEDV 的保守区M基因所设计的[4]。引物序列为M1：5’GTCTAACGGTTCTATTCCC3’，M2：5’TTATAGCCCTCTACAAGC3’，特异性扩增出的目的条带大小为462 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
1.2.2病料的处理
拭子样本：加入尽可能少的无菌生理盐水或10 mmol/L的PBS缓冲液，充分冲洗拭子后，取冲洗液200 μL备用。
粪便样本：用10 mmol/L的PBS缓冲液将粪便样稀释10倍，在涡旋仪上震荡混匀后，于70℃反复冻融3次。12000 r/min离心5 min，取上清液200 μL备用。
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