猪传染性胃肠炎病毒n蛋白的原核表达及elisa方法的建立与应用
本研究将构建好的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达载体进行诱导，使其表达出目的蛋白，并进行纯化，再以纯化后的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白作为诊断抗原，建立猪传染性胃肠炎病毒的间接ELISA检测方法。通过正交方法，对各组分和步骤进行优化。确定最佳工作条件为以0.106 μg/mL的抗原包被浓度于37 ℃包被2 h，用5%的脱脂乳封闭30 min，待检血清作1:80稀释，于37 ℃反应45 min后，将酶标二抗作1:10000稀释，37 ℃反应30 min后，加入TMP于室温下避光反应15 min。另外，将包被的重组N蛋白与PEDV、PRRSV、和PCV2阳性血清进行血清学实验，无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性；并将阳性血清浓度梯度稀释，稀释度至1:3200检测为阴性，表明该方法具有良好的敏感性；批间变异系数为0.79%~3.22%，批内变异系数为1.09%~2.58%，表明该方法具有良好的稳定性。通过建立的间接ELISA实验对江苏某猪场384个样品进行检测，其中阳性样品为82个，阳性率为21.4%。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.2重组N蛋白的表达 3
1.3重组N蛋白的纯化 3
1.4重组N蛋白Western Blotting鉴定 3
1.5 ELISA相关条件确定实验 4
1.5.1重组Ｎ蛋白抗原最适包被浓度和阴阳性血清的稀释浓度的确定 4
1.5.2封闭液及抗体稀释液的确定 4
1.5.3待检血清反应时间的确定 4
1.5.4酶标二抗最适稀释度与反应时间的确定 4
1.5.5最适显色时间的确定 4
1.5.6阴、阳性临界值的确定 4
1.6敏感性与特异性实验 5
1.6.1敏感性试验 5
1.6.2特异性试验 5
1.7重复性试验 5
1.8临床样本检测 5
2结果 5
2.1重组N蛋白的表达 5
2.2目的蛋白表达形式的鉴定结果 6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.3重组N蛋白纯化后的SDSPAGE 7
2.4重组N蛋白Western Blotting鉴定 7
2.5重组Ｎ蛋白抗原最适包被浓度和阴阳性血清的稀释浓度的确定 8
2.6封闭液及抗体稀释液的确定 8
2.7待检血清反应时间的确定 9
2.8酶标二抗最适稀释度与反应时间的确定 9
2.9最适显色时间的确定 10
2.10阴、阳性临界值的确定 10
2.11特异性试验 10
2.12敏感性试验 11
2.13重复性试验 11
2.14临床样本检测 12
3讨论 12
3.1关于N蛋白的表达 12
3.2关于重组N蛋白的纯化 12
3.3关于重组N蛋白的Western blotting鉴定 12
3.4关于ELISA方法 13
致谢 14
参考文献: 14
猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
与应用
引言
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)所导致的猪的急性，高接触性传染病。各种日龄的猪均可感染，但主要侵害2周以内的幼龄仔猪[1]。其临床主要特征有：呕吐、水样腹泻、脱水[2]。TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属成员[3]。同轮状病毒、猪流行性腹泻病毒一样，是近年来引起我国猪的腹泻病的主要病毒性抗原之一。TGE的快速而且准确的诊断对于该病的防控具有重要的价值和意义，但截至目前为止，我国还没有正式注册的商品化TGE抗原或抗体检测试剂或试剂盒。因此，亟需开展TGEV抗原或抗体检测试剂或试剂盒的研究，进而更好地服务于我国TGE疫情防控工作[4]。酶联免疫吸附试验灵敏度高，重复性好，稳定性高，准确性强，可以针对大量临床样品进行检测，除此之外，该方法操作简便，易于在基层普及，在日常工作中得到广泛应用[5]。
1材料与方法
1.1材料
BL21感受态细胞购自TransGenBiotech，pET28a表达质粒由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存；AGARROSEG10琼脂糖凝胶购自BIOWEST;TGEV阳性血清、TGEV阴性血清、PEDV阳性血清、PRRSV阳性血清PCV2阳性血清由本实验室保存；TMB购自Amersco公司；ELISA板购自Costar公司；Protino NITED 2000 packed columus购自MACHEREYNAGEL公司；羊抗猪IgGHPR购自BETHYL公司；其他试剂使用实验室原材料配制。
1.2重组N蛋白的表达
将PET28aN重组质粒转化至BL21感受态细胞中，并接种到卡那抗性的平板上，37 ℃过夜，挑取单菌落摇床培养至对数生长期，取1 mL菌液保存，向菌液中加入0.1% IPTG，诱导蛋白表达，6 h后，继续取出1 mL诱导后的菌液，再将两次分别取出的菌液低温离心5 min，转速为12000 r/min，弃掉上清液，并用120 μL PBS将沉淀重悬，加入30 μL SDSPAGE电泳缓冲液，煮沸10 min后，进行SDSPAGE电泳分析。
再取4 mL诱导菌，低温离心5 min，转速为12000 r/min，弃掉上清，并用400 μL PBS将沉淀重悬，用超声仪将菌液超声破碎至菌液透明清亮，低温离心10 min，转速为12000 r/min，转移上清至2 mL EP管中，再用 400 μL PBS将沉淀重悬，分别取超声破碎后的上清、沉淀溶液各120 μL，加入30 μL SDSPAGE上样缓冲液，煮沸10 min后，进行SDSPAGE电泳分析。
1.3重组N蛋白的纯化
向蛋白纯化柱中加入5 mL重水，洗涤柱子；再向蛋白纯化住中加入5 mL Binding Buffer以平衡柱子；再加入重组N蛋白；用10 mL Washing Buffer洗脱杂蛋白；最后以5 mL Elution 洗脱目的蛋白，由于柱子不同位置所挂重组N蛋白的量不同，所以将重组N蛋白分装在5个EP管中，每个EP管中分装1 mL。用SDSPAGE分析纯化后的蛋白纯度，然后测定纯化后的蛋白浓度。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.2重组N蛋白的表达 3
1.3重组N蛋白的纯化 3
1.4重组N蛋白Western Blotting鉴定 3
1.5 ELISA相关条件确定实验 4
1.5.1重组Ｎ蛋白抗原最适包被浓度和阴阳性血清的稀释浓度的确定 4
1.5.2封闭液及抗体稀释液的确定 4
1.5.3待检血清反应时间的确定 4
1.5.4酶标二抗最适稀释度与反应时间的确定 4
1.5.5最适显色时间的确定 4
1.5.6阴、阳性临界值的确定 4
1.6敏感性与特异性实验 5
1.6.1敏感性试验 5
1.6.2特异性试验 5
1.7重复性试验 5
1.8临床样本检测 5
2结果 5
2.1重组N蛋白的表达 5
2.2目的蛋白表达形式的鉴定结果 6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.3重组N蛋白纯化后的SDSPAGE 7
2.4重组N蛋白Western Blotting鉴定 7
2.5重组Ｎ蛋白抗原最适包被浓度和阴阳性血清的稀释浓度的确定 8
2.6封闭液及抗体稀释液的确定 8
2.7待检血清反应时间的确定 9
2.8酶标二抗最适稀释度与反应时间的确定 9
2.9最适显色时间的确定 10
2.10阴、阳性临界值的确定 10
2.11特异性试验 10
2.12敏感性试验 11
2.13重复性试验 11
2.14临床样本检测 12
3讨论 12
3.1关于N蛋白的表达 12
3.2关于重组N蛋白的纯化 12
3.3关于重组N蛋白的Western blotting鉴定 12
3.4关于ELISA方法 13
致谢 14
参考文献: 14
猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
与应用
引言
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)所导致的猪的急性，高接触性传染病。各种日龄的猪均可感染，但主要侵害2周以内的幼龄仔猪[1]。其临床主要特征有：呕吐、水样腹泻、脱水[2]。TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属成员[3]。同轮状病毒、猪流行性腹泻病毒一样，是近年来引起我国猪的腹泻病的主要病毒性抗原之一。TGE的快速而且准确的诊断对于该病的防控具有重要的价值和意义，但截至目前为止，我国还没有正式注册的商品化TGE抗原或抗体检测试剂或试剂盒。因此，亟需开展TGEV抗原或抗体检测试剂或试剂盒的研究，进而更好地服务于我国TGE疫情防控工作[4]。酶联免疫吸附试验灵敏度高，重复性好，稳定性高，准确性强，可以针对大量临床样品进行检测，除此之外，该方法操作简便，易于在基层普及，在日常工作中得到广泛应用[5]。
1材料与方法
1.1材料
BL21感受态细胞购自TransGenBiotech，pET28a表达质粒由江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室保存；AGARROSEG10琼脂糖凝胶购自BIOWEST;TGEV阳性血清、TGEV阴性血清、PEDV阳性血清、PRRSV阳性血清PCV2阳性血清由本实验室保存；TMB购自Amersco公司；ELISA板购自Costar公司；Protino NITED 2000 packed columus购自MACHEREYNAGEL公司；羊抗猪IgGHPR购自BETHYL公司；其他试剂使用实验室原材料配制。
1.2重组N蛋白的表达
将PET28aN重组质粒转化至BL21感受态细胞中，并接种到卡那抗性的平板上，37 ℃过夜，挑取单菌落摇床培养至对数生长期，取1 mL菌液保存，向菌液中加入0.1% IPTG，诱导蛋白表达，6 h后，继续取出1 mL诱导后的菌液，再将两次分别取出的菌液低温离心5 min，转速为12000 r/min，弃掉上清液，并用120 μL PBS将沉淀重悬，加入30 μL SDSPAGE电泳缓冲液，煮沸10 min后，进行SDSPAGE电泳分析。
再取4 mL诱导菌，低温离心5 min，转速为12000 r/min，弃掉上清，并用400 μL PBS将沉淀重悬，用超声仪将菌液超声破碎至菌液透明清亮，低温离心10 min，转速为12000 r/min，转移上清至2 mL EP管中，再用 400 μL PBS将沉淀重悬，分别取超声破碎后的上清、沉淀溶液各120 μL，加入30 μL SDSPAGE上样缓冲液，煮沸10 min后，进行SDSPAGE电泳分析。
1.3重组N蛋白的纯化
向蛋白纯化柱中加入5 mL重水，洗涤柱子；再向蛋白纯化住中加入5 mL Binding Buffer以平衡柱子；再加入重组N蛋白；用10 mL Washing Buffer洗脱杂蛋白；最后以5 mL Elution 洗脱目的蛋白，由于柱子不同位置所挂重组N蛋白的量不同，所以将重组N蛋白分装在5个EP管中，每个EP管中分装1 mL。用SDSPAGE分析纯化后的蛋白纯度，然后测定纯化后的蛋白浓度。
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